本发明属于生物
技术领域：
，具体地说，涉及在体液中crispr-cas13a系统特异性靶向人rspo2基因的crrna及系统和应用。
背景技术：
：肝纤维化是肝脏对各种原因所致慢性肝损伤的创伤愈合反应，导致肝小叶内和汇管区大量纤维组织增生和沉淀，病理学特点是以胶原蛋白为主的细胞外基质各种成分合成增多，降解相对不足，但并未形成小叶内间隔，如进一步发展则进入肝硬化。肝纤维化是可逆的过程，对肝纤维化的预防和早期干预是稳定病情、阻止肝纤维化向肝硬化和肝癌发展的最佳措施。肝穿刺组织活检是目前诊断肝纤维化的金标准，但是肝穿刺属于创伤性检测会给病人带来痛苦及风险，而且局部采样并不能反应患者的整体情况。人外周血中存在游离dna(cell-freedna，cfdna)，cfdna与人的生理状况、疾病存在相关性，可以作为辅助诊断疾病的生物标志物。液体活检(liquidbiopsy)通过检测血液或者尿液等体液中的生物标志物为疾病的分析诊断提供辅助信息。与现有的组织活检方法相比，液体活检具有无侵入性、可频繁多次检测、检测速度快等优势，应用发展潜力巨大。目前液体活检主要应用领域是肿瘤的血液检测和无创产前诊断，尚未有在肝纤维化诊断中的应用。要在肝纤维化中应用液体活检，需要解决两个问题：①找到一个或一组反应肝纤维化进程的生物标志物；②在血液中特异性检测微量的肝纤维化标志物。肝星状细胞是肝脏合成细胞外基质的主要细胞，其激活发生肌成纤维细胞的表型转换是肝纤维化发生的中心环节。肝星状细胞的激活受众多信号通路的调控，现有研究结果证实wnt信号通路影响肝星状细胞的活化，阻断wnt信号通路可抑制肝星状细胞的增殖及诱导其凋亡。r-脊椎蛋白2(rspo2)是新发现的wnt信号通路的重要调控因子，rspo2可以激活并增强wnt/β-catenin信号通路，在生物体的组织分化、器官形成以及疾病发生过程中发挥重要作用。因此，通过检测体液中的rspo2基因，可以为作为辅助诊断肝纤维化的一种中间结果信息。规律成簇间隔短回文重复系统(crispr-cas)广泛存在于细菌和古细菌中，是由rna介导、可遗传的获得性免疫系统。crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)由高度保守的重复序列(repeats)和多个不同的间隔序列(spacer)顺序排列组成，重复序列长度通常21～48bp，重复序列之间被26～72bp的间隔序列隔开。cas(crisprassociatedproteins)是核酸酶，通过选择不同的cas蛋白，crispr-cas系统可以具有基因编辑、抑制、激活等功能。其中，cas13a蛋白可以与crrna(crisprrna)结合，应用于特异性识别rna序列。crispr-cas13a系统特异性检测rna靶序列的机理如下：①crispr序列转录并加工成crrna，②crrna的间隔序列与与目标序列的pfs(protospacerflankingsite)邻近靶序列配对，③cas13a蛋白切割目标rna附近的reportrna，reportrna释放荧光基团，④通过荧光读数即可检测rna靶序列的数量。crispr-cas13a系统可以达到单分子检测灵敏度，可以在体液中特异性检测rspo2基因。技术实现要素：本发明的目的是应用crispr-cas13a系统特异性检测体液中的rspo2基因。本发明将从体液中提取dna并扩增rspo2基因，并通过crispr-cas13a系统特异性检测rspo2基因。为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：第一方面，本发明提供了一种crispr-cas13a系统中特异性靶向人rspo2基因的crrna，该crrna序列格式为：5`-与cas13a蛋白结合的直接重复序列-crrna间隔序列-3`；其中crrna间隔序列如seqidno：2、6、10、14中任意一条所示。作为一种优选方式，四条crrna针对的目标靶序列分别如seqidno：1、5、9、13中任意一条所示，对应的间隔序列分别如seqidno：2、6、10、14所示，对应的pfs分别为c、u、c、a(如seqidno：1所示的目标靶序列，对应的间隔序列如seqidno：2所示，对应的pfs为c。其余三条crrna类推)。作为另一种优选方式，cas13a蛋白可以为lwcas13a，crrna序列中直接重复序列采用与lwcas13a蛋白结合的直接重复序列gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac，由此四条crrna序列如seqidno：3、7、11、15中任意一条所示。作为另一种优选方式，cas13a蛋白还可以为lshcas13a，crrna序列中直接重复序列采用与lshcas13a蛋白结合的直接重复序列ccaccccaauaucgaaggggacuaaaac，由此四条crrna序列如seqidno：4、8、12、16中任意一条所示。第二方面，本发明提供了一种由第一方面任意一种方案中的crrna构建的crispr-cas13a系统。作为一种优选方式，该crispr-cas13a系统中还包括能够表达所述cas13a蛋白的质粒、rnareporter以及核酸酶缓冲液。当然，根据crispr-cas13a系统构建的需要，还可以包含其他必要试剂或组分。将待检测的样本rna添加至crispr-cas13a系统中，可以根据荧光分析得出rna靶序列数量，进而反应rspo2基因的表达。第三方面，本发明提供了一种第二方面中的crispr-cas13a系统在人rspo2基因检测中的应用。第四方面，本发明提供了一种基于crispr-cas13a的rspo2基因液体活检方法，该方法首先将外周血离心分离，从上清液中提取样本dna，将t7启动子序列加在样本dna待转录链的上游引物的5’端，pcr扩增样本dna中的rspo2基因；然后将带t7启动子的pcr产物在t7rna聚合酶作用下生成样本rna，回收纯化；最后将第一方面任意一种方案中的crrna、样本rna、能够表达所述cas13a蛋白的质粒和rnareporter在核酸酶缓冲液中孵育，通过荧光读数分析rspo2基因所表达的rna靶序列的数量。第四方面和第五方面可以为体液中活检rspo2基因提供新的技术手段，这些应用和方法可以应用于非疾病诊断目的，例如提供商业化检测、科学研究或者试剂盒制备，检测结果可以作为肝纤维化的辅助信息，供临床诊断。第五方面，本发明提供了一种第一方面任意一种方案中的crrna在制备检测人rspo2基因的试剂盒中的应用。crrna可以通过连接载体等方式，制成成套的试剂盒，以便于商业化推广。本发明的有益效果在于：本发明公开了一种应用crispr-cas13a系统在人体液中检测rspo2基因的方法，在体液中特异性检测微量的rspo2基因，作为用于辅助判断肝纤维化的中间结果信息。本发明具有无侵入性、可频繁多次检测、检测速度快等优势，特别适合为肝纤维化的预防和早期干预提供辅助信息。同时，相比于目前的液体活检，本发明通过荧光读数即可检测体液中的微量rspo2，而无需高通量测序，具有成本低、检测速度快等优势，适用于临床的大规模应用。附图说明图1为基于crispr-cas13a的rspo2基因液体活检的原理图；图2为crispr-cas13a结构示意图；图3为针对rspo2基因1、2、3、4靶点设计的crrna对目标rna检测的结果；图4为应用crispr-cas13a系统对样本外周血中rspo2检测的结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。首先，详细介绍本发明中构建特异性靶向人rspo2基因的crispr-cas13a的方法，具体步骤如下：一、设计特异性靶向人rspo2基因的crrna1.靶向人rspo2基因的crrna设计由于crispr-cas13a属于crisprclass2类型vi系统，crrna的成熟、与cas13a的绑定均无需tracrrna(trans-activatingcrrna)的介入，因此crran的设计与crispr-cas9系统的sgrna设计不相同。目前尚未有明确的crispr-cas13acrrna设计原则，根据我们的前期工作和经验，靶向人rspo2基因的crrna设计原则如下：(1)crrna包括间隔序列(spacer)和直接重复序列(directrepeat，dr),序列格式为：5`-与cas13a蛋白结合的直接重复序列-crrna间隔序列-3`，直接重复序列需要根据cas13a蛋白来确定，使其能够与选定的cas13a蛋白匹配并结合；(2)crrna的间隔序列长度为22～28个碱基序列；(3)crrna的间隔序列在rspo2基因上的靶点位于基因的外显子；(4)与crrna间隔序列配对的靶序列3`端pfs不应为g；(5)crrna的直接重复序列长度大于24个碱基序列；(6)crrna的直接重复序列应包含茎环(stemloop)结构；(7)在crrna的间隔序列中间为seed区，与靶序列结合时不能发生错配。2.靶向人rspo2基因的crrna选择(1)在ncbi数据库中用blast，确定crrna的靶序列唯一且不会与人rspo2基因之外的其他基因序列同源；(2)crrna靶点不能离起始密码子(atg)太近；(3)脱靶(off-target)率低。最终，设计出若干条靶向人rspo2基因的crrna，其针对的位点靶序列如表1所示。表1、针对不同位点的靶向人rspo2基因的靶序列二、crran合成1.crrna的合成(1)根据选择的crrna间隔序列，在5`端加上gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac(与lwcas13a蛋白对应的直接重复序列)或ccaccccaauaucgaaggggacuaaaac(与lshcas13a蛋白对应的直接重复序列)，得到crrna序列；(2)crrna序列格式为：5`-gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac-crrna间隔序列-3`；或5`-ccaccccaauaucgaaggggacuaaaac-crrna间隔序列-3`；(3)根据crrna合成dna，并在5`添加t7启动子序列(5`-taatacgactcactataggg-3`)；(4)将上述带t7启动子dna在t7rna聚合酶作用下生成rna，回收纯化，得到足量的crrna。2.目标rna序列的合成(1)根据目标rna序列化学合成相应的dna，并在5`添加t7启动子序列(5`-taatacgactcactataggg-3`)，目标rna1～4序列如表2所示：表2、目标rna序列(2)上述带t7启动子的dna在t7rna聚合酶作用下生成rna，回收纯化，得到目标rna。3.crrna有效性验证(1)将上述目标rna、crrna以及能够表达所述cas13a蛋白的质粒、带荧光基团的rnareporter(rnasealertv2，thermoscientfic)在核酸酶缓冲液中，37℃孵育1～3小时。其中质粒的类型需要与crrna相匹配，例如当crrna中的直接重复序列采用能与lwcas13a蛋白结合的直接重复序列时，质粒也需要采用含lwcas13a的质粒twinstrep-sumo-hulwcas13a(fengzhang，science2017)；对于lshcas13a蛋白对应的直接重复序列类同。(2)荧光分析仪检测荧光读数。三、crispr-cas13a系统检测血液中的rspo2基因1.提取样本dna对外周血离心分离血浆和血细胞，从上清液中提取样本dna。2.扩增待检样本中的rspo2基因将t7启动子序列(taatacgactcactataggg)加在样本dna的待转录链的上游引物5’端，pcr扩增样本dna中的rspo2基因。3.体外转录生成rna上述带t7启动子的pcr产物在t7rna聚合酶作用下生成rna，切胶回收纯化。4.基于crispr-cas13a系统检测rspo2基因将上述构建的靶向人rspo2基因的crrna、样本dna转录生成的rna、能够表达相应cas13a蛋白的质粒、rnareporter(rnasealertv2，thermoscientfic)在核酸酶缓冲液中，37℃孵育1～3小时，通过荧光读数分析rspo2基因所表达的rna靶序列的数量。需要说明的是，本发明提供的各个crrna可以联合使用，可以是任意两种或多种crrna的联合使用，对多个靶点进行检测。以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，需要注意的是，下述实施例间并非独立进行的，而是依次连续的实施过程。以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。以下实施例中所涉及的技术，包括体外转录、pcr扩增、荧光计数等分子生物学技术，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、质粒、细胞株等，除非特别注明，均为一般本领域的技术人员可以通过公共途径获得。实施例1crrna序列设计由于crispr-cas13a的crran的设计与crispr-cas9系统的sgrna设计不相同，目前尚未有明确的crispr-cas13acrrna设计原则，根据我们的前期工作和经验，靶向人rspo2基因的crrna设计原则如下：(1)crrna包括间隔序列和直接重复序列；(2)crrna的间隔序列长度为22～28个碱基序列；(3)crrna的间隔序列在rspo2基因上的靶点位于基因的外显子；(4)与crrna间隔序列配对的靶序列3`端pfs不应为g；(5)在crrna的间隔序列中间为seed区，与靶序列结合时不能发生错配(6)crrna的直接重复序列长度大于24个碱基序列；(7)crrna的直接重复序列应包含茎环(stemloop)结构。本实施例中的crrna可以基于两种cas13a蛋白，分别为lshcas13a和lwcas13a，茎环结构分别如下所示：或：根据上述方法，本发明设计了多条靶向人rspo2基因的候选crrna序列，供后续选择。实施例2crrna序列选择使用blast(www.ncbi.nlm.nig.gov/blast)将候选crrna序列和基因组数据库进行同源分析，保证设计的crrna的靶序列唯一且不会与人rspo2基因之外的其他基因序列同源。同时，根据以下原则筛选crrna，以得到高效、特异性检测人rspo2基因的crrna序列：(1)crrna靶点不能离起始密码子(atg)太近；(2)脱靶(off-target)率低。根据以上方法，筛选得到4条针对不同位点的靶向人rspo2基因的crrna间隔序列。4条靶序列分别如序列表seqidno.1、5、9、13所示，各靶序列对应的crrna间隔序列如序列表seqidno.2、6、10、14所示，靶序列、crrna间隔序列以及对应的pfs对应关系具体见表1，不再赘述。由于cas13a蛋白有两种，因此本实施例总共设计了8条靶向人rspo2基因的crrna序列，序列表seqidno.3、7、11、15为lwcas13a对应的crrna序列，seqidno.4、8、12、16为对应lshcas13a的crrna序列。实施例3crrna合成dna为后续实验保存方便及扩增需要，本发明将crrna合成为dna，在使用时体外转录为rna：(1)根据选择的crrna间隔序列，在5`端加上gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac(lwcas13a蛋白对应的直接重复序列)或ccaccccaauaucgaaggggacuaaaac(lshcas13a蛋白对应的直接重复序列)，得到crrna序列；(2)crrna序列格式为：5`-gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac-crrna间隔序列-3`；(lwcas13a)或5`-ccaccccaauaucgaaggggacuaaaac-crrna间隔序列-3`；(lshcas13a)(3)在5`添加t7启动子序列(taatacgactcactataggg)，dna序列格式如下：正向序列(lwcas13a)：5`-taatacgactcactataggg-gatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaac-crrna间隔序列对应的dna序列-3`反向序列(lwcas13a)：5`-crrna间隔序列对应的dna序列-gttttagtccccttcgtttttggggtagtctaaatc-ccctatagtgagtcgtatta-3`正向序列(lshcas13a)：5`-taatacgactcactataggg-ccaccccaatatcgaaggggactaaaac-crrna间隔序列对应的dna序列-3`反向序列(lshcas13a)：5`-crrna间隔序列对应的dna序列-gttttagtccccttcgatattggggtgg-ccctatagtgagtcgtatta-3`(4)以lwcas13a蛋白对应的直接重复序列为例，应用化学合成法分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，变性、退火得到的dsdna序列如表3所示。表3、crrna对应的dna序列实施例4pcr扩增靶序列dna1.引物5`端添加t7启动子序列(taatacgactcactataggg)。不同靶序列1～4(若靶序列为rna，则需根据相应rna序列预先化学合成对应的dna)以及rspo2基因的pcr正向和反向引物如表4所示，根据pcr扩增对象进行选用。表4、不同扩增对象所采用的pcr引物靶序列正向引物反向引物靶序列15`-cgacgagatgggaactttctg-3`5`-cttctgttgacatcggctaca-3`靶序列25`-gcagcaattcccgcgctggtt-3`5`-cccttctcttcgaaggaagaa-3`靶序列35`-gctggttttctggggagtcct-3`5`-ccatactggcgcatccctt-3`靶序列45`-gggagtcctcgcctccaga-3`5`-gcaggcactctccatactggc-3`rspo25`-gtttcctcagggcattgctt-3`5`-tgcattatttccctggctga-3`2.pcr反应体系如下：3.pcr条件：94℃5分钟，1个循环；94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，共35个循环；72℃延伸5分钟；实施例5体外转录rna1.溶解试剂后震荡混匀并短暂离心,收集并将所有成分置于冰上；2.体外转录的反应体系如下:3.混匀反应混合液并短暂离心收集,37℃孵育2小时；4.向反应系统中加入1μldnasei,37℃孵育15分钟消化dan模板；5.合成的rna回收纯化。实施例6crrna有效性验证1.按照实施例4所示的方法，pcr扩增表1中的靶序列1～4；2.按照实施例5所示的方法，将靶序列体外转录为rna(目标rna1～4)；同样的，将上述crrna对应的dna体外转录为crran；3.然后利用上述目标rna以及对应的crrna建立crispr-cas13a检测体系：其中，核酸酶检测缓冲液(nucleaseassaybuffer)由40mmtris-hcl、60mmnacl，6mmmgcl2组成，ph值为7.3。4.37℃孵育1～3小时；5.荧光分析仪每隔5分钟读数。当靶向人rspo2rna的crisrp-cas13a与目标序列结合时，cas13a蛋白切割目标rna附近的reportrna时，reportrna会释放荧光基团，通过荧光读数即可检测rna靶序列的数量。如图3所示针对rspo2靶点1、2、3、4的crrna与相应的rspo2rna靶序列结合后，荧光读数在30分钟后显著上升，表明本发明设计的crrna序列有效。实施例7全血样本中提取cfdna1.血浆分离10ml人全血样本(4℃、1600g、10分钟)离心，将上清再次离心(4℃、1600g、10分钟)，收集上清；2.裂解反应体系如下：步骤1获得的上清1mlproteinasek100μlaclbuffer2ml在离心管中混匀，60℃孵育30分钟。加入1.8mlbufferacb，混匀，冰上孵育5分钟；3.过柱吸附1ml混合液加入qiaampminicolumn离心柱，离心(8000g、1分钟)；4.洗涤①离心柱中依次加入acw1600μl、acw2750μl和无水乙醇750μl，每次加入后，分别离心(8000g、1分钟)并弃上清；②将离心柱放入2ml收集管离心(20000g，3分钟)；③洗脱cfdna，离心(20000g，1分钟)收集cfdna。5.cfdna纯化①向含cfdna的离心管中加入agencourampurexp25μl，混匀，室温孵育5分钟，置磁力架上至溶液澄清后转移上清至离心管；②加入agencourampurexp48μl，室温孵育5分钟，置磁力架上至溶液澄清后弃上清；③70％乙醇清洗磁珠，离心(8000g，1分钟)吸尽残余液体，室温干燥5分钟；④用20μl水洗脱磁珠，得到纯化的cfdna。实施例8crispr-cas13a检测全血样本中的rspo2基因以crrna序列1(seqidno.3)为例，说明crispr-cas13a检测全血样本中的rspo2基因。1.提取样本cfdna按实施例7从全血样本中提取cfdna；2.扩增待检样本中的rspo2基因按实施例4，将t7启动子序列(taatacgactcactataggg)加在上游引物的5’端，pcr扩增样本dna中的rspo2基因；2.体外转录生成rna按实施例5，将上述带t7启动子的pcr产物在t7rna聚合酶作用下生成样本rna，切胶回收纯化；3.crispr-cas13a系统检测rspo2基因参照实施例6中的方法，检测rspo2基因，建立crispr-cas13a检测体系：37℃孵育1～3小时，荧光分析仪每隔5分钟读数。当靶向人rspo2rna的crisrp-cas13a与目标序列结合时，cas13a蛋白切割目标rna附近的reportrna时，reportrna会释放荧光基团，通过荧光读数即可检测rna靶序列的数量。如图4所示，荧光读数在30分钟后显著上升，表明本发明crispr-cas13a系统可以在血液中特异性检测rspo2。以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。序列表<110>嘉兴市第一医院<120>crispr-cas13a系统特异性靶向人rspo2基因的crrna及系统和应用<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>28<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgacgagaugggaacuuucugaauuaag28<210>2<211>28<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cuuaauucagaaaguucccaucucgucg28<210>3<211>64<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaaccuuaauucagaaaguucccaucuc60gucg64<210>4<211>56<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ccaccccaauaucgaaggggacuaaaaccuuaauucagaaaguucccaucucgucg56<210>5<211>28<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gcaauucccgcgcugguuuucuggggag28<210>6<211>28<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6cuccccagaaaaccagcgcgggaauugc28<210>7<211>64<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaaccuccccagaaaaccagcgcgggaa60uugc64<210>8<211>56<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ccaccccaauaucgaaggggacuaaaaccuccccagaaaaccagcgcgggaauugc56<210>9<211>28<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9guuuucuggggaguccucgccuccagag28<210>10<211>28<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cucuggaggcgaggacuccccagaaaac28<210>11<211>64<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaaccucuggaggcgaggacuccccaga60aaac64<210>12<211>56<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ccaccccaauaucgaaggggacuaaaaccucuggaggcgaggacuccccagaaaac56<210>13<211>28<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gaguccucgccuccagagcuaguuaugu28<210>14<211>28<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14acauaacuagcucuggaggcgaggacuc28<210>15<211>64<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacacauaacuagcucuggaggcgagg60acuc64<210>16<211>56<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16ccaccccaauaucgaaggggacuaaaacacauaacuagcucuggaggcgaggacuc56当前第1页12