本申请提供了一种编辑猪属胎儿成纤维细胞中的bmpr-ib基因方法，特别是涉及利用crispr/cas9系统对猪属胎儿成纤维细胞中的bmpr-ib基因第746位的碱基a编辑为碱基g的方法。
背景技术：
我国是世界最大的猪肉生产国和消费国，2015年，猪肉产量5671.39万吨，占全国肉类总产量的65％左右。产仔性状是养猪生产中的重要经济性状，我国现有能繁母猪4300万头，如果每头母猪平均每胎多产仔1头，则全国每年可增产近9000万头商品猪。但产仔性状的选育改良很难，丹麦花了近50年的时间才将长白猪的窝产仔数量提高了1头。
bmpr-ib基因被证明是导致booroolamerino羊的多胎性能的主效基因，其编码区a746g位点(seqidno.1的第902bp处，bmpr-ib基因cds序列为157至1665位))的g为有利等位基因，对排卵数呈加性效应。研究表明，每一个bmpr-ib有利等位基因(g)平均增加排卵数1.5～1.65个，增加产羔数0.9～1.2个；两个拷贝(gg)平均增加排卵数2.7～3.0个，增加产羔数1.1～1.7个。在表型上有利突变型booroolamerino母羊(bb)平均排卵4.65个，显著高于对照组排卵数1.62个。现有的报道表明，a746g的g有利等位基因仅在绵羊和山羊中发现，在猪等其它哺乳动物中未发现存在g有利等位基因。猪与绵羊的bmpr-ib基因cdna序列的同源性仅达到86％。
基因组编辑是指利用特异性的核酸酶，通过同源介导修复(hdr)和非同源末端连接(nhej)修复机制以实现外源dna的插入、删除或替换，从而在基因组水平对基因及其调控元件进行定向修饰的一种基因工程手段。迄今为止，成功应用于基因组编辑的特异性核酸酶包括zfn(锌指核酸酶)、talen(转录激活子样效应因子核酸酶)和crispr/cas(成簇规律间隔短回文重复序列)。最近几年呈现出爆发式发展的crispr/cas9技术因其相比zfn和talen更方便、快捷、高效和低成本。crispr/cas是一种后天性免疫系统，在约40％细菌、几乎所有的古细菌和少量噬菌体中均存在。根据crispr基因座和cas基因的不同，crispr/cas体系目前被分成i、ii和iii型，作为ii型的crispr/cas9是三类体系中结构较简单的一种。crispr/cas9基因组编辑基本原理是：靶位点特异性crrna和辅助的tracrrna形成grna(嵌合向导rna)，指引cas9蛋白切割目标区域的dna序列，目标区域为pam(原型间隔序列毗邻基序)前的grna识别序列，其中cas9的hnh结构域切割与crrna互补配对的模板链，cas9的ruvc结构域切割含有pam的链。人工改造的crispr/cas9系统将tracrrna和crrna双组分利用基因工程整合为一条链，称为sgrna(单链引导rna)；将人工设计的针对某个目的基因的sgrna序列连接在crispr/cas9质粒上，即可针对该基因开展基因组编辑工作。
技术实现要素：
本申请提供了一种编辑猪属(sus)胎儿成纤维细胞中的bmpr-ib基因方法，其包括如下步骤：
1)建立待编辑的猪属(sus)胎儿成纤维细胞；
2)确定待编辑的猪属bmpr-ib基因中与羊的bmpr-ib基因746gg相应的位点为746aa；
3)利用crispr/cas系统将所述猪属bmpr-ib基因第746位的碱基aa编辑为碱基ag或gg。
在一个具体实施方式中，在步骤3)中，所述crispr/cas系统为crispr/cas9系统，连接sgrna之前的质粒载体为px458。
在一个具体实施方式中，在步骤3)中，在待编辑的猪属胎儿成纤维细胞的染色体dna序列中确定crispr/cas9系统中使用的pam序列，将位于所述pam序列上游的17至22个碱基确定为编辑bmpr-ib基因第746位碱基的sgrna，将所述sgrna连接到所述px458上，得到px458-bmpr-ib-746g；优选所述pam序列为seqidno.2中第1206位至第1208位的ggg；更优选地，所述sgrna的序列如seqidno.3所示。
在一个具体实施方式中，在步骤3)中，所述sgrna连接到所述px458上的过程如下：
3-1-i)利用bbsi限制性内切酶对px458进行线性化，得到线性化的px458质粒；
3-1-ii)设计所述sgrna的正向引物和反向引物；所述正向引物中含有能够与所述线性化的px458质粒的粘性末端互补的bbsi限制性内切酶酶切位点的粘性末端cacc，所述反向引物中含有能够与所述线性化的px458质粒的粘性末端互补的bbsi限制性内切酶酶切位点的粘性末端aaac；将所述正向引物和反向引物退火成双链，得到sgrna双链片段；
3-1-iii)在含有连接酶的体系中将线性化的px458质粒与sgrna双链片段进行连接，得到连接产物；
3-1-iv)将所述连接产物转化到感受态大肠杆菌中，筛选出阳性连接产物px458-bmpr-ib-746g。
在一个具体实施方式中，在步骤3)中，确定与所述px458-bmpr-ib-746g配合的供体dna的序列；在所述供体dna的序列中包含bmpr-ib基因的746g以及sgrna序列，并且sgrna序列下游的3个碱基不能为pam序列，所述供体dna的其他序列与待编辑的猪属胎儿成纤维细胞的染色体dna序列一致；优选所述供体dna的序列具有300bp至3kb的长度；更优选供体dna的序列具有500bp至1000bp的长度；最优选所述供体dna的序列如seqidno.20所示，其中与所述染色体dna中的所述pam序列对应的序列为ggc。
在一个具体实施方式中，在步骤3)中，将所述px458-bmpr-ib-746g和所述供体dna序列转染到所述猪属胎儿成纤维细胞中并筛选bmpr-ib基因的746aa突变为ag杂合子或gg纯合子的阳性克隆，过程如下：
3-2-i)将0(也可以称之为原代)至3代的所述猪属胎儿成纤维细胞进行培养，培养液为包括青霉素(其用量可以为0.9wt％至1.2wt％)、链霉素(其用量可以为0.9wt％至1.2wt％)，以及体积含量18％-22％胎牛血清的高糖dmem(gibco公司，货号：11995-065)；待细胞汇合度达90％以上时，将px458-bmpr-ib-746g、供体dna、px459v2以及dna连接酶iv抑制剂scr7混合，并转染猪胎儿成纤维细胞；
3-2-ii)利用pcr测序法筛选阳性克隆。
在一个具体实施方式中，转染猪胎儿成纤维细胞所用的所述px458-bmpr-ib-746g、供体dna和px459v2的质量比为(1.8-2.2)：(1.8-2.2)：1；优选转染400-600万个猪胎儿成纤维细胞所用的所述px458-bmpr-ib-746g、供体dna和px459v2的用量依次为25μg、25μg和12.5μg。
在一个具体实施方式中，建立猪属胎儿成纤维细胞的过程如下：
1-i)从怀孕25-35天的猪属动物中分离出单个带有胎膜的胎儿，置于含青霉素(其用量可以为4.5wt％至5.5wt％)和链霉素(其用量可以为4.5wt％至5.5wt％)的dmem溶液中，
1-ii)在含有青霉素(其用量可以为4.5wt％至5.5wt％)和链霉素(其用量可以为4.5wt％至5.5wt％)的dmem溶液中下，使所述带有胎膜的胎儿与胎膜分离，并去除胎儿的头、四肢、内脏和尾巴后，得到剩余组织，将所述剩余组织清洗后，将其碎至至少2mm3，然后加入胶原酶工作液，在35℃-39℃下孵育100min至150min；
1-iii)孵育后，离心，离心后的细胞团即为0代猪属胎儿成纤维细胞；
1-iv)任选地将0代猪属胎儿成纤维细胞用dmem溶液悬浮后转入培养瓶中，在二氧化碳培养箱中培养。
在一个具体实施方式中，在步骤2)中，通过在线软件https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi确定猪属bmpr-ib基因中与羊的bmpr-ib基因746g相应的位点。
在一个具体实施方式中，在步骤2)中，通过如下步骤确定猪属bmpr-ib基因中与羊的bmpr-ib基因746gg相应的位点：
a)在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站主页左侧下拉菜单中选择gene，在右侧输入bmpr-ib，点击最右侧“search”；
b)从打开网页中分别点击编号为“id:443454”的绵羊bmpr-ib基因序列和“id:396691”的猪的bmpr-ib基因序列；
c)从“id:443454”基因序列的网页中打开编号为nm_001009431.1的羊bmpr-ib基因mrna序列；从“id:396691”基因序列的网页中打开编号为nm_001039745.1的猪bmpr-ib基因mrna序列；
d)从两段mrna序列中复制出cds序列，在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi网站中对比分析，以确定猪属bmpr-ib基因746aa与羊的bmpr-ib基因746gg相应的位点。
在本申请中，术语“上游”指的是核苷酸序列的5’端方向。例如pam序列为“ggg”(seqidno.1中的第1206位至第1208位)时，以“ggg”中的第一个“g”为0，紧邻该0位g的5端的碱基为1，依次向5’端方向编号，那么在seqidno.1中，“ggg”上游的17个碱基序列则是ttgctgcagacatcaaa。
在本申请中，术语“下游”指的是核苷酸序列的3’端方向。例如sgrna序列为“tcattgctgcagacatcaaa”(seqidno.2，seqidno.1中的第1186位至第1207位)时，以其中的最后一个碱基“a”为0，紧邻该0位的3端的碱基为1，依次向3’端方向编号，那么在seqidno.1中，其下游的3个碱基序列则是ggg。
本申请的有益效果：
本申请创造性地提出了将羊中的bmpr-ib基因的746g有利基因位点应用于猪中，将猪胎儿成纤维细胞中bmpr-ib基因的746aa位点编辑成746ga或746gg，为下一步获得携带羊bmpr-ib746g多羔位点的猪奠定了基础。
附图说明
图1显示了猪群体bmpr-ib基因a746g位点的测序结果。其中，方框表示的是野生型a746位点。
图2显示了sgrna及pam序列示意图。其中，灰色标注的为sgrna序列，横线标注的是pam序列。
图3显示了sgrna装载入px458质粒的阳性克隆测序结果。
图4显示了包含746g位点的供体dna模板pcr扩增电泳检测结果。
a：1，2，3为利用第一对长引物扩增结果，其中1，2为样本，3为水；4，5，6为利用第二对长引物扩增结果，其中4，5为样本，6为水；m1为maker1；m2为marker2。
b：1，2，3为利用第三对长引物扩增结果，其中1，2为样本，3为水；m2为marker2。
c：1，2，3，4，5，6，7为利用第四对长引物扩增结果，其中1-6为样本，7为水；m1为marker1。
图5显示了单克隆细胞中a746g位点的gg纯合子测序结果。其中，方框表示的是纯合子gg基因型。
图6显示了单克隆细胞中a746g位点的ag杂合子测序结果。其中，箭头表示的是杂合子ag基因型。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明实施例仅为示例性的说明，该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
1、猪bmpr-ib基因a746位点的检测
申请人针对11个中国地方猪种(巴马香猪、保山大耳猪、陆川猪、米猪、嘉兴黑猪、明光小耳猪、五指山猪、莱芜猪、金华猪、藏猪和中国野猪)及3个西方猪种(大白猪、长白猪和杜洛克猪)分别随机选择40个dna样本(20公20母)进行pcr检测。检测引物为a746-f(seqidno.4)和a746-r(seqidno.5)。pcr反应条件为：94℃5分钟；(94℃30秒，59℃30秒，72℃1分钟)35个循环；72℃10分钟。pcr产物经电泳检测后在3130xl测序仪上测序，结果显示，在所有检测到的560份猪dna样本中均未检测到746g等位基因，其中的一个测序样本测序结果如图1所示，包含杜洛克猪的bmpr-ib基因cds的序列如seqidno.2所示(cds序列为405至1913位)。
2、建立大白猪胎儿成纤维细胞
超净工作台用75％(体积含量)酒精充分消毒后，将所需器械、耗材逐件通过酒精消毒后放入其中，然后开紫外灭菌半小时以上。小眼科弯剪、小镊子等洗净后用锡箔纸单独包裹置于200℃烘箱中高温灭菌半小时以上。青霉素和链霉素用dmem(gibco)稀释至1×待用。取胎前，将置于-20℃的胎牛血清取出解冻后配制胶原酶工作液，其成分为含20％(体积含量)血清、1％(质量含量)青霉素和1％(质量含量)链霉素和0.1％(质量含量)胶原酶的dmem溶液。如需配制50ml胶原酶工作液，具体成分如下：10ml血清、1％(质量含量)青霉素和1％(质量含量)链霉素、39.5mldmem、0.05g胶原酶，将以上成分置于100ml灭菌后的量筒中用磁力搅拌器搅拌约1.5小时，然后用0.22μm滤膜于超净工作台上过滤备用。
将配种怀孕30天左右的大白母猪处死后剖开、取出整个子宫，在50ml灭菌离心管中配制15ml含5wt％青霉素和5wt％链霉素的dmem溶液(14.25mldmem+0.75ml)，用于保存胎儿，每个50ml离心管中保存一个胎儿。在超净工作台内从左往右摆放6个10cm培养皿，在第3、4、5个培养皿中加入含5wt％青霉素和5wt％链霉素的pbs溶液5ml，将装在50ml离心管中的胎儿连同dmem溶液倒入第1个培养皿中，用镊子将胎膜撕开，使胎儿与胎膜剥离；将胎儿转入第2个培养皿中，用镊子和剪刀将胎儿头、四肢、内脏、和尾巴去除；在第3、4、5个培养皿中将胎儿剩余部分清洗干净；在第6个培养皿中将胎儿剩余部分剪碎至约1mm3，随后加入5ml胶原酶工作液；将组织块转移至15ml的离心管中，用封口膜封口后置于37℃摇床中孵育2小时。之后，将离心管于1000rpm离心5分钟；用10mldmem溶液(含10％(体积含量)血清和1wt％青霉素和1wt％链霉素)将离心后的细胞团溶解后均匀转入两个t75培养瓶后转入二氧化碳培养箱。继续培养至第二天早上，在显微镜下观察细胞贴壁情况，在开始培养后的约第20个小时，更换新的dmem细胞培养液。
冻存：移除t75培养瓶中的dmem细胞培养液，用pbs清洗两次，胰酶消化3分钟；加入10-20ml含10％(体积含量)血清的dmem细胞培养液终止消化，将离心管的细胞培养液上清吸除，加入细胞冻存液2-3ml(具体根据需冻存的份数，一般0.8-1.0ml/管；冻存液配方，dmem：fbs：dmso＝7：2：1)，冻存液现配现用。冻存管应详细标注细胞系种类、代数、时间信息等，冻存细胞转入冻存管后放入冻存盒中，置于-80℃冰箱中过夜，之后转入液氮长期保存。
3、针对猪bmpr-ib基因的crispr/cas9打靶载体的构建
申请人首先从美国addgene质粒库(http://www.addgene.org/crispr/)购入px458穿刺菌质粒(编号：48138)。从穿刺菌中挑取少量菌落于250mllb液体培养基(每升lb液体培养基中含有10克蛋白胨、5克酵母提取物、10克nacl和30毫克氨苄霉素)中、于37℃摇床培养过夜。通过qiagen
申请人利用麻省理工学院张锋实验室所开发的sgrna序列在线设计软件http://crispr.mit.edu，针对猪bmpr-ib基因的cds序列、包含746a等位基因(seqidno.2的第1150bp处)的位置设计sgrna序列，从中选择5′-tcattgctgcagacatcaaa-3′(seqidno.3，位于seqidno.2中第1186至1205位)为sgrna序列，pam序列为ggg(图2)。为了使sgrna序列装载入px458质粒中，根据该质粒的结构特点，申请人订购了sgrna的正向引物(seqidno.6)和反向引物(seqidno.7)。
px458质粒dna的酶切：在60μl反应体系中含1×nebbuffer3、30单位的bbsi内切酶(neb，美国)和5μgpx458质粒dna，于55℃水浴中温浴2小时。酶切产物于1wt％琼脂糖凝胶中电泳，将约9kb的片段割胶后用
50ng纯化的px458质粒dna与1.0μl50nmol/l的双链sgrna在200单位t4dnaligase(neb，美国)的作用下，于10μl体系中连接，连接反应在16℃的pcr仪中持续16个小时。取5μl连接后的质粒dna导入trans5a感受态细胞(全式金，中国)中，将转化细胞涂抹在固体lb(每升lb固体培养基中含有10克蛋白胨、5克酵母提取物10克nacl、12克琼脂粉和30毫克氨苄霉素)平板上，于37℃培养箱培养过夜。将10个克隆分别挑出置于10μl的lb培养液中，针对这些克隆点利用f1和r1进行菌落pcr，其中，sgrna鉴定引物f1如seqidno.8所示，sgrna鉴定引物r1如seqidno.9所示。pcr反应体系如下：25μl体系中含1×buffer，2.5mmol/lmgcl2，0.2mmol/ldntp(takara)，1×q-solution，0.4μmol/l上下游引物，2.5ur-taq(takara)，基因组dna50ng。pcr反应条件：94℃5min；(94℃30s，65℃(-0.5℃/循环)30s，72℃1min)26个循环；(94℃30s，55℃30s，72℃1min)14个循环；72℃10min。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测其片段大小，将片段大小正确的送测序。测序结果(图3)表明，sgrna成功装载入px458质粒中，获得阳性克隆。将阳性克隆加入5mllb培养液中，于37℃摇床培养过夜后；再取100μl菌液于250mllb培养液中，于37℃摇床培养过夜后，利用endofreeplasmidmaxikit大抽试剂盒提取打靶质粒dna。
4、包含746g位点的供体dna的制备
crispr/cas9基因组编辑的同源重组修复模板可以是线性化的双链dna、环状的双链dna和单链寡核苷酸(ssodn)。本申请采用的是线性化的双链dna作为同源重组修复模板，利用重叠延伸pcr(桥连pcr)的方法扩增获得含有746g突变位点的供体dna的模板。
首先，利用引物f2(seqidno.10)和r2(seqidno.11)进行利用常规的pcr检测大白猪胎儿成纤维细胞及普通大白猪bmpr-ib基因打靶sgrna两侧的序列。pcr反应体系如下：25μl体系中含1×buffer，2.5mmol/lmgcl2，0.2mmol/ldntp(takara)，1×q-solution，0.4μmol/l上下游引物，2.5ur-taq(takara)，基因组dna50ng。pcr反应条件：94℃5min；(94℃30s，68℃(-0.5℃/循环)30s，72℃1min)26个循环；(94℃30s，55℃30s，72℃1min)14个循环；72℃10min。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测其片段大小，将片段大小为653bp的送测序。经测序分析，如seqidno.2所示的序列中的第1208位(即pam序列的第三个碱基处)为易突变位点。为保证sgrna不引导cas9蛋白去切割供体dna，在此，选取该位点突变为c的大白猪个体作为重叠延伸pcr首轮pcr的模板样本(即在该个体样本中，与pam序列对应的序列为ggc)。
然后，利用重叠pcr获得供体dna的模板：利用引物f3(seqidno.12)和r3(seqidno.13)以及上述seqidno.2中第1208位突变为c的大白猪个体的dna作为模板，进行第一轮pcr上游片段的扩增，其中引物r3第22个碱基c为与待编辑为746g的互补碱基。pcr反应体系如下：50μl体系中含1×buffer，2.5mmol/lmgcl2，0.4mmol/ldntp(takara)，1×q-solution，0.4μmol/l上下游引物，4ur-taq(takara)，基因组dna1000ng。pcr反应条件：94℃2min；98℃10s，68℃3min35个循环；72℃10min；4℃保存。电泳图见图4a。利用引物f4(seqidno.14)和r4(seqidno.15)以及上述seqidno.2中第1208位突变为c的大白猪个体的dna作为模板，进行第一轮pcr下游片段的扩增，其中引物f4(seqidno.14)第16个碱基g为待编辑为746g的碱基。pcr反应体系与反应条件与第一步一致。电泳图见图4a。
将第一轮pcr的上游片段和下游片段产物按1：1混合作为第二轮pcr的模板，第二轮pcr的引物为f5(seqidno.16)和r5(seqidno.17)。pcr反应体系与反应条件与第一步基本一致(仅延伸时间设为4.5min)。电泳图见图4b。
最后，为了获得较短片段的供体dna，以上述第二轮pcr的扩增产物为模板，利用引物f6(seqidno.18)和r6(seqidno.19)再次进行pcr扩增，pcr反应体系如下：50μl体系中含1×buffer，2.5mmol/lmgcl2，0.2mmol/ldntp(takara)，1×q-solution，0.4μmol/l上下游引物，2.5ur-taq(takara)，模板(pcr产物)1μl。pcr反应条件：94℃5min；(94℃30s，68℃(-0.5℃/循环)45s，72℃2min)26个循环；(94℃30s，55℃45s，72℃2min)14个循环；72℃10min。电泳图见图4c。最终，利用qiaquickpcrpurificationkit试剂盒纯化回收含有746g位点的供体dna(seqidno.20，其中，第479为即为供体dna中的746g位点)。
5、携带746g位点的猪胎儿成纤维细胞的筛选
利用电转法转染打靶质粒dna于猪胎儿成纤维细胞中。转染前一天，将p0(原代)代的猪成纤维细胞接种至10cm细胞培养皿中培养，培养液为含20％(体积含量)胎牛血清和1wt％青霉素和1wt％链霉素的高糖dmem(gibco)。第二天上午，待细胞汇合度达90％以上时，将25μg的打靶质粒dna转染入猪胎儿成纤维细胞中，同时在电转缓冲液中加入25μg纯化后的746g供体dna模板、12.5μgpx459v2空质粒(携带puromycin抗性基因)以及dna连接酶iv抑制剂scr7(xcessbio，美国)至终浓度为1μm。电转仪为：btxecl2000，美国；电转条件为：200v，1毫秒，3个脉冲，1次重复。由于cas9蛋白切割dna双链后，发生非同源末端连接(nhej)修复的概率远远大于同源介导修复(hdr)，而scr7可以抑制nhej的发生、提高hdr发生的概率；因此，加入scr7可以增加模板与dna双链发生同源重组的概率。
电转结束后，将细胞接种至一个新的10cm细胞培养皿中培养，6小时后更换新的细胞培养液，并加入scr7至终浓度为1μm。转染36小时后，更换新的细胞培养液，并加入puromycin至终浓度为3.5μg/ml，次日继续换液并加入相同终浓度的puromycin。经puromycin筛选两天后，胰酶消化并收集猪胎儿成纤维细胞，利用血细胞计数板计算细胞回收液中的细胞密度。之后用有限稀释法将细胞密度稀释成10个/1ml、20个/1ml、30个/1ml、40个/1ml、50个/1ml、60个/1ml六个梯度，将不同密度的细胞分装在10cm细胞培养皿(每皿的细胞培养液体积为10ml)中，最后将10cm皿置于培养箱中培养。培养三天后，将所有的10cm皿换液，并随机挑选几个皿置于荧光倒置显微镜下，观察皿中的单克隆细胞群；10cm皿中单克隆细胞群继续在培养箱中培养4-5天，然后观察皿中的每个单克隆细胞群的细胞数量是否增加。将长势较好的10cm皿中的单克隆细胞群逐一分离下来，继续在24孔板培养(每一个单克隆细胞群置于24孔板的一个孔中)。待24孔板中细胞的汇合度达95％及以上，每孔取出2/3的细胞置于6孔板中继续培养，剩余1/3的细胞(微量细胞)用于后续的打靶检测。利用细胞裂解液(含1％(体积含量)的np40、10μg/μl的蛋白酶k)提取微量细胞dna，裂解程序为：56℃1h，95℃10min。6孔板中的细胞长满后经胰酶消化、收集后冻存，冻存液配方为含10％(体积含量)dmso的胎牛血清。
针对裂解的微量细胞dna开展pcr检测，检测引物为f7(seqidno.21)和r7(seqidno.22)。pcr反应体系如下：25μl体系中含1×buffer，2.5mmol/lmgcl2，0.2mmol/ldntp(takara)，1×q-solution，0.4μmol/l上下游引物，2.5ur-taq(takara)，微量细胞dna100ng。pcr反应条件：94℃5min；(94℃30s，68℃(-0.5℃/循环)30s，72℃1min)26个循环；(94℃30s，55℃30s，72℃1min)14个循环；72℃10min。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测其片段大小，将片段大小正确的送测序。测序结果显示，在筛选到的113个单克隆中，有7个单克隆为746g的gg纯合子(图5)，有6个单克隆为a746g的ag杂合子(图6)，其余100个单克隆为野生型或基因敲除的突变型克隆。
虽然本发明已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本发明的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本发明的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的这些改变均包括在本发明的权利要求的范围内。
y序列表
<110>江西农业大学
<120>一种编辑猪属胎儿成纤维细胞中的bmpr-ib基因方法
<130>lha1760656
<160>22
<170>siposequencelisting1.0
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<211>3255
<212>dna
<213>羊(ovisaries)
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