本发明属于生命科学应用领域，是一种抗衰老活性分子。尤其是此活性分子——多球壳菌素用于裂殖酵母细胞抗衰老。
背景技术：
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多球壳菌素(2-氨基-3，4-二羟基-2-羟甲基1-14-氧-6-二十烯酸)，英文名：myriocin，分子量为401.54，分子式c21h39no6，易溶于甲醇，乙醇，dmso，不溶于水和大多数有机溶剂，储存于-20℃，是昆虫病原真菌冬虫夏草的代谢物，又名isp-1，同时具有免疫抑制和抗真菌两种特性，能潜在的调控哺乳动物免疫体系同时降低真菌感染风险，能预防和治疗多种疾病，包括ii型糖尿病，心血管疾病，代谢综合症等。多球壳菌素能够特异性抑制鞘脂合成第一步限速反应酶—丝氨酸棕榈转移酶(spt)的活性，降低鞘脂前体物鞘氨醇的生物合成，通过多球壳菌素处理降低鞘脂合成，能够影响一些寿命调控相关的信号通路如降低torc1活性，激活mapk，pka等，改变胞内转录组，引起相关基因的上调和下调，进而影响一系列寿命相关的细胞过程包括增强压力抗性、基因组稳定性、线粒体功能、自噬及糖代谢等，最终延长芽殖酵母细胞的寿命。鞘脂作为一个重要的化学治疗药物靶点，在寿命调控中发挥着重要的作用，多球壳菌素能够特异性抑制鞘脂合成，延长芽殖酵母细胞生命，或许能够延长其他哺乳动物寿命，甚至人类寿命，降低衰老及衰老相关疾病的发生。
在过去的十几年里，酵母作为材料在衰老研究中发挥重要作用，其中芽殖酵母作为研究的先驱者对阐明衰老分子机制，理解细胞衰老，以及发现新的长寿基因十分有用，它已经被证明，无论是在研究复制寿命上还是时序寿命上，均是一个非常高效的模式生物，人们已经利用它发现了许多衰老相关机制(包括衰老相关基因及衰老相关的信号通路)。重要的是，这些基因被多次证明在多细胞真核生物中是保守的。裂殖酵母是最近新出现的一个用于衰老研究的十分有用的杆状单细胞真核生物，无论是形态学上还是遗传学上，均与现在普遍使用的芽殖酵母有很大的不同。相较于芽殖酵母，它有许多独特的优势。它与哺乳动物共享着一些在芽殖酵母中没有的细胞过程，包括rnai干扰机制、核结构蛋白和染色质结合蛋白以及着丝粒结合蛋白、mrna剪接机制、线粒体基因组对生存的需求。所以，裂殖酵母作为一个独特的模式系统可以用来发现新的长寿调控途径，同时兼具芽殖酵母的优点，如便捷的基因组修改和大批量的生长和分析。此外，在裂殖酵母中wis4/wis1/sty1压力响应通路是依赖于mitogen-activatedprotein(map)kinases，这类似于哺乳动物压力响应激活mapkinasesp38和jnk。裂殖酵母与芽殖酵母亲缘关系较远，进化上更接近于人类，拥有许多与人类同源的基因，这为研究人类疾病和衰老的分子机制提供了一些优势。
目前已经发现，白藜芦醇(reseveratrol)、雷帕霉素(rapamycin)、亚精胺(spermidine)等可以有效抑制细胞衰老，达到延长寿命的目的。白藜芦醇是一种在红酒中发现的多酚类化合物，可激活sir2，能延长多个物种(包括酵母、线虫、果蝇等)的寿命；雷帕霉素是一种大环内酯类抗生素，能够特异性抑制tor的活性，延长酵母、线虫、果蝇及小鼠等的寿命；亚精胺是一种天然存在的多胺，可调控多种不同的细胞过程，包括dna稳定性、转录、翻译及细胞凋亡，延长酵母、线虫、果蝇的寿命。本发明专利证实多球壳菌素(myriocin)可以显著延长裂殖酵母寿命，是一种新的抗衰老活性分子。
技术实现要素：
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鉴于现有抗衰老活性分子的匮乏及其广阔的应用前景，本发明专利的目的是提供一种新的抗衰老活性分子。
本发明的目的是通过如下的手段实现的。
一种抗衰老活性分子——多球壳菌素，将多球壳菌素用于裂殖酵母细胞抗衰老检测，发现其显著的延缓细胞衰老效应。包括以下步骤：
a)步骤包含如下具体工艺：
从艾露生物科技有限公司购买固体多球壳菌素5mg/瓶，品牌certificateofanalysis，加入5ml95％的乙醇，瓶子一次装不下5ml液体，可分3次或4次加入后，将其转入15mlep管，使瓶中不残留固体粉末，65℃恒温水浴锅加热3-5min，使其充分溶解，得到1mg/ml的储液，取1.5mlep管，加入95％的乙醇600μl，加入1mg/ml的储液400μl，混匀，得到400μg/ml的储液，将得到的储液存放于-20℃保存，使用时，若发现有白色不溶物析出，可于65℃恒温水浴加热3min使其充分溶解，呈澄清无色液体，再行使用；
b)步骤包含如下具体工艺：
从-80℃取出所需的裂殖酵母菌株，接种于yes固体平板上，30℃培养2-3天，yes培养基成分为：葡萄糖30g/l；酵母提取物5g/l；组氨酸，丝氨酸，亮氨酸，尿嘧啶，腺嘌呤各225mg/l；固体平板需加20g/l琼脂，液体培养基不加琼脂；挑取3-4个菌落于装有2.5mlyes液体培养基的带棉塞的大试管中培养过夜，试管型号20mm×20cm，得到饱和过夜培养液；配制yes液体培养基，分装于2只150ml三角瓶中，每瓶装25mlyes培养基，121℃，20min灭菌；向盛有25ml已灭菌的yes液体培养基的150ml三角瓶中加入37.5μl的400μg/ml的多球壳菌素储液，使其终浓度为600ng/ml，另一瓶加入37.5μl的95％的乙醇，轻微振荡混匀；稀释饱和过夜培养液加入到2只盛有25ml已灭菌的yes培养基的150ml三角瓶中，保证起始浓度为1×105cells/ml，即od600＝0.01，此步需要测定饱和过夜培养液的od600，方法如下，在超净工作台中，取已灭菌1.5mlep管加入900μl无菌水，再从三角瓶中用移液器吸出100μl细胞培养液于900μl无菌水中，即将培养液稀释10倍，用分光光度计测定稀释后的菌液od600，得到的od600值乘以相应的稀释倍数即10倍得到过夜培养液的od600；置于恒温振荡培养箱中，30℃，220rpm培养，在特定时间点测定其存活率，2天后即48h记为clsday1，开始检测存活率；
c)步骤包含如下具体工艺：
在超净工作台中，取已灭菌的1.5mlep管，加入900μl无菌水，再从三角瓶中用移液器吸出100μl细胞培养液于900μl无菌水中(即将培养液稀释10倍)，用分光光度计测定稀释后的菌液od600，乘以稀释倍数得到菌液od600；取0.5od600的菌液5000rpm离心3min，用无菌水洗一次后加入1ml无菌水，加入1mg/ml的phloxinb储液，使其终浓度为5μg/ml；于30℃摇床避光温育2h；用1×pbs(137mmnacl；2.7mmkcl；100mmna2hpo4；2mmkh2po4；ph7.4)将细胞洗3次，将细胞混匀后用移液器吸取7μl于载玻片上，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下检测(荧光显微镜型号olymposix71)，于绿色激发光下激发红色荧光，拍照，红色细胞为死细胞。同时在白色光场视野下拍照，白色光场下的细胞为总细胞数，包含死活细胞，统计死活细胞比例，计算出存活率。
采用本发明，具有应用前景广阔、应用成本低、功效好等优点。
具体实施方式：
实施例1：多球壳菌素对细胞生长的抑制效应
在yes固体平板上活化裂殖酵母972h-，30℃，培养3天；配制10ml液体yes培养基于50ml的三角瓶中，121℃，20min灭菌待用；配制5×25ml的yes液体培养基分装于5个150ml的三角瓶中，121℃，20min灭菌待用；挑取2个单克隆于10mlyes中，30℃过夜培养，测定其od600，将过夜培养液取一定体积加入到事先已配好并灭菌的25ml的yes液体培养基中，使得加入后od600＝0.05，加入的过夜培养液体积由测定的od600(2.0-3.0之间)计算出来；将400μg/ml的myriocin储液加入到装有25ml的yes液体培养基的5个三角瓶中混匀，使得加入后的myr终浓度为0，150，300，600，1200ng/ml；测定不同时间点(0，6，12，18，24，30，36h)的od600；绘制出各个浓度下的生长抑制曲线；
实施例2：克隆计数法(cloningformingunits，cuf)显示多球壳菌素延缓细胞衰老
在超净工作台中，从三角瓶中取出相同体积的菌液于1.5mlep管中，稀释相同的倍数，如稀释105倍则可以按如下操作进行：取20μl菌液于980μl无菌水中，混匀后再从中其50μl加入到950μl无菌水中，涂10μl菌液于yes平板上，可于yes平板上加90μl无菌水，再将10μl菌液加在里面，便于涂布平板，不同测定的时间点的菌液稀释倍数不同，以保证在平板上长处适量的菌落数，以免太多不便计数或太少造成误差，稀释倍数需进行预实验摸索；将菌液稀释涂布平板以后，置于恒温培养箱中30℃，3天，待其长出菌落，统计其数量，将clsday1的菌落数记为100％，其它时间点的菌落数相较于clsday1则可以计算出存活率；
实施例3：染色法显示多球壳菌素延缓细胞衰老
在超净工作台中，取已灭菌1.5mlep管加入900μl无菌水，再从三角瓶中用移液器吸出100μl细胞培养液于900μl无菌水中，即将培养液稀释10倍，用分光光度计测定稀释后的菌液od600，得到的od600值乘以相应的稀释倍数即10倍，得到特定时间点的培养液的od600；取0.5od600的菌液5000rpm离心3min，用无菌水洗一次后加入1ml无菌水，加入1mg/ml的phloxinb储液，使其终浓度为5μg/ml；于30℃摇床避光温育2h；用1×pbs将细胞洗3次，将细胞混匀后用移液器吸取7μl于载玻片上，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下(荧光显微镜型号olymposix71)，于绿色激发光下激发红色荧光，拍照，红色细胞为死细胞。同时于在白色光场视野下拍照，白色光场下的细胞为总细胞数，包含死活细胞，统计死活细胞比例，计算出存活率。