本发明涉及一种菠萝acwrky28基因及其超表达载体的构建及其在基因工程中的应用，更具体地涉及到了该菠萝基因在拟南芥抗核盘菌基因工程中的应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术：
植物生长、发育和对环境应答是其特定的遗传系统和所处的环境条件相互作用下通过复杂的生理生化过程实现的，总是受到较为严密的调控，并最终使植物在特定的环境下获得最大的生存和繁衍的机会。植物在应答各种逆境，特别是生物逆境的时候，其体内一系列防御反应的基因都会被激活，如钙信使系统、植物内源激素、磷酸激酶系统、转录因子等组成的信号传导。这些防御反应是植物生长、发育和适应环境调控的重要环节，植物细胞可感知外界环境各种信息并进行信号的整合、传递，最终将信号传递进入细胞核调节相关基因的表达，使植物产生有利于其生存和传衍的生理生化反应。
菠萝（ananascomosus）是典型的重要的热带亚热带水果之一，在世界约有61个国家和地区有栽培。菠萝在生产上具有比较强的抗干旱和抗病能力，病虫害的发生相对比较的少。因此，可以从菠萝中分离并克隆抗病相关的基因应用于其他植物或者作物上，改善植物的抗病性具有很重要的利用价值。植物参与抗病的基因有很多，例如，类受体蛋白激酶基因，膜定位相关受体蛋白，钙信使相关蛋白以及转录因子。但是，人们对菠萝抗病基因的应用还是很少的。
鉴于wrky基因在植物抗病信号的中间过程，起着信号放大的作用，能够将外界的信号逐级的放大并传递下去，从菠萝中分离克隆wrky基因和功能分析是深入了解菠萝抗病机理及通过基因工程技术进行其他植物或作物遗传改良的前提。
自从在植物体内发现wrky基因以来，已经有越来越多的研究表明，wrky基因在植物体内参与很多抗逆方面的信号途径，并在这些信号途径中起着很重要的作用。前人很多报道都是在拟南芥、水稻以及马铃薯等模式植物中，在菠萝上的报道还没有。我们所分离的这个wrky基因在拟南芥中超表达可以明显的增强对拟南芥对核盘菌的抗性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种菠萝acwrky28基因在拟南芥抗核盘菌基因工程中的应用，将大力促进拟南芥抗核盘菌基因工程的发展与应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的菠萝acwrky28基因，该基因至少含有如seqidno.1所示的核苷酸序列。所述菠萝acwrky28基因编码的蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。
含有所述基因载体的构建方法如下：
将菠萝acwrky28基因cdna与camv35s启动子核心序列融合，构建成acwrky28的超表达载体。所述的camv35s启动子核心序列为cgaccgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggac。所述菠萝acwrky28基因cdna是从菠萝叶片的cdna文库中分离获得的基因。
所述的基因在拟南芥抗核盘菌基因工程中的应用。将所述超表达载体转化eha105农杆菌，采用花序法侵染拟南芥的花序得到转基因拟南芥，可提高转基因拟南芥对核盘菌的侵染的抗性。
本发明的优点在于：
本发明的菠萝acwrky28在拟南芥中的超表达与野生型拟南芥相比显著提高转基因拟南芥的抗核盘菌能力，含此基因的突变体在植物抗核盘菌基因工程中具有十分重要的应用价值。
附图说明
图1为菠萝acwrky28中的保守功能域。
图2为菠萝acwrky28与其它wrky基因家族成员的系统发育树。
图3-1为入门载体penter。
图3-2超表达载体pwgb502。
图4为菠萝acwrky28转基因植株与野生型植株对核盘菌抗性的比较。
具体实施方式
实施例1
1载体构建过程
1.1材料
菠萝品种为本实验室保存的md2金菠萝，由福建农林大学海峡联合研究院实验室保存；拟南芥col-0品种由福建农林大学海峡联合研究院实验室保存；菠萝叶片cdna为福建农林大学海峡联合研究院实验室构建（根据invitrogen公司试剂盒上的说明操作），试剂盒购自美国invitrogen公司。pcr相关dntp、taq酶、pcrbuffer购自大连takara公司产品，反转录及real-timepcr试剂盒购自大连takara公司。庆大霉素、卡那霉素、利福平、羧卞青霉素等为sigma公司产品。其它化学试剂均为国产化学纯。
1.2方法
1.2.1菠萝acwrky28候选基因的分离
首先根据菠萝已经测序的cdna序列设计引物，引物序列为p1：5’-caccatgtcacaagagagaggagag-3’；p2：5’-tcatggttgattttggtgaatg-3’。然后采用pcr技术进行序列的克隆，测序结果表明，该cdna阳性克隆的长度为1011bp，含有1个长度为336个氨基酸的开放读码框(seqidno.2所示）。
blastp搜索结果表明，该cdna阳性克隆的推定氨基酸序列中含有所有保守的wrkygqk功能域，与其它植物中所鉴定的wrky蛋白的同源性高达41%以上（图1），将该cdna阳性克隆暂命名为acwrky28。在同源进化树上可以看出，我们分离的acwrky28与油棕的egwrky28和芭蕉mawrky28的同源性比较的高（图2）。
1.2.2菠萝acwrky28基因超表达载体构建
本发明采用penter连接和gateway技术(walhoutetal.,2000),构建双子叶植物转基因用超表达载体。
首先根据penter载体构建技术设计并合成特异引物acwrky28-f:5’-caccatgtcacaagagagaggagag-3’；acwrky28-r:5’-tcatggttgattttggtgaatg-3’。然后根据pcr扩增程序,pcr扩增程序程序如下：
预变性2min95℃1cycle
变性15s94℃
退火30s55℃
延伸1min72℃35cycles
延伸10min72℃
琼脂糖凝胶电泳检测条带质量并胶回收纯化pcr产物。
然后通过penter反应体系将目的基因克隆到入门载体penter（见图3-1）上形成入门克隆，penter-acwrky28，测序检测目的基因序列无误后，再通过lr反应体系将目的基因克隆转移到超表达载体pgwb502（如图3-2），这样也就将目的基因克隆于ti质粒的camv35s启动子下游，形成含目的基因的超表达载体，可实现其在转基因植株内的超表达,最后参照分子克隆指南将含目的基因的超表达载体进一步转化eha105农杆菌，以备用于烟草遗传转化。penter连接反应体系：
pcrproducts100ng（1.0μl）
vector(penter)30-50ng（0.25μl）
solutioni0.25μl
total1.5μl
25℃温浴过夜，反应结束后加入蛋白酶k，37℃消化10min，将反应产物转化dh5α感受态细胞。
lr反应体系：
entryclone50-100ng（0.5μl）
destinationvector100ng（0.5μl）
lrenzymemix0.25μl
total1.25μl
25℃温浴过夜，反应结束后加入蛋白酶k，37℃消化10min，将反应产物转化dh5α感受态细胞。
拟南芥转基因植株的获得与抗性分析
2.1拟南芥遗传转化及t2代转基因种子的收获
(1)挑取单菌落接种于5mllb液体培养基(含50mg/lrif和100mg/lspec)中，28℃200rmp/min振荡培养过夜；(2)取2ml菌液转入100mllb液体培养基(含50mg/lrif和100mg/lspec)，28℃200rmp/min振荡培养至od600值为1.0-1.5左右；(3)6000rmp/min，离心10min，弃上清；(4)1ml5%蔗糖溶液悬浮，6000rmp/min，离心2min，弃上清；(5)重复步骤4；(6)加入5%蔗糖溶液重悬菌体，至od600值为0.4-0.7左右；(7)浸泡前按0.05%体积比加入silwet77表面活性剂；(8)浸泡前浇水，并将已经结的荚剪去，将花苞浸泡于上述溶液中1min；(9)将植株倒置，黑暗培养24h，取出，正常生长培养。在含潮霉素（100mg/l）的ms培养基上筛选抗性小苗，并对抗性小苗的基因组dna进行pcr检测，以确定潮霉素筛选的可靠性。获得一系列的转基因株系，其中得到acwrky28转基因植株27株。所有的acwrky28株系均用套袋自交收获t1代转基因种子。将t1代的阳性植株播种并收获t2代转基因种子，利用t2代转基因种子进行转基因拟南芥表型分析与功能鉴定。
菠萝acwrky28参与调控植物病原菌防御反应过程
本发明应用核盘菌（现保存于福建农林大学海峡联合研究院实验室）对acwrky28转基因和野生型对照进行核盘菌接种实验，2天后发现acwrky28转基因拟南芥相对于野生型对照表现出对病原菌侵染的明显抗性，在acwrky28转基因拟南芥接种部位产生较强的过敏反应坏死斑（图4）。说明acwrky28基因超表达可显著提高转基因拟南芥对核盘菌的侵染的抗性。
结果
本发明发现菠萝acwrky28基因超表达可显著提高转基因拟南芥对核盘菌的侵染的抗性，该基因在植物抗核盘菌基因工程中具有十分重要的应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
sequencelisting
<110>福建农林大学
<120>一种菠萝acwrky28基因及其超表达载体的构建和应用
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<213>菠萝acwrky28的核苷酸序列
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