本发明涉及taqman分型方法，尤其涉及一种血液直接pcr进行taqman分型的方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms)，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。snp在人类基因组中的发生频率比较高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。有些snp位点还会影响基因的功能，导致生物性状改变甚至致病。单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据，因此被广泛用于群体遗传学研究(如生物的起源、进化及迁移等方面)和疾病相关基因的研究，在药物基因组学、诊断学和生物医学研究中起重要作用。目前所涉及检测snp的技术中，无一例外的是以dna为模板。由于样品之间的巨大差异，dna与rna的分离提取过程也千差万别，这项工作对于操作人员的技术熟练程度要求颇高。传统分离提取技术由于要使用一些毒性较强的化学试剂，长期接触，将对操作人员的身体造成不可逆的伤害，甚至在实验过程中造成直接的损害。同时，对于有大量样品需要研究的人员，分离提取核酸则是一项劳动量极大的工作。现在市场上核酸分离提取试剂盒已经成熟，品牌众多，但大致都相同。无论是硅胶膜柱离心式试剂盒还是磁珠法试剂盒，都需要大量的时间，且成本高昂。除试剂盒成本外，更是对实验室仪器设备有特殊要求，磁珠法所采用的自动化工作站就是非常典型的大型高价值设备，对实验室而言，是一项巨大的费用支出。综上，本发明以独特的细胞裂解液对血液样本进行粗处理，进行简单的离心除杂后，便可进行snp分型。本发明实验过程中所用聚合酶为强耐受性dna聚合酶，其余试剂、耗材与正常snp分型无异，所发明通用于所有使用taqman探针法进行snp分型的技术领域。
taqman探针pcr反应体系中含有一对双标记的探针和一对pcr引物,用两种荧光染料fam，hex(vic)分别标记这两种探针，taqman探针上有一个荧光发光基团(reporterdye简称r基团)和一个荧光猝灭基团(quencher简称q基团)，完整的探针上的这两个基团靠的很近，r基团发出的荧光在q基团的吸收波长范围内，则会被q基团吸收，因此不会产生荧光，当探针与模板结合，上游引物(5’端的)延伸到探针结合的地方时，利用聚合酶(taqpolymerase)的5’-3’的外切酶活性把探针降解，同时把r基团从探针上游离下来，使它和猝灭集团分开，这时就会产生荧光，最后通过终点读板检测信号来确定是否存在snp位点。
技术实现要素：
本发明提供了一种血液直接pcr进行taqman分型的方法，本发明以细胞裂解液对血液进行粗处理，进行简单的离心除杂后，便可进行taqman分型，避免了提取dna的繁琐步骤，本发明实验过程中所用聚合酶为强耐受性dna聚合酶。
本发明的目的是通过以下方案实现：
一种血液直接pcr进行taqman分型的方法，包括如下步骤：血液粗处理，制得样品—pcr扩增—taqman分型鉴定；所述pcr扩增中采用强耐受性dna聚合酶。
优选地，所述血液粗处理的方法为向10μl全血中加入90μl细胞裂解液后室温裂解30min；将裂解后的细胞液转移到1.5ml离心管中，95℃加热15min后，12，000×g，离心10min，取上清液至96孔板中作为样品备用。
优选地，所述细胞裂解液为50mmol/ltris-clph8.0，150mmol/lnacl。
优选地，所述强耐受性dna聚合酶选自选自
上述中的一种。
优选地，所述pcr的体系如下：
优选地，所述探针和引物包括如下3个位点的探针和引物，具体如下：
snp位点1：
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探针1：tagtatggaagaaatc
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探针1：cattccggtaagcag
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优选地，所述引物、探针均由擎科生物技术有限公司(北京)合成。
优选地，所述pcr条件如下：
①预变性：95℃，5min；
②变性：95℃，10s；
退火-延伸：60+1℃，60s，40个循环；
③12℃，forever；
退火温度为：常规退火温度+1℃；所述常规退火温度是指本申请中所述引物在常规pcr下的温度。
优选地，所述taqman分型鉴定是指使用bio-tek读取荧光值，利用klustercaller软件分析荧光数据，根据对照扩增结果，分型产生三种基因型。
实验数据表明，pcr反应的灵敏度极高，只需要以少量模板便可完成扩增过程。以往的过程当中通过提取dna，以高纯度的dna为模板进行扩增，而这个过程中所用dna通常是过量的。那么，当细胞被裂解后释放出的dna的含量则完全可以满足pcr过程。但是，此时的dna中往往掺杂了大量杂质，这些杂质会严重影响后续的分型鉴定。为了消除杂质的影响，我们将血液进行高速离心，借此来降低血液中的杂质含量。此时，dna中杂质的量被大大减少，而dna含量也可以满足扩增过程。此外，在pcr反应当中，虽然杂质的含量被大大降低，但是一般的dna聚合酶仍然会在一定程度上受到杂质的影响。为了尽可能的消除影响，我们以强耐受性dna聚合酶进行pcr扩增，这种酶具有很强的pcr反应抑制物耐受性，能以待测样本的裂解液为模板，进行高效特异性扩增。
附图说明
图1是实施例1的taqman分型图；
图2是实施例2的taqman分型图；
图3是实施例3的taqman分型图；
其中，1为水对照，2(snp位点1)、3(snp位点2)、4(snp位点3)为分型后的样品；根据fam和vic两种的荧光强度的比值进行分型，1(水)中两种荧光值基本为0，2中vic荧光值>fam，3中vic≈fam，4中vic<fam。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明进行详细的解释。
实施例1
一种血液直接pcr进行taqman分型的方法，包括如下步骤：血液粗处理，制得样品—pcr扩增—taqman分型鉴定；所述pcr扩增中采用强耐受性dna聚合酶。所述血液粗处理的方法为向10μl全血中加入90μl细胞裂解液后室温裂解30min；将裂解后的细胞液转移到1.5ml离心管中，95℃加热15min后，12，000×g，离心10min，取上清液至96孔板中作为样品备用。所述细胞裂解液为50mmol/ltris-clph8.0，150mmol/lnacl。所述强耐受性dna聚合酶为2xt5fastqpcrmix(probe)、tstngke。
所述pcr的体系如下：
所述pcr中的探针和引物包括如下3个位点的探针和引物，具体如下：
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探针1：cattccggtaagcag
探针2：attccggtaggcagc。
所述引物、探针均由擎科生物技术有限公司(北京)合成。
所述pcr条件如下：
①预变性：95℃，5min；
②变性：95℃，10s；
退火-延伸：60+1℃，60s，40个循环；
③12℃，forever；
退火温度为：常规退火温度+1℃；所述常规退火温度是指本申请中所述引物在常规pcr下的温度。所述taqman分型鉴定是指使用bio-tek读取荧光值，利用klustercaller软件分析荧光数据，根据对照扩增结果，分型产生三种基因型，如附图1所示。
其中，1为水对照，2、3、4为分型后的样品；根据fam和vic两种的荧光强度的比值进行分型，1(水)中两种荧光值基本为0。2中vic荧光值>fam，3中vic≈fam，4中vic<fam。
实施例2
一种血液直接pcr进行taqman分型的方法，包括如下步骤：血液粗处理，制得样品—pcr扩增—taqman分型鉴定；所述pcr扩增中采用强耐受性dna聚合酶。所述血液粗处理的方法为向10μl全血中加入90μl细胞裂解液后室温裂解30min；将裂解后的细胞液转移到1.5ml离心管中，95℃加热15min后，12，000×g，离心10min，取上清液至96孔板中作为样品备用。所述细胞裂解液为50mmol/ltris-clph8.0，150mmol/lnacl。所述强耐受性dna聚合酶为2xtransdirectpcrsupermix、transgenbiotech。
所述pcr的体系如下：
所述pcr中的探针和引物包括如下3个位点的探针和引物，具体如下：
snp位点1：
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探针1：tagtatggaagaaatc
探针2：tagtagtatggcagaaat
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探针1：agatgccacgtagaag
探针2：agatgccatgtagaagt
snp位点3：
上游引物：acagggctgtgggacaagtc
下游引物：ggcgttacaattaaagagagagagaga
探针1：cattccggtaagcag
探针2：attccggtaggcagc。
所述引物、探针均由擎科生物技术有限公司(北京)合成。
所述pcr条件如下：
①预变性：95℃，5min；
②变性：95℃，10s；
退火-延伸：60+1℃，60s，40个循环；
③12℃，forever；
退火温度为：常规退火温度+1℃；所述常规退火温度是指本申请中所述引物在常规pcr下的温度。所述taqman分型鉴定是指使用bio-tek读取荧光值，利用klustercaller软件分析荧光数据，根据对照扩增结果，分型产生三种基因型，如附图2所示。
其中，1为水对照，2、3、4为分型后的样品；根据fam和vic两种的荧光强度的比值进行分型，1(水)中两种荧光值基本为0。2中vic荧光值>fam，3中vic≈fam，4中vic<fam。
实施例3
一种血液直接pcr进行taqman分型的方法，包括如下步骤：血液粗处理，制得样品—pcr扩增—taqman分型鉴定；所述pcr扩增中采用强耐受性dna聚合酶。所述血液粗处理的方法为向10μl全血中加入90μl细胞裂解液后室温裂解30min；将裂解后的细胞液转移到1.5ml离心管中，95℃加热15min后，12，000×g，离心10min，取上清液至96孔板中作为样品备用。所述细胞裂解液为50mmol/ltris-clph8.0，150mmol/lnacl。所述强耐受性dna聚合酶为2×phirehotstartiipcrmastermix、thermoscientific。
所述pcr的体系如下：
所述pcr中的探针和引物包括如下3个位点的探针和引物，具体如下：
snp位点1：
上游引物：aaaagaaaactgagtgggagcagta
下游引物：tgccccagcctctgctt
探针1：tagtatggaagaaatc
探针2：tagtagtatggcagaaat
snp位点2：
上游引物：ttaaaatgtggtggatgcactgt
下游引物：ctgtcatgcacttatatttatctagtttgaag
探针1：agatgccacgtagaag
探针2：agatgccatgtagaagt
snp位点3：
上游引物：acagggctgtgggacaagtc
下游引物：ggcgttacaattaaagagagagagaga
探针1：cattccggtaagcag
探针2：attccggtaggcagc。
所述引物、探针均由擎科生物技术有限公司(北京)合成。
所述pcr条件如下：
①预变性：95℃，5min；
②变性：95℃，10s；
退火-延伸：60+1℃，60s，40个循环；
③12℃，forever；
退火温度为：常规退火温度+1℃；所述常规退火温度是指本申请中所述引物在常规pcr下的温度。所述taqman分型鉴定是指使用bio-tek读取荧光值，利用klustercaller软件分析荧光数据，根据对照扩增结果，分型产生三种基因型，如附图3所示。
其中，1为水对照，2、3、4为分型后的样品；根据fam和vic两种的荧光强度的比值进行分型，1(水)中两种荧光值基本为0。2中vic荧光值>fam，3中vic≈fam，4中vic<fam。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
<110>美因健康科技（北京）有限公司
<120>血液directpcr进行snp分型
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<170>primerexpress3.0
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