本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种生产棘白菌素类抗真菌药物米卡芬净的中间体fr901379的发酵培养基以及方法。
背景技术：
：棘白菌素类是近年来新上市的一种抗真菌药物，能抑制真菌细胞壁的β-1,3-d-葡萄糖合成酶，由于哺乳动物细胞缺乏β-1,3-d-葡萄糖合成酶，故该类化合物对真菌细胞具有高度的特异性，能迅速杀灭真菌而对人体正常细胞影响较小，因而疗效好，安全性高。目前已上市的此类药物有：卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。fr901379是菌株coleophomaempetri的发酵产物。通过对fr901379进行一系列结构修饰改造可得到棘白菌素类抗真菌药物米卡芬净（micafungin）。米卡芬净（micafungin）由日本藤泽公司开发，于2002年12月在日本上市，商品名为fungusrd，2005年3月通过美国fda认证，目前被批准用于治疗食道念珠菌感染、骨髓移植及ads患者中性粒细胞减少症的预防治疗。fr901379米卡芬净usp5502033、ep0431350a1公布了使用coleophomaempetrif-11899发酵生产fr901379的过程，发酵培养基包含基本的碳氮源、无机盐，单位100mg/l。cn201010571797.2公开了一种使用coleophomaempetrif-11899发酵生产fr901379的培养基，优化了碳源和有机氮源，单位提高到300~400mg/l。但现行的发酵生产fr901379的技术中，仍然存在由于发酵液中丝状菌的生长特性，发酵液黏度过高，氧传递效果较差，溶氧偏低，从而抑制了菌体次级代谢，导致fr901379发酵单位偏低的问题。发明人经过广泛而深入的研究，优化了发酵生产fr901379的培养基及其方法。采用本发明的发酵培养基及其方法生产fr901379，可以显著降低发酵液粘稠度，改善发酵过程中的溶氧状况，同时促进菌体次级代谢，fr901379的产量较高，单位达到2.8~3.5g/l。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种发酵生产fr901379的培养基及其方法，旨在提高fr901379单位产量。本发明使用的菌株来源为coleophomaempetrif-11899。本发明是这样实现的，一种用于菌株coleophomaempetri发酵生产fr901379的培养基，包含按以下质量份计各组分：果糖120~160份玉米蛋白粉10~20份干酪素5~10份酵母蛋白胨5~10份硫酸镁1~3份磷酸氢二钾0.5~1份碳酸钙2~4份消泡剂0.5~1份优选地，包含按以下质量份计各组分：果糖140份玉米蛋白粉15份干酪素7.5份酵母蛋白胨7.5份硫酸镁2份磷酸氢二钾0.75份碳酸钙3份消泡剂1份本发明还进一步提供了一种发酵生产fr901379的方法，发酵所用培养基为上述培养基，包含在发酵过程中补加按以下质量份计各组分：果糖80~120份双氧水0.5~1.5份所述的在发酵过程中补加按以下质量份计的80~120份果糖、0.5~1.5份双氧水，其特征在于，在发酵72至96小时间开始补加，补加时间为48至72小时；补加方式为连续型，控制补加量，持续不间断的补加。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明所述的发酵过程中，首先将coleophomaempetri菌种在种子培养基中培养。所述的种子培养基可以使用本领域常规使用的液体培养基,优选所述种子培养基包含葡萄糖10g/l、可溶性淀粉30g/l、棉籽饼粉20g/l、干粉玉米浆5g/l、磷酸氢二钾2g/l、碳酸钙3g/l、消泡剂1g/l。配制适量的种子培养基，120℃灭菌30min后冷却至24-26℃，按种子培养基体积比0.5~1%的接种量接入48h种龄的摇瓶种子，然后24-26℃培养48h。发酵过程中通过hplc检测fr901379发酵单位，色谱条件如下：测定柱：c18柱，4.6mm×250mm×5um柱温：40℃流动相为乙腈:0.05mol/l磷酸二氢钠水溶液=50:50（v/v），采用等度洗脱，流速为1.0ml/min检测器为dad或vwd，测定波长210nm；溶样溶剂为甲醇，进样浓度为500ug/ml，进样量为20ul，运行时间为30min。fr901379主峰的保留时间tｒ=13.28min，理论塔板数n=6979。用外标法测定其浓度或含量。实施例1将培养好的种子以3%比例转入30l的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(l)比为：果糖130、玉米蛋白粉17、干酪素8、酵母蛋白胨8、硫酸镁2、磷酸氢二钾0.75、碳酸钙3、消泡剂1，其余为水。发酵过程中温度24-26℃，通气量1vvm，初始转速150rpm，过程中调控转速150~600rpm之间使溶氧不低于20%。将果糖配制成500g/l水溶液120℃灭菌30min后待用,双氧水稀释为30%水溶液待用。发酵90h开始，将果糖和双氧水分别补加到发酵罐中，补加方式为连续不间断补加，138h停止补加，过程中控制补加量使总的补加质量(g)/发酵体积(l)比为果糖80、双氧水0.5。发酵周期为8天，测定fr901379放罐浓度为3.2g/l。实施例2将培养好的种子以3%比例转入300l的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(l)比为：果糖140、玉米蛋白粉15、干酪素7.5、酵母蛋白胨9、硫酸镁2、磷酸氢二钾0.8、碳酸钙3、消泡剂1，其余为水。发酵过程中温度24-26℃，通气量1vvm，初始转速80rpm，过程中调控转速80~250rpm之间使溶氧不低于20%。将果糖配制成500g/l水溶液120℃灭菌30min后待用,双氧水稀释为30%水溶液待用。发酵80h开始，将果糖和双氧水分别补加到发酵罐中，补加方式为连续不间断补加，152h停止补加，过程中控制补加量使总的补加质量(g)/发酵体积(l)比为果糖120、双氧水1.3。发酵周期为8天，测定fr901379放罐浓度为3g/l。实施例3将培养好的种子以2.5%比例转入3000l的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(l)比为：果糖150、玉米蛋白粉20、干酪素7.5、酵母蛋白胨5、硫酸镁2、磷酸氢二钾0.6、碳酸钙3、消泡剂0.7，其余为水。发酵过程中温度24-26℃，通气量1vvm，初始转速60rpm，过程中调控转速60~200rpm之间使溶氧不低于20%。将果糖配制成500g/l水溶液120℃灭菌30min后待用,双氧水稀释为30%水溶液待用。发酵76h开始，将果糖和双氧水分别补加到发酵罐中，补加方式为连续不间断补加，136h停止补加，过程中控制补加量使总的补加质量(g)/发酵体积(l)比为果糖100、双氧水1.2。发酵周期为8天，测定fr901379放罐浓度为3.3g/l。实施例4将培养好的种子以2%比例转入12000l的120℃灭菌30min后冷却至24-26℃的发酵培养基中，该发酵培养基组成，质量(g)/体积(l)比为：果糖140、玉米蛋白粉10、干酪素6、酵母蛋白胨7、硫酸镁2、磷酸氢二钾0.5、碳酸钙3、消泡剂0.5，其余为水。发酵过程中温度24-26℃，通气量1vvm，初始转速50rpm，过程中调控转速50~180rpm之间使溶氧不低于20%。将果糖配制成500g/l水溶液120℃灭菌30min后待用,双氧水稀释为30%水溶液待用。发酵72h开始，将果糖和双氧水分别补加到发酵罐中，补加方式为连续不间断补加，144h停止补加，过程中控制补加量使总的补加质量(g)/发酵体积(l)比为果糖120、双氧水1.5。发酵周期为8天，测定fr901379放罐浓度为3.4g/l。当前第1页12