本发明涉及一种热稳定性提高的d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，属于酶工程技术领域。
背景技术：
d-阿洛酮糖(d-allulose)是稀有糖家族的重要成员，是一种新型的低能量甜味剂。d-阿洛酮糖属于己酮糖，是一种六碳糖，是d-果糖的c-3差向异构体。因具有较高的甜度和较低的能量，d-阿洛酮糖被认为是一种理想的甜味剂和蔗糖的有效替代品。此外，因其独特的生理功能，d-阿洛酮糖在临床医学中具有潜在较大的应用价值，例如治疗肥胖症、糖尿病、高血压、高脂血症和动脉粥样硬化等疾病。此外，d-阿洛酮糖还可以通过添加辅料进行喷雾干燥，这将有助于肺部药物给送。除此外，有文献报道d-阿洛酮糖还是合成其他稀有糖的重要材料，在d-阿卓糖、d-阿洛糖和d-塔洛糖醇的生物生产中起着至关重要的作用。然而，d-阿洛酮糖在自然界中存在量极其稀少，而且化学法合成困难，所以d-阿洛酮糖的生物合成法成为了研究的热点。
根据izumoring稀有糖转化策略，酮糖3-差向异构酶在d-阿洛酮糖生物转化中起着不可替代的作用——催化d-果糖和d-阿洛酮糖在c-3位置发生可逆的差向异构化反应。目前，对于酮糖3-差向异构酶的研究已经较为广泛，包括微生物筛选鉴定、酶的分离纯化、异源重组表达、酶固定化、食品级表达、分子改造和晶体结构解析。
技术实现要素：
本发明的目的是根据已有酮糖3-差向异构酶的晶体结构进行同源建模，分析关键位点氨基酸残基，使用定点突变的方法对doreasp.dpease的进行催化效率和热稳定性改造。选择亚基间内表面的非保守氨基酸残基进行突变，寻找热稳定性提高的突变体，提供一种热稳定性提高的d-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶f154y/e191d/i193f，对d-阿洛酮糖的合成具有重要的现实意义。
本发明提供的热稳定性提高的d-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶f154y/e191d/i193f，是将来源于微生物doreasp.的d-阿洛酮糖3-差向异构酶进行突变得到单突变体酶；具体说，是将原来doreasp.dpease酶中的phe154位的苯丙氨酸突变为络氨酸tyr，glu191位的谷氨酸突变为天冬氨酸asp，ile193位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸phe，获得多点突变体酶，命名为f154y/e191d/i193f。
与野生酶doreasp.dpease相比，所述doreasp.dpease的突变体酶f154y/e191d/i193f的最适ph均没有发生改变，最适温度升高了5℃；相对酶活、动力学参数也没有发生明显变化。热稳定性和结构稳定性得到了提高：50℃和60℃的t1/2值分别达到20.47和3.09h；tm值达到74.18℃。在原始酶的最适催化条件下，酶催化底物d-果糖生成d-阿洛酮糖的相对酶活提高了3.8％，这一发现对于工业化制备d-阿洛酮糖具有重要的研究价值。
本发明还提供一种携带编码所述突变体酶f154y/e191d/i193f的基因的重组表达质粒pet-22b(+)-f154y/e191d/i193f。
本发明还提供一种表达所述突变体酶f154y/e191d/i193f的重组大肠杆菌bl21(de3)，其含有携带编码所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶f154y/e191d/i193f的基因的重组质粒pet-22b(+)-f154y/e191d/i193f。
编码所述来源微生物doreasp.的dpease的基因在genbank的编号为cdd46341.1，基因全长870个核苷酸，见序列表中seqidno:1，编码289个氨基酸，见序列表中seqidno:2。
所述突变体酶f154y/e191d/i193f的氨基酸序列见序列表中seqidno:4，编码该突变体f154y/e191d/i193f的基因的核苷酸序列见seqidno:3。
本发明还提供d-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶的制备方法，其具体步骤为：
(1)在doreasp.dpease酶模拟结构的基础上确定突变位点；
(2)以重组质粒pet22b-dore-dpe为模板，设计正向和反向引物，使用两步法对doreasp.dpease进行定点突变。
突变引物如下所示，下划线为突变点：
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(3)将构建成功的突变体质粒导入表达宿主e.colibl21(de3)，挑选验证后的阳性单克隆进行诱导表达培养；
(4)离心菌体，重悬后超声破碎，镍离子亲和层析纯化得到突变体酶f154y/e191d/i193f。
本发明突变体酶f154y/e191d/i193f的应用：应用于化学、食品和制药领域，催化效率发生显著提升，为进一步工业应用d-阿洛酮糖3-差向异构酶doreasp.dpease提供了有利保障。
本发明的有益效果：本发明提供一种doreasp.dpease的突变体酶f154y/e191d/i193f，热稳定性和结构稳定性得到了提高：50℃和60℃的t1/2值分别达到20.47和3.09h；tm值达到74.18℃。多点突变体的最适温度上升为75℃，与野生型酶相比提高了5℃。在最适催化条件下，酶催化底物d-果糖生成d-阿洛酮糖的相对酶活提高了3.8％
具体实施方式
d-阿洛酮糖3-差向异构酶活测定方法：
以50g/l的d-果糖为底物，加入0.3μmol/l的纯酶，1mmol/lcocl2，在70℃，ph6.0条件下酶反应5min，煮沸10min灭活。反应结束后，将产物离心过膜，稀释到一定浓度后使用hplc检测d-阿洛酮糖的含量。检测条件：waters2695型hplc，waterssugar-paki糖柱，waters示差折光检测器，柱温85℃，流动相超纯水(0.22μm的醋酸纤维滤膜过滤)，流速0.4ml/min。
酶活定义(u)：标准反应条件下，单位时间(min)催化合成1μmold-阿洛酮糖所需的酶量。
实施例1:doreasp.dpease酶突变体制备方法
重组质粒pet22b-dore-dpe构建：根据doreasp.cag:317(登录号：cbgj010000047.1)，合成其d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因片段bn605_00564，并连接至pet-22b(+)的酶切位点ndei和xhoi之间，获得重组质粒pet22b-dore-dpe。
pet-22b(+)-f154y/e191d/i193f突变质粒的构建：以pet22b-dore-dpe质粒为模板，经pcr，引入f154y/e191d/i193f定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒pet-22b(+)-f154y/e191d/i193f构建成功。
突变引物如下所示：(下划线为突变点)
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shortpcr反应过程：95℃预变性2min；95℃解链20s，55℃退火10s，70℃延伸45s，共30个循环；70℃延伸5min；20℃保温。shortpcr反应体系参照表。
表1pcr反应体系(10μl)
shortpcr反应结束后，取2μl的shortpcr产物进行核酸凝胶检测。确认shortpcr成功后，以shortpcr为megaprimer进行longpcr。longpcr反应过程如下：95℃预变性2min；95℃解链20s，55℃退火10s，70℃延伸3min，共30个循环；70℃延伸5min；20℃保温。longpcr反应体系参照表。
表2pcr反应体系(25μl)
longpcr反应结束后，取2μl的longpcr产物进行核酸凝胶检测。确认longpcr成功后，加入2μldpni、6μlnebcut-smartbuffer和2μl水，进行dpni酶切反应，37℃保温2h。酶切反应结束后，使用pcr快速纯化试剂盒进行产物纯化。最后将5μl纯化后的pcr产物转化至e.colidh5α感受态细胞。然后挑取阳性克隆子进行质粒抽提和dna测序。将测序成功的突变体质粒导入e.colibl21(de3)感受态细胞，构建突变体基因重组菌，用于突变体酶的诱导表达。
实施例2:doreasp.dpease的突变体酶的表达纯化方法。
将测序验证后的突变质粒pet-22b(+)-f154y/e191d/i193f转化至大肠杆菌bl21(de3)细胞，挑取阳性转化子在lb培养基中37℃、200rpm摇培过夜，后接入lb培养基37℃培养3-4h至od值为0.6～0.8，降温至30℃，加入iptg终浓度为0.6mm诱导6h。
发酵液于4℃、l0000rpm离心20min，取菌体。加入20ml缓冲液(50mmpbs，200mmnacl，调节ph至6.0)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间ls，停止时间2s，共计18min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000rpm离心30min，得粗酶液。用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用低盐浓度的缓冲液(500mmol/lnacl，50mmpbs调节ph至6.0)平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液ph值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用含有低浓度咪唑的缓冲液(500mmol/lnacl，50mmol/l咪唑，50mmpbs调节ph至6.0)冲洗杂蛋白至基线平衡，再用含有高浓度咪唑的洗脱液(500mmol/lnacl，500mmol/l咪唑，50mmpbs调节ph至6.0)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，并测定其酶活，获得目的蛋白。纯化后d-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶f154y/e191d/i193f达到电泳纯。
实施例3：突变前后酶的热稳定性比较
本发明研究突变体f154y/e191d/i193f的热稳定性和结构稳定性，突变体的热稳定性(t1/2)和结构稳定性(tm)均得到大幅度改善。50℃时，突变体f154y/e191d/i193f的半衰期(t1/2)由野生型酶的3.20h分别增加到20.47h；60℃时t1/2值由野生型酶的0.6h分别增加到3.09h；tm值由野生型酶的56.64℃上升到74.18℃。doreasp.dpease的突变体f154y/e191d/i193f热稳定性和结构稳定性得到显著提高，更加适用于工业化生产的要求。
实施例4：doreasp.dpease的突变体酶的催化效率测定。
本发明参照d-阿洛酮糖3-差向异构酶活测定方法，将突变体纯酶在标准反条件下进行催化反应，使用hplc检测突变体酶活。将野生型doreasp.dpease的酶活定义为相对酶活100％。发现，突变体f154y/e191d/i193f比酶活为834.0u/mg，相较于原始酶比酶活803.5u/mg，相对酶活则提高了3.8％。
表3最适反应条件下野生酶和突变体酶的相对酶活比较
表4野生酶和突变体酶的反应动力学常数
实施例5：突变前后酶的最适ph比较
本发明研究ph对热稳定性改造后突变体酶的催化活性以及稳定性的影响。doreasp.dpease野生型酶突变为多点突变体f154y/e191d/i193f后，最适ph并没有发生变化，最适ph为6.0。在ph5.5-7.0的弱酸性范围内，突变体酶的催化活性较高，相对酶活高于75％。比较突变体酶的ph稳定性，可以发现突变体酶的ph稳定性与原始酶相一致，没有发生十分明显的变化。
实施例6：突变前后酶的最适温度比较
本发明研究温度对突变体酶催化活性的影响，分别在ph6.0不同温度(40-80℃)下进行酶反应，多点突变体f154y/e191d/i193f的最适温度上升为75℃，与野生型酶相比提高了5℃。同时，突变体在75和80℃高温条件下的相对酶活也有一定程度的提高。
表5野生酶和突变体酶的t1/2和tm值比较
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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