快速鉴定中华鳖遗传性别的PCR扩增引物、方法及试剂盒与流程

本发明属于分子生物学技术领域，涉及中华鳖遗传性别(性染色体型zz/zw)鉴定领域，特别涉及一种能够快速鉴定中华鳖遗传性别的pcr扩增引物、鉴定方法及试剂盒。

背景技术：

中华鳖(trionyxsinensis)是我国名贵水产品，其肉味鲜美、营养丰富、滋补力强，是我国重要的淡水养殖动物，产量位居世界首位。我国中华鳖商业养殖始于20世纪70年代后期，80年代是积累阶段，90年代进入稳定的发展期，目前中华鳖养殖业已形成了大规模、有影响的特种水产养殖产业，其野生鳖市价仍达300元/kg以上，养殖鳖市价也在80～120元/kg。在中华鳖养殖过程中，雄鳖比雌鳖生长快25％～30％，且雄鳖裙边宽厚、脂肪少，具有更高的营养价值，但雄鳖单价比雌鳖单价高20％。因此，若能养殖全雄鳖，可缩短养殖周期，显著提高养殖产量和效益。

中华鳖性染色体型为zz(遗传性别为雄性)/zw(遗传性别为雌性)。由于中华鳖生理性别除受遗传性别(性染色体型)控制外，还受环境因素影响，因此在生产中我们常采用控制环境因素来调控中华鳖雄性比例，提高中华鳖养殖效益。因此中华鳖遗传性别鉴定在中华鳖雄性化育种中是一种十分重要的技术手段。目前，国内外研究人员围绕中华鳖性别分化和控制开展了相关探索，现行研究中对中华鳖遗传性别的鉴定主要利用性染色体z/w形态差异采用组织切片观察鉴定(王伟；钱国英；李彩燕等.2014)和对性染色体z/w基因组差异基因采用荧光原位杂交(badenhorst,d；stanyon,r；engstrom,tet.al.2013)鉴定。这两种技术操作复杂、技术水平要求高、鉴定工作时间长、鉴定成本高。

技术实现要素：

本发明的目的是，针对上述现有技术的不足，提供一种快速鉴定中华鳖遗传性别的pcr扩增引物及方法，同时还提供快速鉴定中华鳖遗传性别的试剂盒。

本发明利用中华鳖性染色体z和性染色体w上的基因dna差异片段长度不同的特点，在差异片段两端设计pcr扩增引物，对个体组织dna样体进行pcr扩增，依据琼脂糖电泳pcr产物的条带差异进行中华鳖遗传性别(zz/zw)鉴定。

具体地，本发明所采用的技术方案是：一种快速鉴定中华鳖遗传性别的pcr扩增引物，该引物序列如下:

正向引物：5’-agggcttggctatgagggaa-3’，见seqidno.1，

反向引物：5’-taaattaggactggaagacacc-3’，见seqidno.2。

本发明同时提供一种快速鉴定中华鳖遗传性别的pcr方法，该方法是以待鉴定的中华鳖dna为模板，利用权利要求1所述的引物进行pcr扩增，扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现973bp(见seqidno.3)大小的条带时，中华鳖个体的遗传性别判定为雌性(即性染色体型为zz)；当扩增产物出现973bp(基因片段序列seqidno.3大小的条带和1533bp(见seqidno.4)大小的条带，则中华鳖个体的遗传性别判定为雄性(即性染色体型为zw)。

上述提及的pcr扩增的反应体系为：2μl中华鳖dna模板、1μl10nmol/l的正向引物、1μl10nmol/l的反向引物、25μl2×easytaqpcrsupermix及21μlh2o。pcr扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒，共32个循环；最后72℃延伸5分钟。

本发明还提供一种快速鉴定中华鳖遗传性别的试剂盒，该试剂盒包括前述提及的如seqidno.1和seqidno.2所示的引物。

本发明确立了用于中华鳖遗传性别鉴定的pcr引物和pcr扩增条件，中华鳖遗传性别鉴定的pcr扩增引物对遗传性别为雌性个体(性染色体型为zz)组织dna扩增产物为973bp大小的扩增基因片段，而对遗传性别为雄性(性染色体型为zw)个体组织dna扩增产物为973bp大小和1533bp大小的两条扩增基因片段，因此可以直接通过脂糖凝胶电泳即可对个体的遗传性别进行鉴定。

本发明是一种快速、简便、低成本的性别鉴定方法，鉴定中不需要昂贵的基因分型仪器，仅需要pcr仪和电泳仪等常规仪器，并且鉴定的时间短、成本低，操作简单、快速、准确等优点，为中华鳖遗传性别标记开发、遗传性别鉴定、性别决定机制研究和人工控制中华鳖性别分化研究提供参考依据，在生产上促进中华鳖性别调控分化应用，加快实现全雄养殖，推进中华鳖产业健康发展。

附图说明

图1是pcr法检测个体性染色体型的电泳图。

图2是中华鳖性染色体z上setd1b基因片段序列。

图3是中华鳖性染色体w上setd1b基因片段序列。

图4是实施例中中华鳖样品的电泳检测图。

上述图2和图3中，带下划线碱基为正向引物位置，下划线加粗碱基为反向引物位置，灰色背影区域碱基为setd1b基因在z/w性染色体上长度差异片段区域。

具体实施方式

1.引物的设计

根据中华鳖性染色体z和性染色体w上的组蛋白赖氨酸n-甲基转移酶(histone-lysinen-methyltransferasesetd1b-like)基因dna差异片段长度不同的特点，利用primer5.0引物设计软件在不同性染色体上基因dna差异片段两侧的保守区域设计pcr用引物(由铂尚生物科技有限公司合成)，引物序列如下：

正向引物：5’-agggcttggctatgagggaa-3’(seqidno.1)，

反向引物：5’-taaattaggactggaagacacc-3’(seqidno.2)。

2.dna提取

采用动物组织基因组dna提取试剂盒(北京全式金基因组dna提取试剂盒：ee101为例，其他动物经组dna提取试剂盒均可)提取中华鳖dna，步骤如下：

(1)取样品中华鳖机体组织20mg放入装有100μllb2(lysisbuffer2)溶液的离心管中，加入20μlproteinasek(20mg/ml)溶液，于55℃放置，直至组织完全溶解，再于样品中加入20μlrnasea，室温孵育2分钟，以12000转/分钟离心5分钟，转移上清于一无菌的离心管中。

(2)加入500μl溶液bb2(bindingbuffer2)，立即涡旋15秒，室温孵育10分钟。

(3)将全部的溶液加入离心柱中，以12000转/分钟离心30秒，弃去流出液。

(4)加入500μl溶液cb2(cleanbuffer2)，以12000转/分钟离心30秒，弃去流出液。

(5)重复(4)。

(6)加入500μl溶液wb2(washbuffer2)，以12000转/分钟离心30秒，弃去流出液。

(7)重复(6)。

(8)12000转/分钟离心2分钟，彻底去除残留的wb2。

(9)将离心柱置于一个干净的离心管中，在柱的中间部位悬空滴加50-200μl60℃-70℃的eb(elutionbuffer)，室温放置1分钟，以12000转/分钟离心1分钟，洗脱dna于离心管中，-20℃保存备用。

3.琼脂糖凝胶电泳检测

称量取0.5g琼脂糖粉加入含50ml1×tbe(tris-硼酸)buffer的锥形瓶，微波炉内反复加热3次至琼脂粉溶解并无气泡，冷至70℃左右加3ul溴化乙锭(eb)核酸染料，混匀，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。30分钟后，琼脂糖凝胶成形，轻轻拔掉梳子。电泳槽内加1×tbe缓冲液，在点样孔内依次加入中华鳖dna提取样品5μl和1000bpmarker5μl，电压设置5-8v/cm，电泳25-30分钟，凝胶成像仪中检测。

10×tbebuffer配制：称量氨基丁三醇108g、na2edta.2h2o7.44g及硼酸55g于1l烧杯中，加入约800ml去离子水，搅拌均匀；用naoh调ph至8.3，加去离子水定容至1l后，即为10×tbebuffer，室温保存，使用时稀释10倍，即为1×tbebuffer。

4.pcr扩增

以前述设计的引物对提取的中华鳖dna采用pcrsupermix试剂进行扩增，反应体系(共50μl)：2μl中华鳖dna模板、1μl正向引物(10nmol/l)、1μl反向引物(10nmol/l)、25μl2×easytaqpcrsupermix、21μlh2o。pcr扩增条件为：95℃预变性5分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃60秒，共33个循环；最后72℃延伸5分钟。

pcr产物采用1％琼脂糖凝胶电泳，电压设置5-8v/cm，电泳25-30分钟，凝胶成像仪中检测目的条带并拍照。

5.遗传性别鉴定

观察凝胶成像仪中检测目的条带，见图1，若只存在长度为973bp大小(其序列如seqidno.3所示，见图2)的条带，则中华鳖个体的遗传性别鉴定为雌性(即性染色体型为zz)；若存长度为973bp大小(其序列如seqidno.3所示，见图2)和长度为1533bp大小(其序列如seqidno.4所示，见图3)的两条带，则中华鳖个体的遗传性别鉴定为雄性(即性染色体型为zw)。

实施例1

以样品性成熟的台湾鳖雌雄各3只、性成熟的日本鳖雌雄各3只、性成熟的黄沙鳖雌雄各3只和性成熟的洞庭鳖雌雄各3只的裙边组织dna为样本，采用动物组织基因组dna提取试剂盒(北京全式金基因组dna提取试剂盒ee101)提取中华鳖裙边组织dna。以前述设计的引物分别对提取的中华鳖裙边组织dna进行pcr扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(见图4)，结果显示，dna样本扩增产物经电泳检测，存在973bp大小的条带，遗传性别鉴定为雌性(即性染色体型为zz)；同时存在973bp大小的条带和1533bp大小的条带，遗传性别鉴定为雄性(即性染色体型为zw)，与前述中华鳖样品记录的性别一致。

序列表

<110>湖南生物机电职业技术学院

湖南农业大学

<120>快速鉴定中华鳖遗传性别的pcr扩增引物、方法及试剂盒

<130>003

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

agggcttggctatgagggaa20

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列()

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<210>3

<211>973

<212>dna

<213>trionyxsinensis(中华鳖)

<400>3

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