本发明涉及蛋白质纯化技术领域，特别涉及一种死亡素抗菌肽的纯化工艺。
背景技术：
死亡素（thanatin）又称死亡肽，是由斑腹刺益蝽（podisusmaculiventris）诱导产生的一种环状昆虫抗菌肽，由21个氨基酸残基组成，其结构简单，抗菌谱广，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、某些真菌及原虫都有抑制作用，对哺乳动物细胞不表现出溶血性。鉴于死亡素具有优越的广谱抗菌活性，及独特的作用方式，是一种理想的抗生素替代产品，具有广阔的应用前景。
目前死亡素抗菌肽的主要生产方式是通过微生物发酵生物合成死亡素，主要有大肠杆菌和裂殖酵母两种表达系统。本实验室构建了分泌表达死亡素抗菌肽的毕赤酵母菌株，表达量达到0.6g/l（中国专利申请号：201711083981.0）。死亡素抗菌肽的纯化方法主要有两种：第一种方法是死亡素与带纯化标签（如6×组氨酸标签）的融合蛋白进行融合表达，通过纯化标签进行纯化，再利用相应的蛋白酶切割融合蛋白释放出死亡素抗菌肽单体；这种方法需要消耗大量蛋白酶，成本比较高，时间周期长，且不适合没有纯化标签的蛋白质纯化。第二种纯化方法是利用高效液相色谱（hplc）分离纯化死亡素抗菌肽单体；这种方法处理能力低，成本高，不适合大规模纯化。因此，急需一种成本低、适合大规模纯化死亡素抗菌肽的纯化工艺方法。
可见，现有技术还有待改进和提高。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种死亡素抗菌肽的纯化工艺，旨在解决现有技术中死亡素抗菌肽的纯化方法成本高、周期长，不适合大规模生产的问题。
为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种死亡素抗菌肽的纯化工艺，包括以下步骤：
s001.死亡素的表达：将死亡素抗菌肽表达菌株进行发酵，发酵结束后过滤或离心，收集上清液；
s002.发酵上清液脱盐：使用卷式膜对死亡素抗菌肽的发酵上清液脱盐，多次补加水，直至脱盐液的离子强度小于13ms/cm，脱盐液用0.45μm滤膜过滤，收集过滤脱盐液；
s003.上柱：用结合缓冲液平衡层析柱，再将过滤脱盐液上柱，然后用结合缓冲液冲洗层析柱;
s004.梯度洗脱：使用洗脱液冲洗层析柱，洗脱杂蛋白，冲洗后收集洗脱液通过核酸蛋白检测器检测蛋白质吸光度，收集有蛋白吸收峰的洗脱液；
s005.洗脱液脱盐：合并步骤s004收集的洗脱液，使用卷式膜浓缩、脱盐，直至洗脱液离子强度小于1ms/cm；
s006.冻干：收集脱盐洗脱液，冻干，制得死亡素抗菌肽纯化样品。
所述死亡素抗菌肽的纯化工艺中，所述死亡素抗菌肽表达菌株为中国专利申请号：201711083981.0中构建的菌株，保藏编号为gdmccno∶60261。
所述死亡素抗菌肽的纯化工艺中，所述步骤s002中发酵上清液使用卷式膜脱盐的进口压力为4.8～5.2bar，出口压力为4.6～5.0bar，流速90～110lpm。
所述死亡素抗菌肽的纯化工艺中，所述步骤s003中用8～10倍柱床体积的结合缓冲液平衡层析柱，流速为0.8～1.2倍柱床体积/min，再将过滤脱盐液上柱，流速为0.8～1.2倍柱床体积/min，然后用3～6倍柱床体积的结合缓冲液冲洗层析柱。
所述死亡素抗菌肽的纯化工艺中，所述层析柱为cm-sepharosefastflow层析柱。
所述死亡素抗菌肽的纯化工艺中，所述步骤s003中的结合缓冲液包括3.8mmnah2po4、16.2mmna2hpo4、50mmnacl。
所述死亡素抗菌肽的纯化工艺中，所述步骤s004中使用3～6倍柱床体积的0.3m洗脱液冲洗层析柱，洗脱杂蛋白，流速为0.8～1.2倍柱床体积/min，再使用3～6倍柱床体积的0.5m洗脱液冲洗层析柱，洗脱杂蛋白，流速为0.8～1.2倍柱床体积/min，冲洗后收集洗脱液通过核酸蛋白检测其检测蛋白质吸光度，收集有蛋白吸收峰的洗脱液。
所述死亡素抗菌肽的纯化工艺中，所述步骤s004中0.3m洗脱液包括3.8mmnah2po4、16.2mmna2hpo4、0.3mnacl，0.5m洗脱液包括3.8mmnah2po4、16.2mmna2hpo4、0.5mnacl。
所述死亡素抗菌肽的纯化工艺中，所述步骤s004中结合缓冲液和1m洗脱液，总流速为0.8～1.2倍柱床体积/min，结合缓冲液流速比例从100%线性降低至50%，1m洗脱液流速比例从0%线性增加至50%，洗脱8～10倍柱床体积，收集洗脱液通过核酸蛋白检测器检测蛋白质吸光度，收集有蛋白吸收峰的洗脱液。
所述死亡素抗菌肽的纯化工艺中，所述1m洗脱液包括3.8mmnah2po4、16.2mmna2hpo4、1mnacl。
有益效果：
本发明提供了一种死亡素抗菌肽的纯化工艺，通过采用cm-sepharosefastflow层析柱与死亡素抗菌肽发生离子交换，通过梯度洗脱获得纯度大于95%的高纯度的死亡素抗菌肽，操作简单，成本低，耗费时间短，得到的产品纯度高，适合大规模纯化死亡素抗菌肽。
附图说明
图1为本发明提供的所述死亡素抗菌肽纯化工艺的流程图。
图2为所述死亡素抗菌肽的蛋白纯度rp-hplc检测图。
具体实施方式
本发明提供一种死亡素抗菌肽的纯化工艺，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，本发明提供一种死亡素抗菌肽的纯化工艺，包括以下步骤：
s001.死亡素的表达：将死亡素抗菌肽表达菌株进行发酵，发酵结束后过滤或离心，收集上清液；
s002.发酵上清液脱盐：使用卷式膜对死亡素抗菌肽的发酵上清液脱盐，多次补加水，直至脱盐液的离子强度小于13ms/cm，脱盐液用0.45μm滤膜过滤，收集过滤脱盐液；
s003.上柱：用结合缓冲液平衡层析柱，再将过滤脱盐液上柱，然后用结合缓冲液冲洗层析柱;
s004.梯度洗脱：使用洗脱液冲洗层析柱，洗脱杂蛋白，冲洗后收集洗脱液通过核酸蛋白检测器检测蛋白质吸光度，收集有蛋白吸收峰的洗脱液；
s005.洗脱液脱盐：合并步骤s004收集的洗脱液，使用卷式膜浓缩、脱盐，直至洗脱液离子强度小于1ms/cm；
s006.冻干：收集脱盐洗脱液，冻干，制得死亡素抗菌肽纯化样品。
上述工艺操作简单、成本低、耗费的时间短，提纯后的死亡素抗菌肽的纯度高，适合大规模应用。
具体地，所述死亡素抗菌肽表达菌株为中国专利申请号：201711083981.0中构建的菌株，保藏编号为gdmccno∶60261；所述菌株为本实验室构建的菌株，该菌株的死亡素抗菌肽表达量大大地高于其它现有技术培育的菌株，采用该菌株来发酵，能够大大地提高死亡素抗菌肽浓度，进一步地提高了纯化产物的产量，对于规模化的生产来说，大大地提高了工作效率，节省生产成本。
优选地，所述步骤s002中发酵上清液使用卷式膜脱盐的进口压力为4.8～5.2bar，出口压力为4.6～5.0bar，流速90～110lpm；申请人经过大量实验证明，采用上述压力参数和流速下在保证发酵上清液的脱盐效果达到标准要求的条件下，耗费的时间短；如果压力过大，流速过快，则脱盐效果达不到要求；如果压力过小，流速过慢，则耗费的时间过长。
优选地，所述步骤s003中用8～10倍柱床体积的结合缓冲液平衡层析柱，流速为0.8～1.2倍柱床体积/min，再将过滤脱盐液上柱，流速为0.8～1.2倍柱床体积/min，然后用3～6倍柱床体积的结合缓冲液冲洗层析柱。更优选的，用10倍柱床体积的结合缓冲液平衡层析柱，流速为1.0倍柱床体积/min，再将过滤脱盐液上柱，流速为1.0倍柱床体积/min，然后用5倍柱床体积的结合缓冲液冲洗层析柱；申请人经过大量的实验证明，采用上述体积的结合缓冲液以及流速上柱，能够充分将层析柱润湿，过滤脱盐液采用上述流速上柱，能够保持均匀地在柱子中分散，流速过快或过慢都会造成过滤脱盐液的在柱子中分布不均匀，影响后续的分离效果。
优选地，所述层析柱为cm-sepharosefastflow层析；具有流速快、载量高等特征，适合于各种等电点的蛋白质分离，并在整个层析过程始终保持高容量，对所有常用的水相缓冲液、1.0m醋酸、1.0mnaoh、8m尿素、8m盐酸胍、乙醇、甲醇等具有很好的稳定性，能够提高死亡素抗菌肽的分离纯化的效率。
优选地，所述步骤s003中的结合缓冲液包括3.8mmnah2po4、16.2mmna2hpo4、50mmnacl。
优选地，所述步骤s004中使用3～6倍柱床体积的0.3m洗脱液冲洗层析柱，洗脱杂蛋白，流速为0.8～1.2倍柱床体积/min，再使用3～6倍柱床体积的0.5m洗脱液冲洗层析柱，洗脱杂蛋白，流速为0.8～1.2倍柱床体积/min，冲洗后收集洗脱液通过核酸蛋白检测其检测蛋白质吸光度，收集有蛋白吸收峰的洗脱液。
优选地，所述步骤s004中0.3m洗脱液包括3.8mmnah2po4、16.2mmna2hpo4、0.3mnacl，0.5m洗脱液包括3.8mmnah2po4、16.2mmna2hpo4、0.5mnacl。
优选地，所述步骤s004中结合缓冲液和1m洗脱液，总流速为0.8～1.2倍柱床体积/min，结合缓冲液流速比例从100%线性降低至50%，1m洗脱液流速比例从0%线性增加至50%，洗脱8～10倍柱床体积，收集洗脱液通过核酸蛋白检测器检测蛋白质吸光度，收集有蛋白吸收峰的洗脱液；更优选地，结合缓冲液和1m洗脱液，总流速为1.0倍柱床体积/min，洗脱10倍柱床体积；申请人经过大量的实验证明，选用结合缓冲液和1m洗脱液结合洗脱，并选用上述流速和洗脱体积，能够将死亡素抗菌肽和杂质蛋白很好地分离，并且控制时间不会太长；流速过快或过慢则杂质蛋白与死亡素抗菌肽难以分离，纯化效果差；洗脱液量过大，则造成不必要的浪费，洗脱液量过少，则不能够完全将死亡素抗菌肽蛋白洗脱出来，造成损失，降低产品的得率。
优选地，所述1m洗脱液包括3.8mmnah2po4、16.2mmna2hpo4、1mnacl。
以下实施例所使用的试剂，均为市售分析纯试剂，特殊说明的除外。
所使用的缓冲液和洗脱液包括：
1）结合缓冲液：3.8mmnah2po4、16.2mmna2hpo4、50mmnacl，溶解后用0.22μm过滤膜过滤。
2）1m洗脱液：3.8mmnah2po4、16.2mmna2hpo4、1mnacl，溶解后用0.22μm过滤膜过滤。
3）0.5m洗脱液：3.8mmnah2po4、16.2mmna2hpo4、0.5mnacl，溶解后用0.22μm过滤膜过滤。
4）0.3m洗脱液：3.8mmnah2po4、16.2mmna2hpo4、0.3mnacl，溶解后用0.22μm过滤膜过滤。
所使用的仪器及设备：
1）核酸蛋白检测器：型号hd-4，检测波长280nm；
2）反相高效液相色谱（rp-hplc）：shimadzudgu-20a；
3）色谱柱：agilentzorbaxsb-c18（4.6mm×250mm，5μm）；
实施例1
1）死亡素的表达：以本实验室构建的死亡素抗菌肽表达菌株（中国专利申请号：201711083981.0）进行发酵，发酵结束后，过滤或离心得到发酵上清液，死亡素抗菌肽存在于发酵上清液中。
2）发酵液脱盐：使用卷式膜脱盐，参数控制：进口压力5.0bar，出口压力4.8bar，流速100lpm；过程中多次补加水，直至脱盐液的离子强度小于13ms/cm，脱盐液用0.45um滤膜过滤，收集过滤脱盐液。
3）上柱：用10倍柱床体积的结合缓冲液平衡cm-sepharosefastflow层析柱，流速为1倍柱床体积/min，然后将过滤脱盐液上柱，流速为1倍柱床体积/min，再用5倍柱床体积的结合缓冲液冲洗层析柱。
4）梯度洗脱：使用5倍柱床体积的0.3m洗脱液冲洗层析柱，洗脱杂蛋白，流速为1倍柱床体积/min；再使用5倍柱床体积的0.5m洗脱液洗涤层析柱，流速为1倍柱床体积/min；冲柱后的洗脱液，用核酸蛋白检测器检测蛋白质吸光度，收集有蛋白吸收峰的洗脱液。
5）洗脱液脱盐：合并死亡素抗菌肽洗脱液，使用卷式膜浓缩、脱盐，直至洗脱液离子浓度小于1ms/cm。
6）冻干：收集脱盐洗脱液，冻干，制得死亡素抗菌肽纯化样品。
实施例2
1）死亡素的表达：以本实验室构建的死亡素抗菌肽表达菌株（中国专利申请号：201711083981.0）进行发酵，发酵结束后，过滤或离心得到发酵上清液，死亡素抗菌肽存在于发酵上清液中。
2）发酵液脱盐：使用卷式膜脱盐，参数控制：进口压力4.8bar，出口压力4.6bar，流速90lpm；过程中多次补加水，直至脱盐液的离子强度小于13ms/cm，脱盐液用0.45um滤膜过滤，收集过滤脱盐液。
3）上柱：用9倍柱床体积的结合缓冲液平衡cm-sepharosefastflow层析柱，流速为1.2倍柱床体积/min，然后将过滤脱盐液上柱，流速为1.2倍柱床体积/min，再用3倍柱床体积的结合缓冲液冲洗层析柱。
4）梯度洗脱：使用3倍柱床体积的0.3m洗脱液冲洗层析柱，洗脱杂蛋白，流速为1.2倍柱床体积/min；再使用6倍柱床体积的0.5m洗脱液洗涤层析柱，流速为1.2倍柱床体积/min；冲柱后的洗脱液，用核酸蛋白检测器检测蛋白质吸光度，收集有蛋白吸收峰的洗脱液。
5）洗脱液脱盐：合并死亡素抗菌肽洗脱液，使用卷式膜浓缩、脱盐，直至洗脱液离子浓度小于1ms/cm。
6）冻干：收集脱盐洗脱液，冻干，制得死亡素抗菌肽纯化样品。
实施例3
1）死亡素的表达：以本实验室构建的死亡素抗菌肽表达菌株（中国专利申请号：201711083981.0）进行发酵，发酵结束后，过滤或离心得到发酵上清液，死亡素抗菌肽存在于发酵上清液中。
2）发酵液脱盐：使用卷式膜脱盐，参数控制：进口压力5.2bar，出口压力5.0bar，流速110lpm；过程中多次补加水，直至脱盐液的离子强度小于13ms/cm，脱盐液用0.45um滤膜过滤，收集过滤脱盐液。
3）上柱：用8倍柱床体积的结合缓冲液平衡cm-sepharosefastflow层析柱，流速为0.8倍柱床体积/min，然后将过滤脱盐液上柱，流速为0.8倍柱床体积/min，再用6倍柱床体积的结合缓冲液冲洗层析柱。
4）梯度洗脱：使用6倍柱床体积的0.3m洗脱液冲洗层析柱，洗脱杂蛋白，流速为0.8倍柱床体积/min；再使用3倍柱床体积的0.5m洗脱液洗涤层析柱，流速为0.8倍柱床体积/min；冲柱后的洗脱液，用核酸蛋白检测器检测蛋白质吸光度，收集有蛋白吸收峰的洗脱液。
5）洗脱液脱盐：合并死亡素抗菌肽洗脱液，使用卷式膜浓缩、脱盐，直至洗脱液离子浓度小于1ms/cm。
6）冻干：收集脱盐洗脱液，冻干，制得死亡素抗菌肽纯化样品。
实施例4
1）死亡素的表达：以本实验室构建的死亡素抗菌肽表达菌株（中国专利申请号：201711083981.0）进行发酵，发酵结束后，过滤或离心得到发酵上清液，死亡素抗菌肽存在于发酵上清液中。
2）发酵液脱盐：使用卷式膜脱盐，参数控制：进口压力5.0bar，出口压力4.8bar，流速100lpm；过程中多次补加水，直至脱盐液的离子强度小于13ms/cm，脱盐液用0.45um滤膜过滤，收集过滤脱盐液。
3）上柱：用10倍柱床体积的结合缓冲液平衡cm-sepharosefastflow层析柱，流速为1倍柱床体积/min，然后将过滤脱盐液上柱，流速为1倍柱床体积/min，再用5倍柱床体积的结合缓冲液冲洗层析柱。
4）梯度洗脱：使用结合缓冲液和1m洗脱液洗脱层析柱，总流速为1倍柱床体积/min，结合缓冲液流出比例从100%线性降低至50%，1m洗脱液流速比例从0%线性增加至50%，洗脱10倍柱床体积；冲柱后的洗脱液，用核酸蛋白检测器检测蛋白质吸光度，分阶段收集有蛋白吸收峰的洗脱液，sds-page蛋白电泳确定死亡素抗菌肽洗脱液。
5）洗脱液脱盐：合并死亡素抗菌肽洗脱液，使用卷式膜浓缩、脱盐，直至洗脱液离子浓度小于1ms/cm。
6）冻干：收集脱盐洗脱液，冻干，制得死亡素抗菌肽纯化样品。
实施例5蛋白纯度检测
将上述实施例1～4中制备的死亡素抗菌肽分别采用rp-hplc方法进行纯度检测，具体检测方法为：
流动相a：色谱纯的乙腈中加入0.5%三氟乙酸（tfa），混匀，0.22μm过滤膜过滤，超声处理。
流动相b：去离子水中加入0.5%三氟乙酸，混匀，0.22μm过滤膜过滤，超声处理。
样品处理：取适量死亡素抗菌肽纯化样品溶于去离子水中，0.45μm过滤膜过滤后装于进样瓶中，待用。
色谱柱：agilentzorbaxsb-c18（4.6mm×250mm，5μm）；
柱温：30℃；
检测波长：280nm；
流速：1ml/min；
上样量：10μl；
流动相程序：流动相a线性梯度变化，25分钟内从10%增加至50%，相应的流动相b从90%降低至50%，总流速为1ml/min。
实施例1所述的死亡素抗菌肽的rp-hplc检测结果如图2所示，死亡素抗菌肽的保留时间是10.065min，通过峰面积比例计算蛋白纯度可知，通过本发明方案纯化得到的死亡素抗菌肽的纯度达到95%；实施例2～4的rp-hplc检测结果图与实施例1的类似，分别通过对应的峰面积计算后，得出实施例2～4的死亡素抗菌肽的纯度均达到95%；因此可得出，通过本发明所述的工艺可以提纯到纯度高的死亡素抗菌肽，适合大规模纯化。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。