一种利用LAMP引物组定量快速检测原料乳中产耐热蛋白酶的荧光假单胞菌方法与流程

本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种原料乳中产耐热蛋白酶的荧光假单胞菌的检测引物组及检测方法。

背景技术：

自十九世纪五十年代低温保存技术的出现，原料乳的冷藏和低温保存成为了保障品质的一个必要的技术环节。乳酸菌和其他嗜温菌引起的原料乳酸化现象大大减少，乳制品的生物学品质也得到了极大的提高。但是，低温条件下的长时间贮藏对于原料乳中微生物种群的结构产生重大影响。在原料乳最初的冷藏阶段，革兰氏阳性嗜温好氧菌占主导地位，随着时间的延长，逐渐被嗜冷菌所取代；尤其是在来自卫生条件差农场的原料乳和含有较多体细胞的原料乳中，这种现象更加显著。冷藏原料乳中嗜冷菌的比例占到总微生物的90％。虽然多数嗜冷菌在原料乳的常规热处理过程中已经死亡，即使尚有残留活菌体也不足以危及乳制品的货架期，但是嗜冷菌能够分泌大量胞外的耐热蛋白酶，这些蛋白酶即使经过高温处理，仍会留有残余。残余的耐热蛋白酶在乳制品储藏的过程中持续分解蛋白质。。蛋白酶主要将κ-酪蛋白水解成副-κ-酪蛋白，使κ-酪蛋白无法发挥稳定蛋白质的性能，导致蛋白质集中，最后蛋白质受到重力逐渐下沉到底部，这个过程中乳清不断排出，出现凝胶。大部分嗜冷菌分泌的胞外蛋白酶能够一定程度上耐受热处理，在140℃下的d值为2～300s。嗜冷菌分泌的耐热蛋白酶在乳中能够较强的复原活性。经过热处理后，未彻底失活的蛋白酶在温度降低阶段中，逐渐再次折叠成有分解能力的原始结构。一旦原料乳中该类酶的数量过多，简单的热处理无法保证乳制品品质。uht乳和奶油等货架期较长的乳制品出现的涩味与耐热蛋白酶水解肽链有关。通常，uht乳的保质期为常温条件下数月，受到耐热蛋白酶的影响较为严重。热处理后残留的蛋白酶活性甚至可使待加工的乳在贮存过程中发生交联，无法用于奶酪等乳制品加工。作为原料乳中最常见的嗜冷菌，检测原料乳中产耐热蛋白酶的p.fluorescens能够衡量原料乳的品质。

目前国际标准的乳品嗜冷菌计数方法为idfstandard101a和idfstandard132a，前者是将原料乳在6.5℃培养10天，然后进行平板计数；后者是将原料乳在21℃培养25h，然后进行平板计数。前者的试验周期太长；后者虽然试验周期短，但是结果并不十分准确。两种方法均不能满足基层在线监测和现场检测的要求。

近年来，不少学者对原料乳中嗜冷菌的检测方法进行了研究，其中包括pcr法和荧光原位杂交法。pcr方法虽然具有较低的检测限，但是容易受到其他乳中微生物的干扰，检测的特异性不强。荧光原位杂交方法的检测用时较长，约6～7h，并且容易受到染料的干扰。这两种检测方法都对操作人员的试验技能有一定要求，而且pcr检测需要大型贵重仪器，限制了检测方法的使用范围，无法应用于现场检测。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)针对靶基因的6个区域设计4条特异的引物，利用一种链置换dna聚合酶(bstdnapolymerase)在恒温条件(65℃左右)孵育几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速的特点。lamp可在1h之内，将靶基因扩增10⁹-10¹⁰倍。在dna不断延伸合成的同时，脱氧核酸三磷酸基质(dntps)析出的焦磷酸离子与反应溶液中的mg2+结合，大量产生一种焦磷酸镁的衍生物，该衍生物可以与显色剂sybrgreeni反应，发生颜色变化，肉眼即可判定检测结果。该方法检测特异性强，检测限低，并且所用仪器设备简单，具有应用于现场检测的潜力。但是在应用于原料乳中产耐热蛋白酶的p.fluorescens的检测方面还未见报道。

技术实现要素：

本发明目的在于设计一套特异性检测荧光假单胞菌所产耐热蛋白酶基因的环介导等温扩增检测引物组，并建立体系，确定反应条件。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的检测引物及其快速检测方法，其具体步骤如下：

1.lamp引物设计：根据荧光假单胞菌的蛋白酶编码基因序列的保守区，用primerexplorerv4设计特异性扩增引物对，引物序列如下：

上游外引物f3：5’-ggccgtgatttcctcagc-3’，(seqidno：1)

下游外引物b3：5’-caggtaagcgaaagccgc-3’，(seqidno：2)

上游内引物fip：

5’-tgggtgaaaccggagaagtccattttgtcaagcgacaaacgtggt-3’，(seqidno：3)

下游内引物bip：

5’-gacgttctttctccgacgtggtttttgttctcgatggtgacgcc-3’，(seqidno：4)

2.lamp检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌体系的建立：

1)基因组dna的提取可采用试剂盒法。

2)原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌蛋白酶基因的lamp扩增

a.在反应管中加入下列成分：英国newenglandbiolabs公司的bst聚合酶(8u/μl)，1.2μl，10×thermopolbuffer，2.5μl，外引物，f3+b3，5μmol/l，1μl；内引物fip+bip，40μmol/l，1μl；模板2μl；dntp，10mm，4μl；mg²⁺，100mm，2μl，灭菌ddh2o，9.3μl，反应体系共25μl；

b.反应管于63℃水浴中温育60min；

c.将水浴温度调至80℃终止反应，5min后取出待检。

扩增时设置阴性对照(ddh2o)。

3)lamp反应的显色检测

在待检的每个反应管中加入1μlsybrgreeni显色剂，直接用肉眼观察颜色变化。在对照反应成立的前提下(即阴性对照反应管中无扩增产物，加入显色剂后，体系颜色呈橙色)；如果反应管中扩增反应液颜色变为绿色，说明待检样品检出产耐热蛋白酶的荧光假单胞菌浓度高于或等于3×10²cfu/ml；如果颜色为橙色，则说明待检样品中产耐热蛋白酶的荧光假单胞菌浓度低于3×10²cfu/ml。

本发明采用上述技术方案所带来的效果在于设计一种检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的引物对和方法。本发明的检测方法速度快，结果准确可靠，操作简单，检测成本低。本发明的检测靶点是通过比较基因组学、生物信息学筛选并经过生物学验证而得到的，具有单一特异性，检测结果可靠，结果判定简单。本发明的检测方法可以用于食品样品的检测。

附图说明

图1为采用原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的lamp检测方法检测原料乳中常见的其他6株常见污染菌的显色反应；图中1-6号反应管中分别是金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌，克罗诺杆菌，单增李斯特菌和福内志贺氏菌；7号反应管为阴性对照，8号反应管为阳性对照。

图2为lamp检测不同浓度产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的显色反应。图中1号反应管为阴性对照的显色结果。2-7号反应管依次为荧光假单胞菌dna模板为3×10⁶-3×10¹cfu/ml的显色结果图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1：原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的特异性检测

1)通过比较基因组和生物信息学分析获得荧光假单胞菌的蛋白酶基因序列中的保守区；

将保守区序列输入到引物设计软件primerexplorerv4中设计引物，引物序列如下(引物由上海生工生物工程有限公司合成)：

f3：5’-ggccgtgatttcctcagc-3’，(seqidno：1)

b3：5’-caggtaagcgaaagccgc-3’，(seqidno：2)

fip：5’-tgggtgaaaccggagaagtccattttgtcaagcgacaaacgtggt-3’，(seqidno：3)

bip：5’-gacgttctttctccgacgtggtttttgttctcgatggtgacgcc-3’，(seqidno：4)

2)将1株分离自原料乳中的产蛋白酶的荧光假单胞菌菌株和6株原料乳中常见的污染菌株接种至lb培养基中复苏18h，按照基因组试剂盒说明书提取基因组。获得的菌株的基因组作为反应模板添加到体系中进行扩增反应。

在反应管中加入英国newenglandbiolabs公司的bst酶(8u/μl)，1.2μl，10×thermopolbuffer，2.5μl，外引物，f3+b3，5μmol/l，1μl；内引物fip+bip，40μmol/l，1μl；模板2μl；dntp，10mm，4μl；mg²⁺，100mm，2μl，灭菌ddh2o，9.3μl，反应体系共25μl。

将反应管放入63℃水浴锅中温育60min。

然后加热水浴锅至80℃持续5min，终止反应。

3)在待检反应管中加入1μl显色剂sybrgreeni，观察反应结果。管1-6均无扩增产物，反应体系显橙色；管7阴性对照没有发生扩增反应，体系显橙色。管8产蛋白酶的荧光假单胞菌发生扩增反应，体系显绿色。

该组引物经在线检测的结果证实，具有很高的特异性，不会与其他物种发生交叉反应。荧光假单胞菌为原料乳中常见菌株，因此在特异性实验中选择原料乳中其他常见菌株大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，福内志贺氏菌，克罗诺杆菌以及单增李斯特菌等进行试验。经验证，除荧光假单胞菌基因组出现阳性扩增，反应液颜色呈绿色外，其他菌株均无扩增，反应液颜色为橙色；与预期相符，表明该组引物有良好的特异性，与上述菌株没有交叉反应。

本实施例中分离自原料乳中产蛋白酶的荧光假单胞菌菌株(pseudomonasfluorescens)rmlwzhang为荧光假单胞菌，属于假单胞菌属；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.14540，保藏日期为2017年8月21日。

实施例2：原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的检测限测定

1)将1株分离自原料乳中产耐热蛋白酶的荧光假单胞菌接入lb中复苏18h，取1ml菌液采用10倍浓度梯度稀释法稀释7个梯度，每个稀释梯度各取3ml按照基因组试剂盒的说明书提取基因组。同时对原始菌液进行平板计数。

2)依实例1中的反应体系和反应条件进行lamp扩增。

3)反应结束后，在lamp反应体系中加入1μl显色剂sybrgreeni，观察反应结果。图2中，反应管2-6(产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的数量分别为3×10²-3×10⁶cfu/ml)显绿色，即阳性反应；反应管7和8(产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的数量降至为3×10¹cfu/ml)显橙色，即阴性反应；说明本发明的检测限为3×10²cfu/ml。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110>中国海洋大学

<120>一种利用lamp引物组定量快速检测原料乳中产耐热蛋白酶的荧光假单胞菌方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggccgtgatttcctcagc18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

caggtaagcgaaagccgc18

<210>3

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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tgggtgaaaccggagaagtccattttgtcaagcgacaaacgtggt45

<210>4

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gacgttctttctccgacgtggtttttgttctcgatggtgacgcc44