一种用于点突变检测的回形LNA探针及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于点突变检测的回形lna探针及其应用。

背景技术：

聚合酶链式反应(pcr)技术是一种简单快捷、高灵敏、特异的基因扩增方法，其过程通常包括20-50个由变性、退火和延伸三步反应构成的循环。可以在1.5-3小时内特异地扩增靶核酸序列至几百万倍。近年来，由于实时pcr仪的出现使普通pcr不再需要凝胶电泳分析，从而不必pcr后操作，杜绝了pcr污染。因此实时pcr技术在临床上应用越来越广泛。实时荧光pcr检测技术中应用最广泛的是标记荧光的核酸探针，例如5'-核酸外切酶技术中使用的taqman探针、分子信标等。

随着分子诊断产业的发展，已经从早期的病原体检测、单靶基因检测发展到了多靶基因检测，肿瘤基因突变检测等方面。伴随着精准医疗概念的提出和发展，药物基因多态性检测、肿瘤基因突变伴随诊断检测试剂为代表的单碱基突变检测试剂成为了时下最热门的分子诊断试剂类型。单碱基突变检测方法有arms-pcr、mgb探针、lna探针等方法，而这些方法在应用中很难完全消除野生型模板对突变型的干扰，造成一定程度的假阳性扩增。造成检测特异性不够、突变检测灵敏度不高的情况，难以满足现阶段临床需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于点突变检测的回形lna探针及其应用，解决了检测特异性不够、突变检测灵敏度不高的情况，难以满足现阶段临床需求。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于点突变检测的回形lna探针，该探针为一段长度为25~30bp的寡核苷酸；该寡核苷酸的5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，在中间的一个碱基上做lna标记。

具体的，所述的探针为一段与待测靶基因互补的长度为25~30bp的寡核苷酸，5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团；5’端6~8个碱基和探针中间段互补，包含单碱基突变位点。结构如图1，在探针游离于反应体系中时，探针自身5’端与中间位置互补形成环形结构。

所述回形lna探针在单碱基突变检测中的应用，用于点突变检测时，探针覆盖点突变位置，且突变位置处于探针的中间，在探针上点突变位置的碱基上做lna标记。

在检测突变模板时，探针结合到模板上；由于探针序列与模板序列完全匹配，探针二级结构完全打开，在扩增的过程中taq酶从5’端将探针水解，发出荧光信号。

在检测野生模板时，探针结合到模板上；由于探针中标记lna的碱基和野生模板不匹配，探针二级机构不能完全打开，扩增时taq酶无法水解探针，taq酶没有内切酶活性，不会发出荧光信号。

当体系中存在突变模板时，探针通过碱基互补配对的方式完全匹配于模板序列上，探针自身二级结构打开，结构如图2。这时，引物延伸到探针位置时根据taq酶的外切酶活性，从5’端开始水解探针，使发光基团与淬灭基团分开，从而发出荧光。

当体系中只存在野生模板时，由于在探针中点突变位点碱基与模板碱基不匹配，而探针中的这个位点做了lna标记，导致探针自身环状互补的稳定性远大于探针与野生模板的匹配，探针结构如图3。这时，引物延伸到探针位置时，由于探针5’端没能与模板结合，taq不能将探针水解，发光基团与淬灭基团没有分开，无法检测到荧光。

根据探针的这种特性，能够将突变模板和野生模板区分开来。

本发明的优点在于：1、提高单碱基突变检测特异性；2、提高混合模板中突变型模板的检出率。

发明的有益效果：1、本发明适用于单碱基突变检测，设计简单有效，适用于市面上主流的检测平台；2、本发明提高突变检测特异性，对药物基因多态性检测结果更加准确，提高药物治疗效果；3、本发明提高突变检测灵敏度，为肿瘤药物的伴随诊断及疗效检测提供解决方案。

附图说明

图1回形lna探针结构图。

图2回形lna探针与突变模板结合结构图。

图3回形lna探针与野生模板结合结构图。

图4野生纯合型样本检测结果。

图5突变纯合型样本检测结果。

图6突变杂合型样本检测结果。

图7纯野生型样本检测结果。

图8纯突变型样本检测结果。

图910%突变混合型样本检测结果。

图101%突变混合型样本检测结果。

图110.1%突变混合型样本检测结果。

具体实施方式

实施例一：回形lna探针系统用于人cyp2c9基因多态性的检测

人体内代谢药物的主要酶是细胞色素p450家族(cytochromep450proteins,cyp)，它们是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，多位于细胞内质网上，催化多种内、外源物质的（包括大多数临床药物）代谢。p450酶能通过非共价键结合的血红素中的铁离子传递电子氧化异源物，增强异源物质的水溶性，使它们更易排出体外。

cyp有多个亚家族，其中cyp2c9（cytochromep4502c9）是第二亚家族中的一个重要成员，占肝微粒体p450蛋白总量的20%。cyp2c9能羟化代谢许多不同性质的药物，主要是酸性底物。据统计，目前约有16%的的临床药物由cyp2c9负责代谢。

cyp2c9有多种突变型，而cyp2c9*3是第二常见的突变型别，为7号外显子上1075位发生a>c突变。野生型纯合（cyp2c9*1*1）基因频率约为92.3%、突变型纯合（cyp2c9*3*3）基因频率约为3.3%、突变型杂合（cyp2c9*1*3）基因频率约为4.4%。

为考察回形lna探针系统应用在snp位点检测的有效性，分别检测野生纯合型、突变纯合型、突变杂合型样本。反应体系总体积为50μl，包括10μl5×buffer(100mmtris-hclph8.8、0.1％w/vtritonx-100、15mmmgcl2、600mmkcl)，每种dntp200μm，上下游引物0.3μm，探针0.15μm，2.0utaqdna聚合酶，5μl模板dna。实时pcr反应在bio-radcfx96实时荧光定量pcr仪上进行。反应条件为：95℃预变性10min，随后95℃15s，60℃40s，40个循环。

回形lna探针系统包含一对引物及两条探针，扩增片段长度为265bp，序列如下：

上游引物：5'-tgtgattggcagaaaccgga-3'

下游引物：5'-tatgcacttctctcacccgg-3'

野生型探针：fam-5'-tgtatctcacgaggtccagagataca（lna）ttga-3'-bhq1

突变型探针：hex-5'-ggtacctcaggtccagaggtacc（lna）ttgacct-3'-bhq1

结果分析说明：

1、对于野生纯合型样本，只有野生型探针有产生荧光信号，而突变型探针没有产生荧光信号，说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增；

2、对于突变纯合型样本，只有突变型探针有产生荧光信号，而野生型探针没有产生荧光信号，说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增；

3、对于突变杂合型样本，其突变型模板和野生型模板的比例为1：1，所以突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号。

附图如下：

图4，野生纯合型样本检测结果，野生型探针显示有扩增，而突变型探针显示无扩增；

图5，突变纯合型样本检测结果，野生型探针显示无扩增，而突变型探针显示有扩增；

图6，突变杂合型样本检测结果，野生型探针显示有扩增，而突变型探针显示有扩增；

本实施例针对野生纯合型和突变纯合型的样本，回形lna探针都未产生非特异性扩增，而不论arms引物法、mgb探针法等传统方法都会产生非特异性扩增。

实施例二：回形lna探针系统用于人类egfr基因t790m突变的检测

表皮生长因子受体（egfr）位于人类7号染色体上，由30个外显子组成，是原癌基因erbb1的表达产物。egfr主要通过两条途径将信号传递至细胞核，一条是ras→raf→mek→erk途径；另一条是pi3k→akt→mtor途径。当信号传导至细胞核后，引起核内基因转录水平的增加，使细胞增殖、转化。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（egfr-tkis）是针对egfr靶点的小分子抑制剂，多项临床试验已证实，egfr突变的晚期nsclc患者能从egfr-tkis显著获益。然而，大部分患者在服用egfr-tkis一段时间后会出现耐药，其中约50%耐药患者可检测到egfr20号外显子t790m突变。目前肿瘤组织样本仍是获取肿瘤基因相关信息的主要来源，但大部分晚期肺癌患者已失去手术机会或由于种种原因不能获取肿瘤组织样本。研究发现，肺癌患者的外周血中存在来源于凋亡、坏死的肿瘤细胞的游离dna。同时，外周血中循环肿瘤dna与配对肿瘤组织样本的egfr突变状态具有较高的一致率。因此，外周血样本也可用于肺癌患者egfr20号外显子t790m突变状态的检测。在外周血样本中检测egfr20号外显子t790m突变状态，可以预测患者服用egfr-tkis治疗的疗效。在egfr-tkis治疗过程中也可以连续、动态监测egfr20号外显子t790m突变状态变化，用于指导患者的治疗。egfr20号外显子t790m突变与靶向药物用药相关性主要来自国内外文献报道，并得到临床治疗的普遍认可。本试剂盒未与药物联合进行临床试验，仅针对egfr20号外显子t790m突变的检测性能进行验证。结果仅供临床参考，不可作为诊治的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其他实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。

为考察回形lna探针系统应用在单碱基突变检测的有效性，分别检测纯野生型模板、纯突变型模板、不同突变比例模板（10%，1%，0.1%）。反应体系总体积为50μl，包括10μl5×buffer(100mmtris-hclph8.8、0.1％w/vtritonx-100、10mmmgcl2、600mmkcl、5％w/v甲酰胺)，每种dntp200μm，上下游引物0.3μm，探针0.15μm，3.0utaqdna聚合酶，5μl模板dna。实时pcr反应在bio-radcfx96实时荧光定量pcr仪上进行。反应条件为：95℃预变性10min，随后95℃15s，60℃40s，40个循环。

回形lna探针系统包含一对引物及两条探针，扩增片段长度为265bp，序列如下：

上游引物：5'-gatgaagcctacgtgatggc-3'

下游引物：5'-cacacaccagttgagcaggt-3'

野生型探针:fam-5'-gtgatgagtgcagctcatcac（lna）gcagctca-3'-bhq1

突变型探针:hex-5'-atgatgagtgcagctcatcat（lna）gcagctca-3'-bhq1

结果分析说明：

1、对于纯野生型样本，只有野生型探针有产生荧光信号，而突变型探针没有产生荧光信号，说明突变型探针对野生型模板不会产生非特异性扩增；

2、对于纯突变型样本，只有突变型探针有产生荧光信号，而野生型探针没有产生荧光信号，说明野生型探针对突变型模板不会产生非特异性扩增；

3、对于不同突变比例为10%的样本，其突变型模板和野生型模板的比例为1：10，所以突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号且ct值差异大约为3.3；

4、对于不同突变比例为1%的样本，其突变型模板和野生型模板的比例为1：100，所以突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号且ct值差异大约为7；

5、对于不同突变比例为0.1%的样本，其突变型模板和野生型模板的比例为1：1000，所以突变型探针和野生型探针都产生了荧光信号且ct值差异大约为10。

附图7，纯野生型样本检测结果，野生型探针显示有扩增，而突变型探针显示无扩增；

图8，纯突变型样本检测结果，野生型探针显示无扩增，而突变型探针显示有扩增；

图9，10%突变混合型样本，野生突变均有扩增，ct值差异约为3.3；

图10，1%突变混合型样本，野生突变均有扩增，ct值差异约为7；

图11，0.1%突变混合型样本，野生突变均有扩增，ct值差异约为10；

本实施例回形lna探针能能够成功检测出突变含量为0.1%的混合型样本，而传统的arms方法只能做到1%的检出比例。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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<110>嘉兴雅康博贝南生物科技有限公司

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