RAA荧光法检测布鲁氏杆菌的探针及试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测布鲁氏杆菌raa荧光法检测的探针、引物和试剂盒。

背景技术：

布鲁氏杆菌病(brucellosis)简称布病，亦称“地中海热”、“马耳他热”、“波伏热”等，是由一种布鲁氏杆菌(brucella)感染牛、羊、猪等家畜，通过呼吸道、消化道、皮肤及生殖系统等引起的人畜共患高度传染病。

布鲁氏杆菌是一种革兰氏阴性菌，其特点是不运动，几乎无荚膜(光滑型有微荚膜)，嗜氧菌，氧化酶、触酶阳性，可还原硝酸盐，细胞内寄生，能在家畜体内存活。它一共包括六种：牛型布鲁氏杆菌(流产布鲁氏杆菌)、羊型布鲁氏杆菌(马耳他布鲁氏杆菌)、猪布鲁氏杆菌、狗布鲁氏杆菌、林鼠布鲁氏杆菌和绵羊布鲁氏杆菌等。布病主要发病于中东，非洲，拉丁美洲，中亚和地中海周边几个地区，全球布鲁氏杆菌病患者已达50万左右，其疫情日趋严重，从牧区、半牧区传播至农区甚至向城市蔓延的趋势。本菌侵入人体后，随淋巴液到达淋巴结，被吞噬细胞吞噬，如布菌未被吞噬细胞杀灭，则细菌在胞内生长繁殖，形成局部原发病灶。此阶段有人称为淋巴源性迁徙阶段，相当于潜伏期，潜伏期为7-60天，平均两周，少数患者可达数月或1年以上。细菌在吞噬细胞内大量繁殖导致吞噬细胞破裂，随之大量细菌进入淋巴液和血循环形成菌血症。在血液里细菌又被血流中的吞噬细胞吞噬，并随血流带至全身，在肝、脾、淋巴结、骨髓等处的单核—吞噬细胞系统内繁殖，形成多发性病灶，造成临床上不仅有菌血症、败血症，而且还有毒血症的表现。经一定时期后，感染灶的细菌生长繁殖再次入血，导致疾病复发。组织病理损伤广泛。临床表现也就多样化。如此反复成为慢性感染，慢性期多侵及脊柱和大关节，表现为长期发热(包括低热)、多汗、关节痛兼或肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等可疑症状及体征。上个世纪我国经历两次大流行后疫情开始有了下降趋势，但本世纪初，疫情又有回升势头。到2007年初，已有25个省市自治区发现人间和畜间布鲁氏杆菌病。据统计我国受布鲁氏杆菌感染潜在风险的人数达3.5亿，每年新发病例数约3万人。布病是我国近年来发病人数增长迅速的传染病之一。目前《中华人民共和国传染病防治法》已经把布鲁氏杆菌病归类为乙类传染病，与我们更为熟悉的“非典”、“猪流感”、“炭疽”、“艾滋病”、“狂犬病”、“乙肝”等同属一类传染病。

美国疾病控制中心(centerfordiseasecontrol，cdc)因此也认为它可以制成生化武器，并将其定义为“b类生物恐怖主义药剂”。由此可见布病具有巨大潜在威胁人们的身体健康，它是一个严重的公共卫生问题，并引发严重的经济损失和较高的全球健康负担，预防布病传播成为我国和全球共同使命。

目前，布鲁氏杆菌的传统检测技术主要包括病原分离技术、培养特性鉴定技术、血清学检测技术、免疫学学检测技术及分子生物学等技术。

布鲁氏杆菌病病原学检测是从感染的血液或组织中分离培养布鲁氏杆菌，利用固体培养基如血清葡萄糖琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂培养基进行培养，检测原理是通过布鲁氏杆菌的菌体形态、染色特征、菌落形态、生长特性、生化反应特点以及布鲁氏杆菌多克隆抗体凝集试验等方法进行鉴别。此方法法是布鲁氏杆菌病诊断的“金标准”，其成本较低，具有定性和定量分析特点。但同时存在分离率比较低、容易污染、耗时较长等问题，且分离布鲁氏杆菌对环境和工作人员存在生物安全风险，因而限制了该方法的使用。

血清检查是医学上常用的一种检测手段，包括各种凝集反应、补体结合反应、沉淀反应等。

试管凝集反应(sat)是一种经典的血清学凝集反应，它是指颗粒性抗原例如红细胞、细菌等与相应的抗体在适量的电解质存在的条件下，经一定时间后凝聚成肉眼可见的凝集物。sat是我国布病检测的法定实验，其优势是sat检测血清免疫球蛋白m(igm)敏感性较高，操作简便，判定容易，具有较高的诊断价值，但单独使用时特异性较差，且不能区分人工免疫和自然感染。而且部分感染动物的抗体滴度达不到诊断水平，因而也易造成误诊和漏诊。

平板凝集试验(pat)1939年huddleson首先进行了平板凝集试验，因其检测速度较快，在20世纪初，pat是畜间检疫和人群中流行病学快速初筛的一种简易的检测方法。所用抗原是将高浓菌液置于高浓盐水中，用结晶紫和孔雀绿染料染色菌体而制成，与sat实验相比敏感性较高，且特异性较高，但也可出现非特异性凝集。

虎红平板凝集试验是专门用来诊断布鲁氏杆菌病，它是ph3.8±0.2高浓菌液，经标准血清标化并用虎红染料(四氯四碘荧光素钠盐)染色菌体而成。它主要特点是活化igg，此法具有特异性达97.1％和敏感性高达96％，并能去掉血清中非特异性凝集素，结果可靠，方法简便易行，成本低廉，尤其适用于布病的大面积检疫及流行病学调查。但不能鉴别人工免疫和自然感染。

沉淀反应主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。

补体结合试验(cft)：自1909年建立补体结合试验技术以来，得到了广泛应用。其原理是补体能与任何抗原抗体复合物结合，但不能同单独的抗原或抗体结合。试验需两个系统(待检系统和指示系统)及补体，cft法被认为是目前血清学试验中最为准确的技术之一，并得到广泛应用。文献nielsenk.diagnosisofbrucellosisbyserology.[j].veterinarymicrobiology,2002,90(1–4):447-459.报导认为cft需大量不同试剂、大量各种各样对照组，每次试验需要大量的滴定法，结论也具有主观性，而且不能鉴别人工免疫和自然感染，实验条件复杂苛刻，鉴于这些缺点，cft法不利于向基层推广，不宜在现场进行。

近年来,运用于布鲁氏杆菌菌临床检测的免疫学方法主要有:虎红平板凝集试验(rbpt)、试管凝集试验(sat)、补体结合试验(cft)、乳环试验(mrt)、酶联免疫吸附试验(elisa)和胶体金免疫层析法(gica)等。免疫学方法简单易行，但敏感度低，特异性不高。

分子生物学方法具有灵敏度高、特异性强等优点，主要的技术有聚合酶链式反应(简称pcr)和环介导等温扩增技术。

聚合酶链式反应(简称pcr)创立于1985年,目前已成为病原微生物检测的常规技术,具有特异性强、灵敏度高、简便、快速、对标本的纯度要求较低等特点,在pcr方法的基础上,一些新的分子生物学方法随之被运用于布鲁氏杆菌的检测中来。文献hekmatimoghaddams,sadehm,khalilimb,etal.comparisonofpcr,wrightagglutinationtestandbloodculturefordiagnosisofbrucellosisinsuspectedpatients[j].pakistanjournalofbiologicalsciencespjbs,2013,16(22):1589比较了pcr、试管凝集和血培养3种检测方法灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值，pcr比血培养的效能高,其检验结果与试管凝集一致。专利“201610617030.6布鲁氏菌的检测方法、试剂盒及其应用”报导，采用pcr法，用离心柱法从血清标本中获取布鲁氏菌dna，获得待测样本；pcr扩增反应；采用荧光定量pcr仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为taqman荧光探针bkv-fp5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号，最低检出可达到1000copies/ml；这种方法灵敏、特异、检出率高，但该方法对仪器要求及人员的专业素养要求高，且需要一定的硬件支持，检测时间1.5－2小时，对提取的dna纯度要求高。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是由日本学者notomit等人针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换dna聚合酶(bstdnapolymerase)作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟其扩增效率可达到10⁹～10¹⁰个数量级。liuq等报道了使用6条特异性引物检测布鲁氏菌病的lamp方法。此方法设计设计复杂，假阳性出现高。

结合以上分析布鲁氏菌传统的检测方法有较为普遍的病原学检测技术，虽然成本低，但同时具有检测率低、耗时和需要专业技术员操作等不足；免疫学方法具有灵敏度低、在感染初期不易检测出来，存在漏检问题，不便于推广的原因在于实验过程需要动物实验，实验周期长、成本高、操作繁琐；分子生物学检测技术可以满足敏感、特异性的检测需求，但目前技术如pcr技术需要使用复杂的仪器、装备精良的实验室和专业的操作人员，lamp技术虽然不需要昂贵的pcr仪，但需设计多对引物且对靶基因序列要求很高，且假阳性出现高等缺点。

技术实现要素：

为了解决现有技术检测方法中费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器，假阳性率高等问题，本发明实施例提供了一种用于检测布鲁氏杆菌核酸的引物、荧光探针和试剂盒。本发明的试剂盒及检测方法采用raa技术，克服了以上的缺点，具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简单等特点。只需在39℃下反应5～20分钟便可分析结果。具有快速、灵敏、操作简便等特点，对未来预防布鲁氏菌病传播具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。所述技术方案如下：

首先，本发明公开一种raa荧光法检测布鲁氏杆菌的探针，所述探针为：

5’端序列/荧光报告基团//idsp//淬灭基团/3’端序列；其中：

所述5’端序列的核苷酸序列如seqidno.1所示，其序列信息为ctttatgatggcaagggcaaggtggaagat；

所述3’端序列的核苷酸序列如seqidno.2所示，其序列信息为tgcgccttctggcgac。

因此，整个探针序列也可以表示为：5’-ctttatgatggcaagggcaaggtggaagat/荧光报告基团//idsp//淬灭基团/tgcgccttctggcgac-3’。

其中，所述idsp为1个碱基空位；所述荧光报告基团可以选择：fam、hex、tet、joe、vic、rox、cy3或cy5中的任一种，所述淬灭基团可以选择：tamra、eclipse、bhq1、bhq2、bhq3或dabcyl中的任一种。

5’-ctttatgatggcaagggcaaggtggaaga/i6famdt//thf//ibhqdt/gcgccttctggcgac-3’是在本发明的实施例中具体使用的探针，其设计的特征在于：所述荧光探针修饰在探针中间，荧光报告基团修饰在离5'端碱基数30bp的位置上、淬灭基团修饰在离3'端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间空1个碱基位置，用于修饰四氢呋喃残基；

本发明的另一方面，在于公开一种布鲁氏杆菌raa荧光法检测试剂盒，其包括上文所述的探针以及下述引物：

上游引物序列如序列表中seqidno.3所示：

5’-ctcggttgccaatatcaatgcgatcaagtc-3’；

下游引物序列如序列表中seqidno.4所示：

5’-cttgcctttcaggtctgcgaccgatttgatg-3’；

对于上文技术方案所述的一种布鲁氏杆菌raa荧光法检测试剂盒，本发明对探针和引物在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，所述的探针使用时在反应体系中的终浓度为0.02-0.05mm，所述上游引物及下游引物使用时在反应体系中的终浓度为0.05-0.1mm。

对于上文技术方案所述的一种布鲁氏杆菌raa荧光法检测试剂盒，所述试剂盒还包括试剂raa基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。其中：所述的raa基础荧光通用反应试剂是经过低温冷冻干燥的冻干粉，由江苏奇天基因生物科技有限公司提供；是商品货号为f00001的基础反应单元。本领域技术人员，也可以根据raa荧光法检测方法的原理，选择其他能够作为raa基础荧光通用反应试剂的产品作为替换。

对于上文技术方案所述的一种布鲁氏杆菌raa荧光法检测试剂盒，所述的反应缓冲液由以下试剂组成：在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，所述反应缓冲液中各组分的使用浓度为450mm的tris-hclbuffer、260mm的mgac和20％w/v的peg10000。

对于上文技术方案所述的一种布鲁氏杆菌raa荧光法检测试剂盒，所述试剂盒还包括如下试剂：阴性质控品、阳性质控品和/或临界阳性质控品；

所述阳性质控品含为布鲁氏杆菌的基因组dna片段，在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，阳性质控品的使用浓度为1.0×10⁴iu/ml；也可以选择高于此浓度的任意一个浓度作为阳性质控品。

所述临界阳性质控品为含布鲁氏杆菌的基因组dna片段，在此对其在试剂盒中的储存浓度不做限定，为了试验的准确性，一般情况下，临界阳性质控品的使用浓度为1.0×10³iu/ml；

所述阴性质控品为不含有布鲁氏杆菌的基因组片段的试剂，一般选择不含有布鲁氏杆菌的基因组片段的dna质粒。

使用上述试剂盒检测布鲁氏杆菌的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的dna；按正常方法提取dna，可以采用市面上有销售的正品提取试剂盒提取待测样品的dna，如西安天隆、qiagen试剂盒、天根试剂盒等，也可采用自动核酸提取仪进行dna提取；

(2)反应buffer配制：取47μl反应缓冲液，加入2μl探针与引物的混合物，充分混均；将配制好的49μl试剂加入到raa基础荧光通用反应试剂冻干粉中，使其充分溶解并混均；再加入已提取的1μl样品dna为模板，总体积为50μl；

(3)放入检测fam荧光检测仪器中进行实时raa荧光法反应；实时raa荧光法反应条件为：39℃反应20min；

(4)结果分析：

在20min之内fam荧光检测仪器检测到信号明显增加，显示有扩增判定为阳性；在20min之内fam荧光仪器信号无增加，判定为阴性。

附图说明

图1本发明实施例1的检测扩增图。

图2本发明实施例2的检测结果图。

图3本发明实施例3的检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。但本发明的内容并不局限于此。

以下实施例中引物探针及dna质粒均由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成；实施例1

本发明实施例提供一种检测布鲁氏杆菌raa荧光法检测试剂盒及其检测方法，其中，选择布鲁氏杆菌的特异性保守基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(ncbi)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获得布鲁氏杆菌bcsp31基因序列，并进行多序列比对，并从中选出一段保守序列，该序列如序列表中seqidno.6所示：

tggctcggttgccaatatcaatgcgatcaagtcgggcgctctggagtccggctttacgcagtcagacgttgcctattgggcctataacggcaccggcctttatgatggcaagggcaaggtggaagatttgcgccttctggcgacgctttacccggaaacgatccatatcgttgcgcgtaaggatgcaaacatcaaatcggtcgcagacctgaaaggcaagcg；根据以上序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成dna质料，质粒大小222bp；

根据raa技术引物及探针设计原则进行的设计，通过筛选和评价，最终确定的：

上游引物序列5’-ctcggttgccaatatcaatgcgatcaagtc-3’；

下游引物序列5’-cttgcctttcaggtctgcgaccgatttgatg-3’；

探针序列及修饰方法为：

5’-ctttatgatggcaagggcaaggtggaaga/i6famdt//thf//ibhqdt/gcgccttctggcgac-3’，如seqidno.5。

其中，fam为荧光报告基团，bhq为荧光淬灭基团，thf为四氢呋喃残基，修饰方法为fam：6-carboxyfluorescein；thf:tetrahydrofuran；bhq:blackholequencher；phosphate:3’phosphatetoblockelongation。

表1为引物和探针的相关信息表

表2本发明试剂盒组成

将5ul10¹⁰iu/ml布鲁氏杆菌dna质粒制成不同梯度的的工作标准品，分别为：

工作标准品1，含有1.0×10⁷iu/ml布鲁氏杆菌的bcsp31基因的非传染性dna片段。

工作标准品2，含有1.0×10⁶iu/ml布鲁氏杆菌的bcsp31基因的非传染性dna片段。

工作标准品3，含有1.0×10⁵iu/ml布鲁氏杆菌的bcsp31基因的非传染性dna片段。

工作标准品4，含有1.0×10⁴iu/ml布鲁氏杆菌的bcsp31基因的非传染性dna片段。

工作标准品5，含有1.0×10³iu/ml布鲁氏杆菌的bcsp31基因的非传染性dna片段。

工作标准品6，含有1.0×10²iu/ml布鲁氏杆菌的bcsp31基因的非传染性dna片段。

反应buffer配制：按吸取376μl反应缓冲液，加入16μl探针与引物的混合物，充分混均；吸取混均后的缓冲液49μl试剂分别加入到8个raa基础荧光通用反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均；

在8个配制好的管中分别加入1μl阴性质控品、标准工作品6、标准工作品5、标准工作品4、标准工作品3、标准工作品2、标准工作品1为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl；

检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的raa-f1620荧光检测仪；

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。

将混均的反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。

检测结果如附图1所示。结果显示最快2分钟明显有扩增，10分钟内所有标准工作品均有扩增，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

实施例2

引物探针与实施例1相同。

表3为实施例2的试剂盒

样本来源及dna提取

样本由辽宁国际旅行卫生保健中心提供，为猪、羊组织样本中分离的布鲁氏杆菌培养提取的dna，提取好的dna在-80℃保存备用。

反应buffer配制：取三个反应管，分别按如下操作，吸取27μl反应缓冲液，加入2μl探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μl试剂加入到raa基础荧光通用反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均；

在3个配制好的管中分别加入1μl阴性质控品、1μl提取好的猪布鲁氏杆菌样本dna、1μl提取好的羊布鲁氏杆菌样本dna为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl；

检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的raa-f1620荧光检测仪；

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。

将混均的反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。

检测结果如附图2所示。结果显示3分钟明显有扩增，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

实施例3

引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。

表4为实施例3的试剂盒

样本来源及dna提取：

猪布鲁氏杆菌样本dna由辽宁国际旅行卫生保健中心提供，血吸虫样本由江苏省血吸虫病防治研究所提供，为血吸虫虫卵提取的dna；沙门氏菌及大肠杆菌样本由浙江国际旅行保健中心提供，沙门氏菌及金黄色葡萄球菌通过加热90℃10min提取dna，提取好的dna在-80℃保存备用，

反应buffer配制：取5个反应管，分别按如下操作，吸取27μl反应缓冲液，加入2μl探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μl试剂加入到raa基础荧光通用反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均；

在5个配制好的管中分别加入1μl阴性质控品、1μl提取好布鲁氏杆菌样本dna、1μl血吸虫虫卵dna、1μl沙门氏菌样本dna、1μl大肠杆菌样本dna为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μl；

检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的raa-f1620荧光检测仪；

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。

将混均的反应管放入raa-f1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。

检测结果如附图3所示。结果显示只有布鲁氏杆菌样本dna明显有扩增，其他样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性。

重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。实施例三显示本发明的试剂盒特异性好。

以上实施例说明使用本发明的利用raa技术能够快速检测布鲁氏杆菌，操作简便，所用时间大大缩减，不需要大型仪器设备，适用于大规模的筛选。本发明所提供的检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便、迅速，并且对检测材料质量要求低。

以上所述仅为本发明的较佳实施范例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>江苏奇天基因生物科技有限公司

<120>raa荧光法检测布鲁氏杆菌的探针及试剂盒

<130>2015

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctttatgatggcaagggcaaggtggaagat30

<210>2

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgcgccttctggcgac16

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctcggttgccaatatcaatgcgatcaagtc30

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cttgcctttcaggtctgcgaccgatttgatg31

<210>5

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctttatgatggcaagggcaaggtggaagatttgcgccttctggcgac47

<210>6

<211>222

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tggctcggttgccaatatcaatgcgatcaagtcgggcgctctggagtccggctttacgca60

gtcagacgttgcctattgggcctataacggcaccggcctttatgatggcaagggcaaggt120

ggaagatttgcgccttctggcgacgctttacccggaaacgatccatatcgttgcgcgtaa180

ggatgcaaacatcaaatcggtcgcagacctgaaaggcaagcg222