用于蛋白酶检测的多肽功能化磁球及比色检测法的制作方法

本发明涉及蛋白酶检测，特备涉及一种用于蛋白酶检测的多肽功能化的磁球及检测方法，属于化学领域。

背景技术：

蛋白酶能够水解蛋白质或多肽中的肽键。它在消化吸收、创口愈合、功能免疫等方面具有决定性作用。一些重大疾病的发生与蛋白酶的含量和活性变化密切相关，例如，癌症、细胞凋亡、阿尔茨海默病、艾滋病等等。因此，蛋白酶检测在这些重大疾病的诊断和治疗研究等方面具有重要意义。目前用于检测蛋白酶的方法主要有高效液相色谱、凝胶色谱、质谱、荧光光谱和电化学等，但高效液相色谱、凝胶色谱、质谱需要特殊的仪器、灵敏度较低、分析成本较高。荧光光谱和电化学法往往需要对酶基底（通常是多肽）两端进行标记、耗时耗力；此外，多肽两端被标记后有可能会影响酶催化切割的效率。介于蛋白切割反应在研究生命活动及疾病防治中的重大作用，建立一种低成本、简单快速、适于在一般实验室或临床中监控蛋白酶含量或活性变化的方法是当前研究的热点之一。

可视化检测分析法是利用被测溶液本身的颜色（或加入试剂后呈现的颜色），用眼睛(或目测比色计)观察、比较溶液颜色深度，或用光电比色计进行测量以确定溶液中被测物质浓度的方法。这种方法具有分析成本低、检测速度快、不需要特殊仪器等优点，适用于高通量分析。金纳米粒子具有较高的摩尔吸光吸收，近年来，基于金纳米粒子颜色变化的比色分析在金属离子、蛋白质、核酸和生物小分子的检测、药物筛选和环境监控等方面表现出了广阔的应用前景。具有特定序列的多肽在被蛋白酶切割前（或后），可以引起金纳米粒子团聚而变色，基于这一原理可以实现蛋白酶的比色分析。然而，这种检测方法往往需要对多肽序列进行精心设计，例如，在多肽序列中同时引入特定的氨基酸（如半胱氨酸和带正电荷的氨基酸等）。然而，半胱氨酸容易被氧化、且容易和蛋白酶中的二硫键反应而影响蛋白酶的活性。此外，生物基质样品中的一些成分（比如核酸、蛋白质、巯基化合物、无机盐等）容易吸附到金纳米粒子表面，从而影响金纳米粒子的稳定性，对多肽诱导金纳米粒子颜色变化的实验具有较大的干扰性；一些生物基质样品（如血液）自身的颜色和紫外吸收也严重影响了蛋白酶的可视化检测。因此，开发一种简单灵敏、抗干扰能力强、高通量的比色分析方法，用于蛋白酶可视化分析检测是十分必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服目前的蛋白酶检测中存在的上述问题，提供一种用于蛋白酶检测的多肽功能化磁球及比色检测法。

为实现本发明的目的，采用了下述的技术方案：用于蛋白酶检测的多肽功能化磁球，包括磁球，在磁球外包裹有一层金，在金上固定有多肽，所述的多肽的序列特征是：能够被对应的蛋白酶切割，且切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸，碳末端的5个氨基酸是ppppc。

用于蛋白酶检测的比色检测法，采用上述的多肽功能化磁球，包括以下步骤：

a：多肽功能化的磁球的制备：将多肽加入到金包裹的磁球中，所述的多肽的序列特征是：能够被对应的蛋白酶切割，且切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸，碳末端的5个氨基酸是ppppc，混合震荡4-6小时，磁力分离，用二次水洗涤再加入巯基己醇溶液，继续震荡一段时间后磁力分离，用乙醇洗涤，得到多肽功能化的磁球；

b：蛋白酶的检测：向多肽功能化的磁珠中加入待检测的蛋白酶的醋酸或磷酸缓冲溶液，反应20~60分钟，采用磁铁进行分离，用二次水洗涤，弃掉上层清液；然后加入含硫酸铜的磷酸缓冲溶液，混合震荡，再加入抗环血酸的磷酸缓冲溶液，震荡反应；磁力分离，取出上层清液，加入含十六烷基三甲基氯化铵的磷酸缓冲溶液，再慢慢滴加氯金酸水溶液，用肉眼观察溶液颜色变化或者用分光光度计测定溶液在530nm处的吸收值。

进一步的，所述的金包裹的磁球采用以下方法制备：

（1）带正电荷的金胶溶液的制备：以硼氢化钠为还原剂、巯基乙胺为稳定剂，将巯基乙胺水溶液，加入到氯金酸溶液中，震荡20分钟，再缓慢滴加新制备的硼氢化钠水溶液，继续震荡1-3小时左右，溶液逐渐从浑浊黄棕色呈透明酒红色，停止震荡，即得到带正电荷的金胶溶液，于4℃下保存备用；

（2）金胶-磁球复合物的制备：即将步骤（1）中制备得到的金胶溶液加入到混合均匀的磁球溶液中，避光温和震荡反应，用磁铁进行分离，去除上层清液，再次加入金胶溶液，重复上述操作，直至加入的金胶溶液不再褪色为止；

（3）金包裹的磁球的制备：将聚乙烯醇、双氧水和氯金酸混合溶液，加入到步骤（2）的金胶-磁球复合物中，避光温和震荡12小时，磁力分离，用二次水洗涤3次，即得到金包裹的磁球。

本技术发明的优点与效果如下：(1)将多肽固定于磁球表面，采用磁铁对蛋白酶切割后的溶液进行分离，有利于避免生物基质样品中其它成分的干扰；(2)通过抗坏血酸还原氯金酸，原位形成红色的aunps溶液，建立用于蛋白酶检测的比色分析方法，具有简单灵敏、直观、高通量、不需要特殊仪器等优点，该技术的研制成功将实现不同类型蛋白酶的检测。

附图说明

图1是针对不同浓度β-分泌酶的紫外吸收值。

图2是该分析方法的选择性。

图3是该方法对caspase-3检测的线性曲线。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供本发明的实施实例。这些实施实例仅仅是对该工艺的阐述，不限制本发明的范围，本发明中用以下实施例说明，但不限于下述实施例，任何变化实施都包含在本发明的技术范围内。

本发明中多肽的序列特征是：能够被对应的蛋白酶切割，对应的蛋白酶即所要检测的蛋白酶，且切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸，碳末端的5个氨基酸是ppppc。以下实施例以β-分泌酶和caspase-3为例进行具体阐述。对附图进一步的解释，图1是溶液在530nm处的紫外吸收值与β-分泌酶浓度之间的关系，β-分泌酶的浓度依次是0,1,5,10,25,50,75,100,125nm。图2是生物基质中不同成分对紫外吸收值的影响，从1到11依次对应的是：空白实验，50ng/ml的牛血清蛋白，50ng/ml的凝血酶，50ng/ml的胰蛋白酶，10μm的淀粉样肽，10μm的多巴胺，50μm的尿酸，10μm的还原型谷胱甘肽，50μm的抗坏血酸，10%的血清，75nm的β-分泌酶。图3是该方法对不同浓度的caspase-3检测的响应情况，caspase-3的浓度依次是0,0.5,1,10,25,50,75,100,150ng/ml。本发明中金包裹的磁球在目前的文献技术中具有成熟的技术方案。

实施例1：多肽功能化的磁球的制备：

（1）带正电荷的金胶溶液的制备：该金胶的制备采用的还原剂为硼氢化钠，保护剂为巯基乙胺，具体操作如下：取73μl的213mm的巯基乙胺水溶液，加入到7.3ml的1.42mm的氯金酸水溶液中，在振荡器上以3000转/分钟的转速震荡20分钟，完全混合，溶液称棕褐色；再将转速调至500转/分钟，保证溶液不从离心管内溅出，缓慢滴加5μl的10mm新制备的硼氢化钠水溶液，滴加完后，盖上离心管盖，迅速将转速调至3000转/分钟，震荡1-3小时左右，溶液逐渐从浑浊黄棕色呈透明酒红色，停止震荡，即得到带正电荷的金胶溶液，4℃下保存备用；

（2）金胶-磁球复合物的制备：取200μl已震荡混匀的磁球溶液于离心管中，加入3ml步骤（1）制得的带正电的金胶溶液，避光温和震荡反应，用磁铁放在离心管的底部，弃除上层清液，再次加入金胶溶液，反复重复上述操作3~5次，直至加入的金胶溶液不再褪色，最后用磁铁进行分离，弃除上层清液；

（3）金包裹的磁球的制备：将2~4ml包含0.01%wt聚乙烯醇、4.4mm双氧水和2.1mm氯金酸混合溶液，加入到步骤（2）得到的金胶-磁球复合物中，避光温和震荡12小时以上，磁力分离，弃除上层清液，用二次水洗涤三次，即得金包裹的磁球（au-mmbs）。

（4）多肽功能化的磁球的制备：将0.5ml1mm的多肽ac-evnldahfwadrppppc（或ac-gdevdsghgppppc）加入到50mg步骤（3）得到的au-mmbs中，混合震荡4-6小时，磁力分离，用二次水洗涤三次；再加入1ml1mm的巯基己醇溶液，继续震荡15分钟，磁力分离，用乙醇洗涤三次，弃除上层清液，即得到多肽ac-evnldahfwadrppppc（或ac-gdevdsghgppppc）功能化的磁球。

实施例2：β-分泌酶的检测

分别向4mg多肽ac-evnldahfwadrppppc功能化的磁球中加入0.5ml包含不同浓度β-分泌酶的醋酸缓冲溶液（2mm,ph4.5），反应20分钟左右，采用磁铁进行分离，用二次水洗涤3次，弃掉上层清液；然后加入0.15ml包含3.2μm硫酸铜的磷酸缓冲溶液（10mm,ph7.2），混合震荡1分钟后，加入0.15ml包含400μm抗环血酸的磷酸缓冲溶液，震荡反应30分钟；磁力分离，取出上层清液0.25ml，加入0.2ml包含0.5mm十六烷基三甲基氯化铵的磷酸缓冲溶液，再慢慢滴加50μl2mm氯金酸水溶液。最后用肉眼观察溶液颜色变化，或者用分光光度计测定溶液在530nm处的吸收值。图1是针对不同浓度β-分泌酶的紫外吸收值，从图中可以看出，β-分泌酶的浓度越大，溶液在530nm处的吸收值越大，该吸收值是由溶液中生成的aunps产生的，表明根据生成的aunps的吸收强度变化，可以测定β-分泌酶的浓度，线性范围是1~75nm，当β-分泌酶的浓度高于5nm时，用肉眼即可观察到溶液颜色的变化，采用分光光度计可以检测到1nmβ-分泌酶，表明该方法可以用于β-分泌酶的比色分析检测。

实施例3：选择性

步骤参照实施例2步骤，将步骤（2）中β-分泌酶换成待测试的物质，其他的步骤条件不改变，实验结果如图2。从图中可以看出，只有β-分泌酶能够导致溶液变为红色，其它物质（包括血清）没有引起溶液颜色变为红色，这些物质引起的紫外吸收值变化可以忽略不计，表明该方法对β-分泌酶的检测具有较好的选择性。另外，测试结果表明，β-分泌酶在血清中的测定值与在缓冲溶液中的测定值基本一致，表明该方法适用于血清样品分析。

实施例4：caspase-3的检测

分别向4mg多肽ac-gdevdsghgppppc功能化的磁球中加入0.5ml包含不同浓度caspase-3的磷酸缓冲溶液（10mm,ph7.4），反应60分钟左右。其它步骤和实验条件与实施例2中β-分泌酶的检测一致。结果表明，caspase-3的浓度越大，溶液的颜色越红，当caspase-3浓度大于1ng/ml时，用肉眼即可观察到溶液颜色的变化。图3是针对不同浓度caspase-3的紫外吸收值，从图中可以看出，吸收值随着caspase-3的浓度增加而增大，线性范围是0.5~50ng/ml，检测限是0.2ng/ml。当采用实施例2中的多肽功能化的磁球进行对照实验时，没有发现溶液红色和吸收值发生明显变化，这是因为实施例2中的多肽不能够被caspase-3切割。因此，将磁球表面的多肽换成ac-gdevdsghgppppc后，该方法可以用于caspase-3的比色分析检测。如果将磁球表面的多肽换成对某一蛋白酶特异响应的多肽片段，该方法可以用于相应蛋白酶的检测。

本发明的机理探讨：抗坏血酸能够将氯金酸还原成纳米金（aunps），从而形成红色溶液，但铜离子可以催化抗坏血酸的氧化，不利于aunps的形成，当磁珠表面的多肽没有被蛋白酶切割时，多肽功能化的磁珠不能够抑制铜离子催化抗坏血酸的氧化，故不利于aunps的形成；但当磁珠表面的多肽被蛋白酶切割之后，保留在磁珠表面的多肽片段dahfwadrppppc（或sghgppppc）将会络合铜离子，形成的铜离子络合物不能够催化抗坏血酸的氧化，因此，溶液中的抗坏血酸能够将氯金酸还原，形成红色的aunps溶液。采用肉眼或者分光光度计即可监测这一变化过程。具体技术方案为：向多肽功能化的磁珠中加入不同浓度的蛋白酶溶液，反应20~60分钟，磁力分离，用二次水洗涤3次，弃掉上层清液；然后加入硫酸铜溶液，混合震荡1分钟后，加入抗坏血酸溶液，震荡反应30分钟；磁力分离，取上层清液加入到含十六烷基三甲基氯化铵溶液中，再慢慢滴加氯金酸溶液。最后用肉眼观察溶液颜色变化，或者用分光光度计测定溶液在530nm处的吸收值。

在详细说明本发明的实施方式之后，熟悉该项技术的人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围，且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。

序列表

<110>安阳师范学院

<120>用于蛋白酶检测的多肽功能化磁球及比色检测法

<160>2

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