一种催化效率提高的L-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法与流程

文档序号:14435546阅读:341来源:国知局

本发明涉及一种催化效率提高的l-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法,属于基因工程技术领域。



背景技术:

nadh依赖型l-乳酸脱氢酶(l-lactatedehydrogenase,l-ldh)能够不对称还原α-酮酸生成手性α-羟基酸,其广泛应用于生物制药、材料和食品等行业。例如l-苯乳酸(l-phenyllacticacid)是一种天然抑菌剂,也可由l-ldh不对称还原苯丙酮酸(phenylpyruvicacid,ppa)催化生成,可以替代食品添加剂和动物饲料中的抑菌剂,也可以作为合成多种药物的前体,还可以作为一种潜在的聚乳酸替代物,合成聚苯乳酸新型高分子材料。

一些化学和生物方法可用于合成手性α-羟基酸,但与化学法相比,生物酶法由于其条件温和,环境友好,生成产物纯度高等优点,已成为主要合成方法。但现已发现的大多数野生型l/d-ldh对带有长脂肪链或芳香基团侧链的底物(苯甲酰甲酸,ppa,草酰乙酸等)表现出较低的活性,在一定程度上限制了l/d-ldh的广泛应用。随着人们对l/d-ldh的结构、功能和作用机理的认识不断深入,采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的l/d-ldh的研究得到了迅速发展。jiang等采用定点突变方法将pseudomonasstutzerisdml-ldh中的val108替换为ala,获得一个新突变酶,该突变酶对l-扁桃酸的催化效率(kcat/km)较野生型酶提高了50.1倍。zheng等在l.bulgaricusatcc11842d-ldh的基础上,将其52位点的tyr突变为leu,使得突变酶对ppa的活性显著提高。aslan等对geobacillusstearothermophilus的l-ldh(bsldh)实施了定点饱和突变,从突变文库中,获得了一个最优突变体1g7(d101y102),其催化ppa的活性明显高于bsldh。

本发明采用单点突变技术,基于同源建模方法,通过突变特定氨基酸优化l-乳酸脱氢酶分子结构、提高其催化活性。



技术实现要素:

本发明要解决的技术问题是提供一种催化活性提高的l-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法。

本发明提供一种催化活性提高的l-乳酸脱氢酶突变体,其特征在于,所述突变体的氨基酸序列是seqidno.1所示的序列。

所述突变体的核苷酸序列是seqidno.3所示的序列。

所述突变体是在如序列seqidno.2所示的氨基酸的基础上,将第229位的异亮氨酸突变成了丙氨酸(i229a)。

所述编码seqidno.2所示氨基酸序列的核苷酸序列是seqidno.4所示的序列。

本发明还提供一种表达所述l-乳酸脱氢酶突变体的基因工程菌。

所述基因工程菌的制备方法,是以携带编码l-乳酸脱氢酶基因的重组质粒为模板,设计并合成引物,通过pcr进行定点突变,得到携带编码突变体基因的重组质粒,将重组质粒转化到大肠杆菌bl21中即得到重组大肠杆菌基因工程菌。

所述表达载体是以下任意一种:pet-22b(+)、pet-28a(+)、pet-32a(+)、pet-41a(+)。

所述表达载体,在本发明的一种实施方式中是pet-22b(+)。

所述大肠杆菌宿主菌是以下任意一种:e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、或e.colitop10。

所述大肠杆菌宿主菌,在本发明的一种实施方式中是e.colibl21。

所述的制备方法,具体是:

(1)以携带序列如seqidno.4所示lcldh基因的重组质粒pet-22b(+)-lcldh为模板,序列如seqidno.5所示的f1primer、序列如seqidno.6所示的r1primer为引物,进行突变pcr,即得到编码的第229位氨基酸由异亮氨酸突变成了丙氨酸的重组质粒pet-22b(+)-lcldhi229a

(2)将上一步得到的重组质粒转化至e.colibl21(de3),获得重组大肠杆菌基因工程菌lcldhbl21。

本发明的有益效果:本发明在l-乳酸脱氢酶基础上,通过定点突变生物技术改造l-乳酸脱氢酶分子结构,得到一株l-乳酸脱氢酶大肠杆菌工程菌,突变酶比酶活提高6.1倍,催化活性提高4.2倍。本发明解决了l-乳酸脱氢酶催化活性低的限制性问题,为l-乳酸脱氢酶分子改造提供了一条新的思路。

附图说明:

图1为重组乳酸脱氢酶lcldhi229a的sds-page图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例详细说明,其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

l-乳酸脱氢酶酶活测定方法:

总反应体系包括50mmol/l乙酸钠缓冲液(ph5.5),0.2mmol/lnadh,5mmol/lppa,对照组中不含nadh,其他成分相同。混匀后于35℃保温5min,加入适量的酶液。检测nadh在340nm处吸收值的变化。酶活性单位(u)定义为:在上述条件下,每分钟催化氧化1μmolnadh所需要的酶量。比活性定义为每毫克酶蛋白所含的酶活单位数(u/mg)。

实施例1:突变酶基因及其表达质粒的构建

将扩增得到的核苷酸序列如seqidno.4所示的基因lcldh,扩增产物与pucm-t连接,转化e.colijm109,经蓝白斑筛选、菌液pcr验证和dna测序。将测序正确的重组质粒命名为pucm-t-lcldh。用ndeⅰ和xhoⅰ双酶切pucm-t-lcldh,回收lcldh,与经同样双酶切的pet-28a(+)连接,获重组质粒pet-28a(+)-lcldh。

以pet-28a(+)-lcldh重组质粒为模板,以f1primer(序列如seqidno.5所示)、r1primer(序列如seqidno.6所示)为引物,通过pcr进行定点突变,得到携带编码突变体基因的重组质粒,命名为pet-22b(+)-lcldhi229a

实施例2:产l-乳酸脱氢酶大肠杆菌工程菌构建

将实施例1得到的重组质粒pet-22b(+)-lcldhi229a转化e.colibl21感受态细胞,具体方法如下:

1)接种lb平板活化的e.colibl21于2mllb培养基中,37℃,220r/min过夜培养;2%接种上述培养液于5mllb培养基中,37℃,220r/min培养4h;

2)取上述菌液1.4ml放入1.5mlep管中,冰浴10min,4000r/min离心2min,收集菌体;

3)加入1ml预冷的0.1mcacl2溶液重悬上述细胞,冰浴10min,4000r/min,离心2min,收集菌体;

4)加入100μl预冷的0.1mcacl2溶液悬浮上述细胞,4℃保存30min即可转化;

5)取100μl感受态细胞于冰上完全解冻后,轻轻将细胞均匀悬浮,加入5μl连接液,轻轻混匀,冰上放置30min;

6)42℃水浴热激90s,冰浴15-20min;

7)加入400μllb培养基,37℃,220r/min振荡培养1h;

8)室温下4000r/min离心5min,去掉450μl上清液,将剩余菌液吹打混匀后,涂布于kan板上;

8)挑取上述平板中白色菌落,进行菌液pcr验证,验证正确的重组菌送至测序公司测序,命名测序正确的重组菌为lcldhbl21。

实施例3:重组大肠杆菌诱导表达

将实施例2构建的重组菌lcldhbl21在lb平板上活化,挑取单菌落至2mllb培养基中,37℃、220r/min培养12h,按2%接种量接种至100ml/500mllb培养基中,37℃,220r/min培养2h后加iptg至终浓度0.4mm,20℃诱导表达8h,8000r/min离心5min收集菌体,超声破碎后得到粗酶液,将粗酶液用镍柱纯化,具体方法如下:

1)用超纯水洗柱3次以上;

2)用新配制的结合液洗柱3次;

3)上样:用水膜过滤发酵液,若量多,可反复过柱;上样量<=8ml,一般4ml左右;用盖子将下方漏孔堵住,4℃结合30min或者过夜,收集流出液,可用于sds-page对照;

4)用结合液洗柱,收集穿透液(含杂蛋白或未被吸附的蛋白),可用于sds-page对照;

5)洗脱液洗脱,收集洗脱样;

6)洗柱保存:5ml结合液、10ml超纯水、10ml20%乙醇、加入5ml20%乙醇4℃保存。

分析纯化后的重组l-乳酸脱氢酶(lcldhi229a)酶学性质,如表1,lcldhi229a催化效率提高了4.2倍,同时比酶活提高6.1倍。由于底物亲和力及催化效率的提高,增加了突变体lcldhi229a的比酶活。这表明该发明通过突变的创新方式提高了l-乳酸脱氢酶的酶学性质。

表1lcldhi229a突变体反应动力学参数

虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种催化效率提高的l-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法

<160>6

<170>patentinversion3.3

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<211>326

<212>prt

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