OsNPF8.8b基因在提高水稻产量和营养品质中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及osnpf8.8b基因在提高水稻产量和营养品质中的应用。

背景技术：

植物通过吸收土壤中的铵根、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等来获得氮素；氮的吸收和转运主要依靠铵根运输蛋白(amt)、硝酸根运输蛋白(nrt)、氨基酸运输蛋白(aat)、肽运输蛋白(ptr)等运输蛋白来完成(williamsl,millera.transportersresponsiblefortheuptakeandpartitioningofnitrogenoussolutes.annualreviewofplantphysiologyandplantmolecularbiology,2001,52:659-688.)。铵通过植物amt吸收后再通过谷氨酰胺合成酶(gs)和谷氨酸合酶(gogat)合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再进一步形成其它氨基酸(sonoday,ikedaa,saikis,etal.feedbackregulationoftheammoniumtransportergenefamilyamt1byglutamineinrice.plantcellphysiology,2003,44:1396-1402.)。植物可通过高亲和转运系统(hats)的nrt2和低亲和转运系统(lats)的nrt1吸收环境中的硝酸盐，由硝酸还原酶(nr)和亚硝酸还原酶(nir)还原形成铵，再进一步形成氨基酸(paungfoo-lonhiennec,lonhiennetg,rentschd,etal.plantscanuseproteinasanitrogensourcewithoutassistancefromotherorganisms.proceedingsofthenationalacademyofsciences,2008,105:4524-4529.)。

氮运输npf家族包括nrt1和ptr亚家族，不同成员在植株不同部位运输硝酸根、寡肽或氨基酸等，在植株生长发育上起不同的作用(rentschd,schmidts,tegederm.transportersforuptakeandallocationoforganicnitrogencompoundsinplants.febsletters,2007,581:2281-2289.)。osnpf2.2介导了木质部硝酸根的卸载，影响水稻植株生长(liy,ouyangj,wangyy,etal.disruptionofthericenitratetransporterosnpf2.2hindersroot-to-shootnitratetransportandvasculardevelopment.scientificreports,2015,5:9635.)。osnpf7.2对硝酸根有低亲和运输，能够影响植株生长(hur,qiud,cheny,etal.knock-downofatonoplastlocalizedlow-affinitynitratetransporterosnpf7.2affectsricegrowthunderhighnitratesupply.frontiersinplantscience,2016,7.)。

虽然已知氮营养可以促进植物生长发育，但是氮营养影响了植株什么类型的生长发育目前还没有系统的了解。另外水稻npf家族有80多个成员，氮营养是通过npf基因家族什么成员进行响应，在什么部位介导了氮营养运输，从而影响了植株什么类型的生长发育，是否对大米营养品质，及何种品质产生影响，目前也几乎未知。所以，挖掘出npf家族中可能具有氮高效运输基因，特别是能够控制水稻农艺性状的氮运输关键基因，将有利于水稻高产品种的培育。本发明通过长期研究后发现，npf家族osnpf8.8b基因转录后有两种剪接，分别是osnpf8.8a和osnpf8.8b，其中osnpf8.8b对水稻产量和营养品质提高重要的作用，可应用于植物氮利用效率的提高及米质品质的改善，用于高产优质水稻品种的培育。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供osnpf8.8b基因在提高水稻产量和营养品质中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻osnpf8.8b基因为对象，从水稻中花11中克隆了osnpf8.8b的cdna序列。通过构建osnpf8.8b基因的超表达载体，采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到osnpf8.8b基因的超表达植株，超表达植株的分蘖数、有效穗数、灌浆籽粒数和灌浆籽粒干重等与对照野生型中花11相比显著提高，且大米中球蛋白含量也比对照提高。同时构建了osnpf8.8b基因的crispr基因敲除载体，将crispr基因敲除载体导入中花11中，得到osnpf8.8b基因的突变体植株，其分蘖数、有效穗数、灌浆籽粒数和灌浆籽粒干重等与中花11相比显著降低，且大米中球蛋白含量也比对照降低。这些结果表明，通过提高osnpf8.8b基因表达，可以促进水稻产量和营养品质的提高；osnpf8.8b基因在水稻氮利用效率及营养品质改良上有应用价值，可通过分子育种应用于水稻品种改良中。

基于本发明发现的osnpf8.8b基因的功能，其可用于水稻的选育中，以促进水稻产量和营养品质的提高。具体可通过基因工程实现，即提高osnpf8.8b基因的表达，使水稻分蘖数、有效穗数、单株灌浆籽粒数、单株灌浆籽粒干重、大米中球蛋白含量等增加，达到提高水稻氮利用效率、提高水稻产量和改善大米营养品质的目的。

所述的osnpf8.8b基因编码的osnpf8.8b蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示；所述的osnpf8.8b基因的cdna序列优选如seqidno.2所示。

应该理解为，在不影响osnpf8.8b蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对seqidno.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，osnpf8.8b蛋白还包括seqidno.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的优点和效果：

(1)本发明克隆的osnpf8.8b基因提高表达后可以使水稻分蘖、有效穗、单株灌浆籽粒数、单株灌浆籽粒干重增加，说明osnpf8.8b基因对提高水稻产量提高有较明显作用，因此，通过基因工程技术提高osnpf8.8b基因的表达能够提高植物产量。这不仅有助于通过减少氮肥使用培育高产水稻，还可以通过分子育种进行植物的品种改良。

(2)本发明克隆的osnpf8.8b基因提高表达后可以使水稻大米中球蛋白增加，说明osnpf8.8b基因对改善大米营养品质有较明显作用，基因的成功克隆，进一步证实了植物固有的基因对品质的重要作用，对阐明水稻固有基因对大米品质改善上有重要的意义。

(3)尽管目前已克隆到了一些氮营养途径中的基因，但氮营养途径是如何对植物发挥影响的仍不清楚。而本发明克隆的osnpf8.8b基因能够提高水稻产量和品质，对确定植物又高产又优质的关键因素有极大的推动作用。

附图说明

图1是大田种植下对照中花11(wt)、osnpf8.8b基因超表达植株t2代的3个株系(osnpf8.8b-oe)和osnpf8.8b基因突变体植株t2代(osnpf8.8b-c)的整株表型图。

图2是大田种植下对照中花11(wt)、osnpf8.8b基因超表达植株t2代的3个株系(osnpf8.8b-oe)和osnpf8.8b基因突变体植株t2代(osnpf8.8b-c)的分蘖数统计图。数据采用spss软件进行变量分析(anova)，使用duncan’s在0.05、0.01、0.001三个水平上进行差异显著性分析，具有三种水平显著的分别标为*、**、***。

图3是大田种植下对照中花11(wt)、osnpf8.8b基因超表达植株t2代的3个株系(osnpf8.8b-oe)和osnpf8.8b基因突变体植株t2代(osnpf8.8b-c)的有效穗统计图。数据采用spss软件进行变量分析(anova)，使用duncan’s在0.05、0.01、0.001三个水平上进行差异显著性分析，具有三种水平显著的分别标为*、**、***。

图4是大田种植下对照中花11(wt)、osnpf8.8b基因超表达植株t2代的3个株系(osnpf8.8b-oe)和osnpf8.8b基因突变体植株t2代(osnpf8.8b-c)的单株灌浆籽粒数表型图。

图5是大田种植下对照中花11(wt)、osnpf8.8b基因超表达植株t2代的3个株系(osnpf8.8b-oe)和osnpf8.8b基因突变体植株t2代(osnpf8.8b-c)的单株灌浆籽粒数统计图。数据采用spss软件进行变量分析(anova)，使用duncan’s在0.05、0.01、0.001三个水平上进行差异显著性分析，具有三种水平显著的分别标为*、**、***。

图6是大田种植下对照中花11(wt)、osnpf8.8b基因超表达植株t2代的3个株系(osnpf8.8b-oe)和osnpf8.8b基因突变体植株t2代(osnpf8.8b-c)的单株灌浆籽粒干重统计图。数据采用spss软件进行变量分析(anova)，使用duncan’s在0.05、0.01、0.001三个水平上进行差异显著性分析，具有三种水平显著的分别标为*、**、***。

图7是大田种植下对照中花11(wt)、osnpf8.8b基因超表达植株t2代的3个株系(osnpf8.8b-oe)的osnpf8.8b基因表达量的检测结果图。数据采用spss软件进行变量分析(anova)，使用duncan’s在0.05、0.01、0.001三个水平上进行差异显著性分析，具有三种水平显著的分别标为*、**、***。

图8是大田种植下对照中花11(wt)、osnpf8.8b基因超表达植株t2代的3个株系(osnpf8.8b-oe)和osnpf8.8b基因突变体植株t2代(osnpf8.8b-c)大米中球蛋白含量检测结果图。数据采用spss软件进行变量分析(anova)，使用duncan’s在0.05、0.01、0.001三个水平上进行差异显著性分析，具有三种水平显著的分别标为*、**、***。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；maxetal，arobustcrispr/cas9systemforconvenient,high-efficiencymultiplexgenomeeditinginmonocotanddicotplants.molplant.2015,8(8):1274-1284.)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1osnpf8.8b基因超表达植株的构建

提取水稻中花11的rna，并将其反转录成cdna，利用引物对：

f1：5'-agatctatggcaaatgaggagcagcggcag-3'(bglii)，

r1：5'-cttaagtcaagtggtaggcagcttgcgtttg-3'(aflii)；

利用f1和r1引物分别通过pcr扩增osnpf8.8b基因的cdna后，通过bglii和aflii酶切后连入pcambia-1301载体(pcambia-1301载体购自cambia公司)，构建出osnpf8.8b基因的超表达载体osnpf8.8b-p1301。采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将超表达载体分别导入正常水稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，将50株水稻转基因小苗浸泡于500ml蒸馏水制备的浓度为50mg/l的潮霉素溶液48小时，之后叶子为绿色并舒张、生长状态良好的植株为阳性转基因植株；而叶子枯黄并卷曲的植株为阴性植株，随即死亡。阳性植株单株种植并收种，直至t2代鉴定出在上述潮霉素溶液中无任何叶子枯黄并卷曲的为纯合的转基因植株，即得到osnpf8.8b基因的超表达植株。将超表达植株、中花11的种子在培养皿上用蒸馏水浸种3天并培养7天后，转入水稻营养液培养，培养20天，种植于大田，统计分蘖数、有效穗、单株灌浆籽粒数、单株灌浆籽粒干重，结果见图1-6。由图1-6可见在大田培养下，osnpf8.8b基因超表达植株t2代与对照中花11植株相比，分蘖数、有效穗、单株灌浆籽粒数和单株灌浆籽粒干重都比对照增加，三个株系都达到差异显著。检测超表达植株osnpf8.8b基因的表达量，显示osnpf8.8b基因的表达与对照相比得到提高，如图7所示。对大米营养品质测定发现，与对照相比超表达植株大米中的球蛋白含量提高，结果见图8。

实施例2osnpf8.8b基因突变体植株的构建

f2：5'-aggtagtttggcgtcagtaatgg-3'，

f3：5'-actgatccattgcctgtgtatgg-3'。

利用上述靶标序列，构建出osnpf8.8b基因的基因敲除载体osnpf8.8b-c(方法参考maxetal，arobustcrispr/cas9systemforconvenient,high-efficiencymultiplexgenomeeditinginmonocotanddicotplants.molplant.2015,8(8):1274-1284.)。采用农杆菌eha105介导的遗传转化方法，将基因敲除表达载体导入正常粳稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，将50株水稻转基因小苗浸泡于500ml蒸馏水制备的浓度为50mg/l的潮霉素溶液48小时，之后叶子为绿色并舒张、生长状态良好的植株为阳性转基因植株，而叶子枯黄并卷曲的植株为阴性植株，随即死亡。阳性植株在t1代时进行测序，确定基因已经敲除，单株收种并种植，直至t2代得到突变体植株。将突变体植株、中花11的种子在培养皿上用蒸馏水浸种3天并培养7天后，转入水稻营养液培养，培养20天，种植于大田，统计分蘖数、有效穗、单株灌浆籽粒数、单株灌浆籽粒干重，结果见图1-6。由图1-6可见在大田培养下，osnpf8.8b基因突变体植株t2代与对照中花11植株相比，分蘖数、有效穗、单株灌浆籽粒数和单株灌浆籽粒干重都比对照减少，达到差异显著。对大米营养品质测定发现，与对照相比突变体植株大米中的球蛋白含量降低，结果见图8。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>武汉生物工程学院

<120>osnpf8.8b基因在提高水稻产量和营养品质中的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>569

<212>prt

<213>oryzasativa

<400>1

metalaasnglugluglnargglntrpmetaspglyglupheglycys

151015

glnproglugluglyprotyrthrglyasnglyservalaspvallys

202530

glyasnproalaserlysthrhisthrglylystrplysalacystyr

354045

serileleuglyglygluphecysglyalaleualatyrtyralaval

505560

glythrasnleuvalsertyrleuthrlysvalglnglyglnserasn

65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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195200205

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210215220

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245250255

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260265270

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370375380

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385390395400

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465470475480

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