本发明涉及一种催化效率提高的l-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
nadh依赖型l-乳酸脱氢酶(l-lactatedehydrogenase，l-ldh)能够不对称还原α-酮酸生成手性α-羟基酸，其广泛应用于生物制药、材料和食品等行业。例如l-苯乳酸(l-phenyllacticacid)是一种天然抑菌剂，也可由l-ldh不对称还原苯丙酮酸(phenylpyruvicacid，ppa)催化生成，可以替代食品添加剂和动物饲料中的抑菌剂，也可以作为合成多种药物的前体，还可以作为一种潜在的聚乳酸替代物，合成聚苯乳酸新型高分子材料。
一些化学和生物方法可用于合成手性α-羟基酸，但与化学法相比，生物酶法由于其条件温和，环境友好，生成产物纯度高等优点，已成为主要合成方法。但现已发现的大多数野生型l/d-ldh对带有长脂肪链或芳香基团侧链的底物(苯甲酰甲酸，ppa，草酰乙酸等)表现出较低的活性，在一定程度上限制了l/d-ldh的广泛应用。随着人们对l/d-ldh的结构、功能和作用机理的认识不断深入，采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的l/d-ldh的研究得到了迅速发展。jiang等采用定点突变方法将pseudomonasstutzerisdml-ldh中的val108替换为ala，获得一个新突变酶，该突变酶对l-扁桃酸的催化效率(kcat/km)较野生型酶提高了50.1倍。zheng等在l.bulgaricusatcc11842d-ldh的基础上，将其52位点的tyr突变为leu，使得突变酶对ppa的活性显著提高。aslan等对geobacillusstearothermophilus的l-ldh(bsldh)实施了定点饱和突变，从突变文库中，获得了一个最优突变体1g7(d101y102)，其催化ppa的活性明显高于bsldh。
本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过突变特定氨基酸优化l-乳酸脱氢酶分子结构、提高其催化活性。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种催化活性提高的l-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法。
本发明提供一种催化活性提高的l-乳酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是seqidno.1所示的序列。
所述突变体的核苷酸序列是seqidno.3所示的序列。
所述突变体是在如序列seqidno.2所示的氨基酸的基础上，将第229位的异亮氨酸突变成了丙氨酸(i229a)。
所述编码seqidno.2所示氨基酸序列的核苷酸序列是seqidno.4所示的序列。
本发明还提供一种表达所述l-乳酸脱氢酶突变体的基因工程菌。
所述基因工程菌的制备方法，是以携带编码l-乳酸脱氢酶基因的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过pcr进行定点突变，得到携带编码突变体基因的重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌bl21中即得到重组大肠杆菌基因工程菌。
所述表达载体是以下任意一种：pet-22b(+)、pet-28a(+)、pet-32a(+)、pet-41a(+)。
所述表达载体，在本发明的一种实施方式中是pet-22b(+)。
所述大肠杆菌宿主菌是以下任意一种：e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、或e.colitop10。
所述大肠杆菌宿主菌，在本发明的一种实施方式中是e.colibl21。
所述的制备方法，具体是：
(1)以携带序列如seqidno.4所示lcldh基因的重组质粒pet-22b(+)-lcldh为模板，序列如seqidno.5所示的f1primer、序列如seqidno.6所示的r1primer为引物，进行突变pcr，即得到编码的第229位氨基酸由异亮氨酸突变成了丙氨酸的重组质粒pet-22b(+)-lcldhi229a；
(2)将上一步得到的重组质粒转化至e.colibl21(de3)，获得重组大肠杆菌基因工程菌lcldhbl21。
本发明的有益效果：本发明在l-乳酸脱氢酶基础上，通过定点突变生物技术改造l-乳酸脱氢酶分子结构，得到一株l-乳酸脱氢酶大肠杆菌工程菌，突变酶比酶活提高6.1倍，催化活性提高4.2倍。本发明解决了l-乳酸脱氢酶催化活性低的限制性问题，为l-乳酸脱氢酶分子改造提供了一条新的思路。
附图说明：
图1为重组乳酸脱氢酶lcldhi229a的sds-page图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
l-乳酸脱氢酶酶活测定方法：
总反应体系包括50mmol/l乙酸钠缓冲液(ph5.5)，0.2mmol/lnadh，5mmol/lppa，对照组中不含nadh，其他成分相同。混匀后于35℃保温5min，加入适量的酶液。检测nadh在340nm处吸收值的变化。酶活性单位(u)定义为：在上述条件下，每分钟催化氧化1μmolnadh所需要的酶量。比活性定义为每毫克酶蛋白所含的酶活单位数(u/mg)。
实施例1：突变酶基因及其表达质粒的构建
将扩增得到的核苷酸序列如seqidno.4所示的基因lcldh，扩增产物与pucm-t连接，转化e.colijm109，经蓝白斑筛选、菌液pcr验证和dna测序。将测序正确的重组质粒命名为pucm-t-lcldh。用ndeⅰ和xhoⅰ双酶切pucm-t-lcldh，回收lcldh，与经同样双酶切的pet-28a(+)连接，获重组质粒pet-28a(+)-lcldh。
以pet-28a(+)-lcldh重组质粒为模板，以f1primer(序列如seqidno.5所示)、r1primer(序列如seqidno.6所示)为引物，通过pcr进行定点突变，得到携带编码突变体基因的重组质粒，命名为pet-22b(+)-lcldhi229a。
实施例2：产l-乳酸脱氢酶大肠杆菌工程菌构建
将实施例1得到的重组质粒pet-22b(+)-lcldhi229a转化e.colibl21感受态细胞，具体方法如下：
1)接种lb平板活化的e.colibl21于2mllb培养基中，37℃，220r/min过夜培养；2％接种上述培养液于5mllb培养基中，37℃，220r/min培养4h；
2)取上述菌液1.4ml放入1.5mlep管中，冰浴10min，4000r/min离心2min，收集菌体；
3)加入1ml预冷的0.1mcacl2溶液重悬上述细胞，冰浴10min，4000r/min，离心2min，收集菌体；
4)加入100μl预冷的0.1mcacl2溶液悬浮上述细胞，4℃保存30min即可转化；
5)取100μl感受态细胞于冰上完全解冻后，轻轻将细胞均匀悬浮，加入5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置30min；
6)42℃水浴热激90s，冰浴15-20min；
7)加入400μllb培养基，37℃，220r/min振荡培养1h；
8)室温下4000r/min离心5min，去掉450μl上清液，将剩余菌液吹打混匀后，涂布于kan板上；
8)挑取上述平板中白色菌落，进行菌液pcr验证，验证正确的重组菌送至测序公司测序，命名测序正确的重组菌为lcldhbl21。
实施例3：重组大肠杆菌诱导表达
将实施例2构建的重组菌lcldhbl21在lb平板上活化，挑取单菌落至2mllb培养基中，37℃、220r/min培养12h，按2％接种量接种至100ml/500mllb培养基中，37℃，220r/min培养2h后加iptg至终浓度0.4mm，20℃诱导表达8h，8000r/min离心5min收集菌体，超声破碎后得到粗酶液，将粗酶液用镍柱纯化，具体方法如下：
1)用超纯水洗柱3次以上；
2)用新配制的结合液洗柱3次；
3)上样：用水膜过滤发酵液，若量多，可反复过柱；上样量<＝8ml，一般4ml左右；用盖子将下方漏孔堵住，4℃结合30min或者过夜，收集流出液，可用于sds-page对照；
4)用结合液洗柱，收集穿透液(含杂蛋白或未被吸附的蛋白)，可用于sds-page对照；
5)洗脱液洗脱，收集洗脱样；
6)洗柱保存：5ml结合液、10ml超纯水、10ml20％乙醇、加入5ml20％乙醇4℃保存。
分析纯化后的重组l-乳酸脱氢酶(lcldhi229a)酶学性质，如表1，lcldhi229a催化效率提高了4.2倍，同时比酶活提高6.1倍。由于底物亲和力及催化效率的提高，增加了突变体lcldhi229a的比酶活。这表明该发明通过突变的创新方式提高了l-乳酸脱氢酶的酶学性质。
表1lcldhi229a突变体反应动力学参数
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种催化效率提高的l-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法
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