本发明属于微生物领域和环境保护领域。具体地说，本发明涉及一种耐盐纤维素降解菌剂及其方法与应用。
背景技术：
由于新疆三分之一土地为盐碱土壤，渠水等水源含盐量很高，在盐碱环境下高浓度盐碱离子对常规纤维素降解菌活性有强烈抑制作用，使玉米秸秆沼气发酵中存在着糖化效率大大降低，产气量少，因此筛选适应盐碱地区的高效耐盐纤维素降解菌十分必要。因此本发明针对西北地区玉米秸秆浪费严重、渠水水源盐度高、秸秆沼气产量低等问题，以沼液为样品，采用生物技术等方法筛选玉米秸秆耐盐高效纤维素降解菌株，利用纤维素降解菌添加到秸秆发酵池中提高秸秆发酵效率。
技术实现要素：
本发明针对盐碱境下沼气池中玉米等农作物秸秆降解困难，降解时间长的问题，提供一种适合盐碱地区沼气池的复合微生物秸秆降解菌剂，促进秸秆的快速降解并起到提高发酵效率目的。
本发明第一个目的是提供一种耐盐纤维素降解菌剂。
本发明耐盐纤维素降解菌剂的活性成分包括蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)、斯氏假单孢菌(pseudomonasstutzeri)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)中的任两种或三种；优选至少包括蜡样芽孢杆菌和斯氏假单孢菌两种菌；更优选同时包括上述三种菌。
进一步地，上述耐盐纤维素降解菌剂中蜡样芽孢杆菌、斯氏假单孢菌、枯草芽孢杆菌的菌体重量比为(1-3):(1-3):(0-2)。
进一步地，上述耐盐纤维素降解菌剂中总有效活菌数为1.8×109-7×109cfu/g，优选为2×109-6×109cfu/g。
在本发明一个具体实施方式中，所述耐盐纤维素降解菌剂的活性成分为蜡样芽孢杆菌、斯氏假单孢菌，二者的菌体重量比为1:1；且所述耐盐纤维素降解菌剂中总有效活菌数为2.5×109-5×109cfu/g。
在本发明另一个具体实施方式中，所述耐盐纤维素降解菌剂的活性成分为蜡样芽孢杆菌、斯氏假单孢菌和枯草芽孢杆菌，三者的菌体重量比为2:2:1；且所述耐盐纤维素降解菌剂中总有效活菌数为3×109-6×109cfu/g。
在本发明另一个具体实施方式中，所述耐盐纤维素降解菌剂的活性成分为蜡样芽孢杆菌、斯氏假单孢菌和枯草芽孢杆菌，三者的菌体重量比为3:3:2；且所述耐盐纤维素降解菌剂中总有效活菌数为2×109-4×109cfu/g。
本发明所述耐盐纤维素降解菌剂能够应用于盐含量0-3％的沼液，并能表达高效降解性。研究发现，在沼气发酵过程中，当秸秆添加量为100-300g时，所述耐盐纤维素降解菌剂添加量为10-30g，降解15d，秸秆降解率为40％-61％。
本发明所用蜡样芽孢杆菌、斯氏假单孢菌、枯草芽孢杆菌均为已知菌种，均可市售购得。
本发明第二个目的是提供上述耐盐微生物菌剂的制备方法，包括取蜡样芽孢杆菌、斯氏假单孢菌、枯草芽孢杆菌菌剂，按本领域常规方法配制即可。
优选地，上述耐盐微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)、斯氏假单孢菌(pseudomonasstutzeri)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)分别接种于na固体培养基上进行活化；
2)用接菌环取平板上的上述活化后的菌落分别接种于相应的液体发酵培养基中，在温度20-40℃、180-220rpm条件下震荡培养24-72小时至对数生长期，获得液体菌剂种子液；
3)将上述种子液放大培养后得到浓度适宜的菌液，高速离心后收集菌体制备成干粉状的菌剂，按所需的比例混合，即为本发明所述的耐盐纤维素降解菌剂。
其中na固体培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨5g，酵母浸膏2g，葡萄糖8g，琼脂粉16g，去离子水1l，ph＝7.0；液体发酵培养基配方是：nacl0.1g，mgso4·7h2o0.3g，nano32.5g，kh2po41.0g，cacl20.1g，纤维素20g·l-1，加去离子水至1l，ph＝7.0。
本发明的第三个目的是提供上述耐盐纤维素降解菌剂在降解纤维素等方面中的应用。所述纤维素的来源包括玉米秸秆、大豆秸秆、棉花秸秆、小麦秸秆、高粱秸秆等。
研究发现，本发明耐盐纤维素降解菌剂特别适合于沼液降解玉米秸秆，可使玉米秸秆的降解率达到61％。
本发明所用原料均可市售购得，或按本领域常规方法制备。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供一种耐盐纤维素降解菌剂，该菌剂能够在高盐条件下快速分解纤维素和半纤维素，从而能够进一步准确的计算秸秆降解率和产气率。本发明提供的耐盐纤维素降解菌剂协同能力强，从而提高了高盐沼气池秸秆降解的效率，为秸秆沼气发酵提供了关键的预处理技术。本发明微生物复合菌剂适应北方高盐碱地区，能够在较高盐度0-3％环境下应用，具有秸秆降解率高，沼气产气量高等特点。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
将蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)、斯氏假单孢菌(pseudomonasstutzeri)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)分别接种于na固体培养基上进行活化；用接菌环取平板上的菌落分别接种于相应的液体发酵培养基中，在温度20℃、180rpm条件下震荡培养24小时至对数生长期，获得液体菌剂种子液；将上述种子液放大培养后得到浓度较高的菌液，高速离心后收集菌体制备成干粉状的菌剂，分别制得蜡样芽孢杆菌、斯氏假单孢菌、枯草芽孢杆菌菌剂。
本实施例还提供一种耐盐纤维素降解菌剂，其活性成分为蜡样芽孢杆菌、斯氏假单孢菌，二者的菌体重量比为1:1；且所述耐盐纤维素降解菌剂中总有效活菌数为2.5×109-5×109cfu/g。
应用本实施例耐盐纤维素降解菌剂进行沼气发酵，沼液含盐量为3％。当玉米秸秆添加量为300g，上述耐盐纤维素降解菌剂添加量为10g，降解15d，玉米秸秆降解率为40％；当玉米秸秆添加量为200g，上述耐盐纤维素降解菌剂添加量为20g，降解15d，玉米秸秆降解率为47％。
实施例2
将蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)、斯氏假单孢菌(pseudomonasstutzeri)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)分别接种于na固体培养基上进行活化；用接菌环取平板上的菌落分别接种于相应的液体发酵培养基中，在温度30℃、200rpm条件下震荡培养48小时至对数生长期，获得液体菌剂种子液；将上述种子液放大培养后得到浓度较高的菌液，高速离心后收集菌体制备成干粉状的菌剂，分别制得蜡样芽孢杆菌、斯氏假单孢菌、枯草芽孢杆菌菌剂。
本实施例还提供一种耐盐纤维素降解菌剂，其活性成分为蜡样芽孢杆菌、斯氏假单孢菌和枯草芽孢杆菌，三者的菌体重量比为2:2:1；且所述耐盐纤维素降解菌剂中总有效活菌数为3×109-6×109cfu/g。
应用本实施例耐盐纤维素降解菌剂进行沼气发酵，沼液含盐量为3％，玉米秸秆添加量为200g，上述耐盐纤维素降解菌剂添加量为20g，降解15d，玉米秸秆降解率为61％。
实施例3
将蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)、斯氏假单孢菌(pseudomonasstutzeri)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)分别接种于na固体培养基上进行活化；用接菌环取平板上的菌落分别接种于相应的液体发酵培养基中，在温度40℃、220rpm条件下震荡培养72小时至对数生长期，获得液体菌剂种子液；将上述种子液放大培养后得到浓度较高的菌液，高速离心后收集菌体制备成干粉状的菌剂，分别制得蜡样芽孢杆菌、斯氏假单孢菌、枯草芽孢杆菌菌剂。
本实施例还提供一种耐盐纤维素降解菌剂，其活性成分为蜡样芽孢杆菌、斯氏假单孢菌和枯草芽孢杆菌，三者的菌体重量比为3:3:2；且所述耐盐纤维素降解菌剂中总有效活菌数为2×109-4×109cfu/g。
应用本实施例耐盐纤维素降解菌剂进行沼气发酵，沼液含盐量为3％。当玉米秸秆添加量为100g，上述耐盐纤维素降解菌剂添加量为30g，降解15d，玉米秸秆降解率为58％；当玉米秸秆添加量为200g，上述耐盐纤维素降解菌剂添加量为20g，降解15d，玉米秸秆降解率为53％。
对比例1
蜡样芽孢杆菌菌剂，其有效活菌数为4×109-8×109cfu/g。
对比例2
斯氏假单孢菌，其有效活菌数为1×109-2×109cfu/g。
对比例3
枯草芽孢杆菌菌剂，其有效活菌数为4×109-8×109cfu/g。
实验例1
分别应用实施例1-3及对比例1-3菌剂进行沼气发酵，以不添加任何微生物菌剂为空白对照，沼液含盐量为3％，降解15d，玉米秸秆降解率及产气量见下表1。
表1
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。