一种高效稳定的细菌总RNA提取方法与流程

本发明设计一种高效稳定的微生物总rna提取方法，属于核酸提取技术领域。

背景技术：

是生物体内重要的遗传物质，rna的提取是分子生物学研究的基础，在进行对于cdna文库构建、体外反转录、实时荧光定量pcr，nothem杂交分析等下游分子生物学实验时都需要质量好的，完整性高的rna。提取高纯度、完整的总rna是对基因进行转录水平操作、研究细菌毒力基因表达与其致病性和环境适应性以及细菌耐药基因和与生物被膜形成相关的基因的基础，是保证pcr反应正常进行的先决条件。

提取的实质就是将细菌的细胞壁破裂后，rna从细胞中释放，再利用一些试剂去除多糖、酚类、蛋白和dna的污染，通过一系列的抽提、洗涤和沉淀，最终得到纯净的rna的过程。

相对于动植物等真核细胞来说，细菌的rna具有含量少，半衰期很短等特点，没有5′帽子结构和3′poly(a)尾巴，在提取过程中很容易降解，因此更难提取出高质量的rna。环境以及操作体系中无处不在的rnase也是导致rna提取效果不佳的重要因素，加之rna本身不稳定，其化学性质比dna活跃得多，其分子上紧邻磷酸二酯键的2′羟基基团能直接被rnase利用来作为活性因子，从而使得rnase无需金属离子就能发挥活性。rnase在酸性、碱性溶液或高温处理仍具有催化活性，在试验操作中很难将其彻底除去，且无处不在，包括破碎细胞内的rnase、实验所用试剂中的rnase、实验人员身上携带的rnase以及实验器材的污染等等，对保持rna样品的完整性构成极大的威胁。此外，破碎细胞内含物常与rna形成难溶的物质(多糖多酚类)，导致rna分离困难。

目前，常见的rna提取方法有强变性剂（异硫氰酸胍、盐酸胍、饱和酚等）法、sds-phenol法、ctab法、热硼酸法和改良热硼酸法主要都是利用研磨法来破碎植物组织等的真核细胞,而关于提取细菌rna所用破碎方法的报道较少。在商品化的今天，国内外生物试剂公司研发出了许多细菌rna提取试剂盒，可以从细菌或者培养细胞中快速提取rna，简化了分子生物学的提取工艺。

有效的细菌细胞裂解是提取高质量及高产量细菌rna必需且重要的第一步。然而许多细菌是很难被破坏的，因为他们是有细胞壁来保护。革兰氏阴性菌，细胞壁成分相对较单一，结构较脆弱，其肽聚糖含量低(占胞壁干重的10～20％)、层数仅1～3层，且交联疏松，易破碎。而对于革兰氏阳性菌，细胞壁较厚(约20～80nm)，肽聚糖含量丰富，有15～50层，约占细胞壁干重的50～80％，化学结构保守固定,三维细胞壁结构交联紧密，细胞难破碎。此外，胞内多糖物质含量高，可以降解核酸，rna提取难度大。细菌总rna提取方法的改进一直是目前分子生物学研究的重点。

对于革兰氏阴性菌而言，很容易被酶或外力所破坏，一般的rna试剂盒都适用，且提取出来的rna纯度和产量均处于理想状态。而对于革兰氏阳性菌，细胞壁坚韧，一般温和的破壁方法很难将其完全破碎，细胞裂解不彻底，提取出的rna纯度低，产量低，rna的提取通常不会取得很好的效果。

目前，国内外提取细胞rna常用细菌细胞壁破碎方法有:酶解法、超声波法、液氮研磨法、剧烈震荡法、玻璃珠法等等。溶菌酶预处理细菌细胞是广泛采用的一种方法，它可使细菌细胞壁水解，但有实验表明某些细菌在溶菌酶37℃作用30分钟后，通过革兰氏染色,显微镜下可见大部分细菌的菌壁仍然完整，说明某些菌株对溶菌酶具有一定抗性。

为获取高质量的不同细菌总rna，前期样品的处理、提取方法及试剂盒的选择尤为重要。此外，必须要指出的是，对于不同的细菌，同一种方法所呈现出的结果往往差异很大。目前发表的提取细菌rna的方法有很多，但多数方法不仅要使用一些有毒的试剂，而且方法费时、复杂、花费较高，且提取效果不佳。因此，为解决以上问题，亟待研发一种高效且广泛适用的细菌总rna提取的方法。

技术实现要素：

一种高效稳定的细菌总rna提取方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

步骤一：将一定量新鲜菌液冰浴后进行离心收集；

步骤二：将步骤一中收集所得细菌细胞进行破碎处理；

步骤三：结合试剂盒进行除杂、洗涤，最后洗脱得纯净的rna。

根据高效稳定的细菌总rna提取方法，其特征在于：所述步骤一具体如下：准备新鲜菌液（细菌数量介于1×107～1×108个细菌）于tissuecell-destroyerds1000配套使用的无菌提取管中，4℃放置，离心后吸弃上清，再次离心，吸弃上清。

根据高效稳定的细菌总rna提取方法，其特征在于：所述步骤二具体如下：将步骤一所得沉淀加入溶菌酶、玻璃珠，涡旋仪涡旋混匀，tissuecell-destroyerds1000处理，其各项参数为：执行项目a。

基于权利3所述的玻璃珠直径可以包括：100μm，106μm，120μm，180μm，200μm，500μm。

基于权利3所述的溶菌酶可以包括：内n-乙酰己糖胺酶，酰胺酶，内肽酶。

基于权利3所述的溶菌酶浓度可以分别：15mg/ml，50mg/ml，80mg/ml，100mg/ml。

基于权利3所述的tissuecell-destroyerds1000，其各项参数可以分别：转速5000rpm、时间30s、间隔10s、次数10；转速5000rpm、时间30s、间隔10s、次数15；转速5000rpm、时间30s、间隔10s、次数20；转速5000rpm、时间30s、间隔10s、次数25；转速5000rpm、时间20s、间隔10s、次数10；转速5000rpm、时间20s、间隔10s、次数15；转速5000rpm、时间20s、间隔10s、次数20；转速5000rpm、时间20s、间隔10s、次数25；转速4000rpm、时间30s、间隔10s、次数10；转速4000rpm、时间30s、间隔10s、次数15；转速4000rpm、时间30s、间隔10s、次数20；转速4000rpm、时间30s、间隔10s、次数25。

根据高效稳定的细菌总rna提取方法，其特征在于：所述步骤三具体如下：步骤二处理后的溶液中加入bufferbrk，剧烈涡旋混匀。离心,洗涤，洗脱rna。

根据高效稳定的细菌总rna提取方法，其特征在于：以上方法具有广泛的适用性，均能达到良好的破壁效果，由其对于革兰氏阳性菌，能显著提高细胞破碎效果，从而提取出高质量的细菌总rna。

附图说明

图1本发明rna提取示意图；

图2本发明单增李斯特氏菌rna提取的实例结果图；

图3本发明金黄色葡萄球菌rna提取的实例结果图；

图4本发明革兰氏阳性菌rna提取与普通方法革兰氏阳性菌rna提取结果对比图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

一种高效稳定的细菌总rna提取方法，所述方法包括如下步骤：

步骤一：将一定量新鲜菌液冰浴后进行离心收集；

步骤二：将步骤一中收集所得细菌细胞进行破碎处理；

步骤三：结合试剂盒进行除杂、洗涤，最后洗脱得纯净的rna。

实施例1：单增李斯特氏菌rna的提取，所述方法具体包括如下步骤：

所述步骤一具体如下：准备无菌的tsb液体培养基，单增李斯特氏菌以1%接种量加入其中，37℃摇菌8h后取出菌液；4℃放置10min；5000×g、离心10min，吸弃上清。

所述步骤二具体如下：200μl15mg/ml溶菌酶、1ml蓝吸头吸取适当玻璃珠粉于提取管中，涡旋仪涡旋混匀，tissuecell-destroyerds1000处理，其各项参数为：执行项目a，转速5000rpm；时间30s；间隔10s；次数15。

所述步骤三具体如下：后续处理所用试剂盒为bacterialrnakitr6950（omega），破碎后的溶液中加入350μlbufferbrk/β-me，剧烈涡旋5min。13000×g离心5min；将400μl上清液转移到新的1.5ml管中。向裂解液中加入400μl70％乙醇，并用移液器混合均匀。将样品加入2ml收集管中的hibind®rna迷你柱。10000×g离心60s。弃收集管液，加入300μlrnawashbufferi。室温10000×g离心60s，弃收集管液。将75μldnasei消化反应混合物直接吸入每个柱中的hibind®rna树脂表面，在室温（25-30℃）孵育20min。将色谱柱置于干净的2ml收集管中，加入500μlrnawashbufferi。室温下10000×g离心60s，弃收集管液。加入500μlrnawashbufferii，室温下以10000×g离心60s，弃废液。再次500μlrnawashbufferii洗涤，室温下以10000×g离心60s，弃废液。ep管换收集管，在室温下以10000×g离心迷你柱2min，以完全干燥hibind®基质。将柱转移到干净的1.5ml微量离心管中，用35μl60℃预热depc水洗脱rna。10,000×g离心1min。进行第二次洗脱收集rna。

实施例2：金黄色葡萄球菌rna的提取，所述方法具体包括如下步骤：

所述步骤一具体如下：准备无菌的tsb液体培养基，金黄色葡萄球菌以3%接种量加入其中，37℃摇菌2h20min后取出菌液；4℃放置10min；5000×g、离心10min，吸弃上清。

所述步骤二具体如下：200μl15mg/ml溶菌酶、1ml蓝洗头吸取适当玻璃珠粉于提取管中，涡旋仪涡旋混匀，tissuecell-destroyerds1000处理，其各项参数为：执行项目a，转速5000rpm；时间30s；间隔10s；次数15。

所述步骤三具体如下：后续处理所用试剂盒为bacterialrnakitr6950（omega），破碎后的溶液中加入350μlbufferbrk/β-me，剧烈涡旋5min。13000×g离心5min；将400μl上清液转移到新的1.5ml管中。向裂解液中加入400μl70％乙醇，并用移液器混合均匀。将样品加入2ml收集管中的hibind®rna迷你柱。10000×g离心60s。弃收集管液，加入300μlrnawashbufferi。室温10000×g离心60s，弃收集管液。将75μldnasei消化反应混合物直接吸入每个柱中的hibind®rna树脂表面，在室温（25-30℃）孵育20min。将色谱柱置于干净的2ml收集管中，加入500μlrnawashbufferi。室温下10000×g离心60s，弃收集管液。加入500μlrnawashbufferii，室温下以10000×g离心60s，弃废液。再次500μlrnawashbufferii洗涤，室温下以10000×g离心60s，弃废液。ep管换收集管，在室温下以10000×g离心迷你柱2min，以完全干燥hibind®基质。将柱转移到干净的1.5ml微量离心管中，用35μl60℃预热depc水洗脱rna。10,000×g离心1min。进行第二次洗脱收集rna。

实施例3：血液样品中肺炎克雷伯氏菌rna的提取，所述方法具体包括如下步骤：

所述步骤一具体如下：5ml一次性注射器吸取2ml血液样品于15ml离心管，加入acklysingbuffer，冰浴30min，每5min上下颠倒混匀。12000rpm/min,离心10min，弃上清。te缓冲液重悬沉淀，涡旋仪涡旋混匀。5000×g，离心10min，弃上清。

所述步骤二具体如下：300μl15mg/ml溶菌酶、1ml蓝吸头吸取适当玻璃珠粉于提取管中，涡旋仪涡旋混匀，tissuecell-destroyerds1000处理，其各项参数为：执行项目a，转速5000rpm；时间30s；间隔10s；次数15。

所述步骤三具体如下：后续处理所用试剂盒为bacterialrnakitr6950（omega），破碎后的溶液中加入350μlbufferbrk/β-me，剧烈涡旋5min。13000×g离心5min；将400μl上清液转移到新的1.5ml管中。向裂解液中加入400μl70％乙醇，并用移液器混合均匀。将样品加入2ml收集管中的hibind®rna迷你柱。10000×g离心60s。弃收集管液，加入300μlrnawashbufferi。室温10000×g离心60s，弃收集管液。将75μldnasei消化反应混合物直接吸入每个柱中的hibind®rna树脂表面，在室温（25-30℃）孵育20min。将色谱柱置于干净的2ml收集管中，加入500μlrnawashbufferi。室温下10000×g离心60s，弃收集管液。加入500μlrnawashbufferii，室温下以10000×g离心60s，弃废液。再次500μlrnawashbufferii洗涤，室温下以10000×g离心60s，弃废液。ep管换收集管，在室温下以10000×g离心迷你柱2min，以完全干燥hibind®基质。将柱转移到干净的1.5ml微量离心管中，用35μl60℃预热depc水洗脱rna。10,000×g离心1min。进行第二次洗脱收集rna。