内切葡聚糖酶、其编码基因cel5A‑h47及其应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种内切葡聚糖酶、其编码基因cel5a-h47及其应用。

背景技术：

纤维素作为植物细胞壁的主要组成成分，是目前自然界中最丰富的可再生资源，然而其顽固的结构限制了它的利用。纤维素降解成葡萄糖的过程需要内切葡聚糖酶(endoglucanase，ec3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase，e.c.3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，e.c.3.2.1.21)三种纤维素酶的系统同作用。其中，内切葡聚糖酶是纤维素酶系最主要的成分，它主要作用于纤维素的非结晶区，随机水解纤维素链中的β-1,4糖苷键，切断纤维素长链，转化为大量不同聚合度的短链，降低纤维素的聚合度，在降解过程中发挥关键的作用。因此，它的生产利用对于纤维素的降解效率至关重要。目前，该酶已经广泛应用于造纸、纺织、食品、生物燃料、动物饲养等行业中。这些产业上的应用需要生产成本低，具有不同的最适ph和温度，以及较好稳定性的内切葡聚糖酶。过去几十年，大量的研究集中在如何减少真菌生产纤维素酶的成本，主要包括菌的随机诱变、工业优化、外源蛋白添加等方法。然而，由于缺乏对复杂酶系和产酶菌的充分了解，这一进程相当缓慢。因此，寻找大量新型的内切葡聚糖酶尤为重要。

随着组学的出现，一些产木质纤维素酶的微生物基因组测序陆续完成，为进一步的研究提供了清晰的遗传背景，越来越多的纤维素酶基因核苷酸序列得以确定，并在大肠杆菌和酵母中得到了表达，有效地补充了传统的酶系统。而转录组测序能够提供基因cdna序列和基因的表达水平，能够真实反映蛋白在体内的表达情况，因此，从环境微生物转录组信息中发掘内切葡聚糖酶基因是比较新颖，同时也是行之有效的研究方向。

技术实现要素：

本发明提供一种新型的内切葡聚糖酶基因cel5-h47，其原核表达后重组酶cel5-h47为嗜中温酶，50℃下能保持较高的酶活性；最适反应温度为50℃，最适ph为5.0；具有很强的ph耐受性，在ph4.0-10.0下均能保持较高酶活性。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种内切葡聚糖酶，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

一种编码所述内切葡聚糖酶的内切葡聚糖酶基因cel5a-h47，其核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明内切葡聚糖酶基因cel5a-h47来自湖羊瘤胃微生物转录组数据。

一种包含所述内切葡聚糖酶基因cel5a-h47的重组载体。

一种包含所述木聚糖酶基因cel5a-h47的重组菌。

一种制备内切葡聚糖酶的方法，是发酵培养所述的重组菌，得到内切葡聚糖酶。

扩增所述内切葡聚糖酶基因cel5a-h47采用的特异性引物，所述的特异性引物为：h47-f：5’acagcaaatgggtcgcggatccgtgaccatgaattttgttaccgtaag3’，其核苷酸序列如seqidno.3所示；h47-r：5’cttgtcgacggagctcgaattcttatgaagccgctccgtcca3’，其核苷酸序列如seqidno.4所示。

本发明所述内切葡聚糖酶基因cel5a-h47的获取方法如下

a、cel5a-h47内切葡聚糖酶基因的克隆及重组质粒pet-28a/cel5a-h47的构建；

b、重组质粒pet-28a/cel5a-h47在大肠杆菌bl21(de3)中的表达；

c、重组蛋白的诱导、纯化及酶学特性分析；

作为优选，步骤acel5a-h47内切葡聚糖酶基因的克隆及重组质粒pet-28a/cel5a-h47的构建过程具体如下：

①pcr扩增内切葡聚糖酶编码基因cel5a-h47；

②反向pcr扩增制备线性化pet-28a质粒；

③同源重组法构成重组质粒pet-28a/cel5a-h47转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。

本发明所述的内切葡聚糖酶在强碱性环境下的纤维素降解方面的应用，如碱性洗涤剂、纺织业等工业生产。所述的强碱性环境是ph大于7.0。进一步的，所述的强碱性环境是ph7.0-8.0。

本发明具有下列优点和积极效果：

1.本发明中所克隆的基因来自湖羊瘤胃微生物转录组数据，保证基因的新颖性。

2.本发明中选用原核表达系统，具有遗传背景清楚、操作简便和生产周期短等优点。

3.本发明中pcr扩增目的片段时采取的是自行设计的特异性引物，可以有效保证扩增效率和产物特异性。

4.本发明的内切葡聚糖酶在50℃以下具有较强耐受性，能保持较高的酶活性。

5.本发明的内切葡聚糖酶具有较广的ph适应范围，在ph4.0-10.0范围内，均能保持较高活性(在ph4.0-8.0范围内，均能保持80％以上酶活性，在ph9.0-10.0范围内能保持65％以上酶活性)。因此可以用于强碱环境下的纤维素工业降解，如在洗涤剂、纺织等工业，相比传统酸性内切葡聚糖酶处理的纺织品会产生退色现象，本发明中内切葡聚糖酶可以在碱性环境中进行处理，避免此现象发生。

附图说明

图1是cel5a-h47内切葡聚糖酶基因的克隆及表达策略；

图2是克隆cel5a-h47pcr产物；

图3是重组蛋白cel5a-h47的sds-page分析图；

图4是ph对cel5a-h47酶活性的影响；

图5是cel5a-h47酶的ph稳定性；

图6是温度对cel5a-h47酶活性的影响；

图7是cel5a-h47酶的热稳定性。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

一、湖羊瘤胃内容物总rna提取

取-80℃冷冻保存的瘤胃内容物样品提取总rna(以下裂解液rl、吸附柱ra、去蛋白液re、漂洗液rw、rnasefreewater均购自艾德莱生物科技有限公司)在液氮中迅速研磨成粉末，每50～100mg样品加1ml的裂解液rl后匀浆，剧烈震荡混匀以裂解细胞。15-30℃下孵育5分钟使核蛋白体完全分解。12000rpm，4℃离心10min移除不溶物。将上清转移至一个干净的离心管，每1ml裂解液rl加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，12000rpm，4℃离心10min。取上层无色水相转移至新管中，加入水相体积一半的无水乙醇，混匀后加入吸附柱ra中，室温下12000rpm离心45s，弃上清。加入500μl去蛋白液re，室温下12000rpm离心45s，弃上清。加入500μl漂洗液rw，室温下12000rpm离心45s，弃上清。再次加入500μl漂洗液rw，室温下12000rpm离心45s，弃上清。室温下13000rpm离心2min尽量除去漂洗液。将吸附柱ra放入rnasefree离心管中，在吸附膜中间部位加50-80μlrnasefreewater，室温放置2min,12000rpm离心1min，得到总rna，-80℃保存。

二、cel5a-h47基因的克隆

cel5a-h47内切葡聚糖酶基因的克隆及表达策略见图1。

(1)以瘤胃内容物总rna为模板，利用逆转录合成第一链cdna(以下randomprimer、rnasefreewater、5×rtbuffer、dntpmixture、rnaseinhibitor、revertraace均购自东洋坊生物科技有限公司)

①在微量离心管中配制下列混合液：

65℃孵育5min使rna热变性，立即置于冰上。

②配制下列逆转录反应混合液：

③陆续将反应液于30℃孵育10min；42℃孵育20min；99℃孵育5min；4℃孵育5min，然后瞬时离心得到cdna第一链。

(2)cel5a-h47基因扩增

①设计含有pet28a部分载体同源序列的引物和载体反向pcr扩增引物:

h47-f：5’acagcaaatgggtcgcggatccgtgaccatgaattttgttaccgtaag3’,核苷酸序列如seqidno.3所示，

h47-r：5’cttgtcgacggagctcgaattcttatgaagccgctccgtcca3’,核苷酸序列如seqidno.4所示。

②以合成的cdna为模板pcr扩增cel5a-h47基因，扩增体系如下(其中2×hide-fidelitymastermix购自北京擎科新业生物技术有限公司)：

涡旋振荡混匀，稍离心后放入pcr仪中。cel5a-h47基因的扩增条件如下：

pcr结果见图2，扩增得到1098bp的条带，泳道中无其他杂带出现，说明设计引物的特异性良好。

三、重组质粒pet-28a/cel5a-h47的构建

(1)线性化pet-28a载体制备

pcr反向扩增pet-28a载体质粒，制备线性化克隆载体。pcr扩增体系如下：

涡旋振荡混匀，稍离心后放入pcr仪中。线性化pet-28a载体的扩增条件如下：

(2)目的基因与pet-28a载体连接

利用同源重组的原理，通过sosoo重组克隆试剂盒(购自北京擎科新业生物技术有限公司)快速将目的基因定向克隆到线性化pet-28a载体中。反应体系如下：

10μl体系，目的基因与表达载体摩尔比为5:1，50℃反应30min。

四、重组质粒在大肠杆菌中的表达

热激转化取10μl连接产物与大肠杆菌感受态bl21(de3)小心混匀，冰浴30min；42℃水浴热激50s，立即取出冰浴2min；加入500μl37℃预热的soc溶液，150rpm恒温培养1h；吸取转化后的菌液，涂布于含卡那霉素的lb筛选培养基中，37℃恒温培养12-16h；挑取菌斑进行pcr鉴定，确认为阳性的克隆子转接到含卡那霉素的lb液体培养基中扩大培养。

五、阳性菌株的诱导、纯化及酶学特性分析

(1)阳性菌株的诱导

①吸取10μl阳性菌液转接至5ml含卡那霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃，220rpm培养12-16h；

②将5ml菌液转接至200mllb液体培养基中，37℃，220rpm继续培养至od＝0.5-1.0(大约3-4小时)；

③加入2mliptg(终浓度1mmol/l)，20℃，150rpm低温诱导培养6h；

④将诱导表达的菌液转移至50ml离心管中，12000rpm，4℃离心15min，弃掉上清，加入30mlpbs缓冲液(ph7.4)充分重悬菌体；

⑤放入至盛有冰块的烧杯中，超声波反复破碎3次(每次超声15min，工作时间3s，间歇时间5s，6号变幅杆，破碎功率195w)；

⑥破碎菌液12000rpm，4℃离心15min，所得上清为粗蛋白液(cp)，立即使用或4℃保存。

(2)目的蛋白亲和层析

取30ml上步所获得的粗蛋白液，加入ni-nta树脂填料2ml，充分混匀后，将混合液转移到层析柱子，反复上柱收集穿透液(flow-through)，记为ft。

待混合蛋白样液液面接近ni-nta树脂填料时，用40倍柱床体积(40ml)的washingbuffer1(含20mmol/l咪唑)洗涤柱子，除去杂蛋白，用1.5ml离心管收集清洗液，记为w1。

用1倍柱床体积(1ml)的washingbuffer2(含50mmol/l咪唑)洗涤柱子2次，用1.5ml离心管收集清洗液，记为w2，w3。

用1倍柱床体积(1ml)的elutionbuffer(含250mmol/l咪唑)洗脱目的蛋白，洗脱4次，用1.5ml离心管收集洗脱液，记为e1、e2、e3、e4。

将纯化产物进行sds-page分析(图3)，结果显示：重组酶cel5a-h47的蛋白大小量为44kda左右。

(3)酶学特性分析

内切葡聚糖酶活力单位定义：每分钟产生1μmol还原糖的酶量为1个活力单位(u)，计算公式：酶活力

a:产生还原糖的浓度(μmol/ml)

k:纯酶稀释倍数

t:酶解反应时间(min)

c:纯酶蛋白浓度(mg/ml)

ph对酶活性的影响

最适ph:分别采用ph3.0-10.0的缓冲液(其中ph3.0-8.0采用mcilvaine‘s缓冲液，ph8.0-9.0采用tris-hcl缓冲液，ph9.0-10.0采用glycine-naoh缓冲液)配置1％羧甲基纤维素钠(cmc)反应底物，取450μl底物于50℃预热5min，加入50μl酶液，在50℃条件下反应10min，加入500μldns溶液，采用dns法分别测定相对活性。结果显示(图4：重组酶cel5a-h47的最适ph为5.0。

ph稳定性：将内切葡聚糖酶分别在ph3.0-10.0、37℃条件下孵育30min，然后在最适条件下检测酶活。以未处理的内切葡聚糖酶在最适条件下的酶活为对照，计算残余内切葡聚糖酶的相对活性。结果显示(图5)：重组酶cel5a-h47在ph4.0-10.0之间具有较强的ph耐受性，均能保持较高酶活性。

温度对酶活的影响

最适温度：用ph6.0缓冲液配制1％cmc底物，采用dns法分别测定内切葡聚糖酶在30℃-70℃时的酶活，计算相对活性。结果显示(图6)：重组酶cel5a-h47的最适反应温度为50℃。

热稳定性：将内切葡聚糖酶分别置于40、50和60℃条件下分别孵育50min，每隔10min取样在最适条件下测定酶活。以未处理的内切葡聚糖酶在最适条件下的酶活为对照，计算残余内切葡聚糖酶的相对活性。结果显示(图7)：重组酶cel5a-h47为嗜中温酶，在50℃以下能保持较高活性，但温度高于60℃时，酶活性迅速降低。

结论：根据上述实验结论，证明本发明的内切葡聚糖酶具有较好的耐热性和较广的ph耐受范围，在高ph值的特殊环境下仍能保持良好的酶活性(在ph4.0-8.0范围内，均能保持80％以上酶活性，在ph9.0-10.0范围内能保持65％以上酶活性)，有较大的工业化生产和应用潜力，可应用于强碱性环境下的纤维素降解，如碱性洗涤剂、纺织业等工业生产。

以上所述的实施例是本发明挖掘基因和体外制备内切葡聚糖酶方法的较佳方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

序列表

<110>浙江大学

<120>内切葡聚糖酶、其编码基因cel5a-h47及其应用

<130>zjdx-wjk007

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1098

<212>dna

<213>内切葡聚糖酶基因cel5a-h47(endoglucanase)

<400>1

gtgaccatgaattttgttaccgtaagatacagccacaaggatacacaatcacggcaggaa60

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gacggagcggcttcataa1098

<210>2

<211>365

<212>prt

<213>内切葡聚糖酶(endoglucanase)

<400>2

valthrmetasnphevalthrvalargtyrserhislysaspthrgln

151015

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<210>3

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(h47-f)

<400>3

acagcaaatgggtcgcggatccgtgaccatgaattttgttaccgtaag48

<210>4

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(h47-r)

<400>4

cttgtcgacggagctcgaattcttatcttatgaagccgctccgtcca47