本发明属于农副产品高附加值加工利用技术领域，具体涉及一种以低温压榨核桃粕为原料工业化生产高纯度核桃肽的方法。
背景技术：
核桃是世界四大干果之一，因其丰富的营养价值受到国内外消费者的喜爱。每100克核桃仁中含脂肪63～70％(主要为不饱和脂肪酸，约占其总量的90％)，蛋白质15～29％，糖类15％；另外，还含有钙、磷、铁、锌、镁、胡萝卜素、核黄素、维生素b6、维生素e、胡桃叶醌、磷脂等营养物质。中国是核桃的原产地之一，有2000多年的栽培历史，目前中国核桃栽培面积和产量均居世界首位。然而核桃产品开发利用的程度和深度远远不够，除传统的炒吃、制罐头、做月饼馅、核桃粉、核桃乳、核桃油外，其他用途的深加工产品鲜见。核桃油被列为近几年国际、国内市场需求量较高的3大植物油之一，消费比例持续上升。国内核桃油生产厂家已达数十家，大量的脱脂核桃饼粕被作为饲料、肥料或丢弃，严重地浪费了核桃资源。研究显示核桃粕中蛋白质含量高达50％以上，核桃蛋白主要由4类蛋白质构成，即白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，分别占核桃蛋白总量6.81％、17.57％、5.33％和70.11％，其蛋白质组成接近联合国粮农组织(fao)和世界卫生组织(who)推荐的标准，8种必须氨基酸含量合理，对人体生理作用有重要功能的谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸含量均较高，是一种极具开发潜力的植物蛋白。
核桃粕谷蛋白、球蛋白中疏水性氨基酸比例较高，导致核桃蛋白溶解性较差，大大地限制了其在食品工业中的利用，因此研究核桃粕蛋白的深加工具有重要的社会经济意义。近年来，研究发现，食用蛋白原料通过科学合理的生物工程手段可获得具有多种生理功能的活性肽，包括易消化吸收、抗氧化、消除疲劳、降血糖、降血压、促进乙醇代谢、增强免疫力等生理活性肽，属天然绿色功能性食品配料，功效显著，无副作用，安全性高，可广泛地应用于食品(尤其是保健食品)、医药，具有良好的市场应用前景，开发核桃肽将是核桃粕精深加工中最具潜力和最有前途的方向。
天然核桃蛋白分子由于氢键、疏水键、二硫键等作用，肽链卷曲于蛋白分子内部近似于球状，结构紧密且有较强的疏水性，很难被蛋白酶水解；另外，核桃粕中还存在相当量的淀粉、油脂和色素等，影响了核桃蛋白质的深加工利用。目前，国内外核桃蛋白质深加工方面研究主要集中在如何高效酶解核桃蛋白，获得高得率的小分子量核桃肽。核桃肽制备突出的难题主要包括：(1)产品纯度低，即核桃肽蛋白质含量偏低，主要是核桃粕中仍有一定量的淀粉、油脂，未能在酶解前预处理、酶解后分离精制中有效去除，最终肽产品的非蛋白成分含量高，影响产品的品质；(2)核桃蛋白结构致密，酶解效率低，酶解产物中低分子量肽含量不高；(3)核桃粕中含有核桃仁皮，色泽发黑且有苦涩味，未有效处理会影响产品的色泽和风味；(4)制备工艺繁琐、未经科学优化，成本高，难以工业化实施。如专利cn103109971b公开了以核桃冷榨后核桃粕为原料，通过磨浆、复合蛋白酶酶解、膜过滤、浓缩干燥得到一种精氨酸含量高的核桃肽，该方法活性肽得率低于30％，产品蛋白质含量低，主要肽分子量≤3000kd；专利cn102630804a公开了一种以脱脂核桃粕为原料，通过加水混合均匀、均质、复合酶酶解、灭酶、离心、浓缩干燥得到一种核桃肽粉，该法产品蛋白质含量低，肽分子量范围广泛、小分子肽含量低；专利cn103103244b公开了一种核桃降血压肽制备方法，以核桃粕为原料，采用碱溶酸沉法提纯核桃蛋白，再采用微波结合超声波处理核桃蛋白适度变性以改善酶解效率，加入中性蛋白酶酶解后通过0.45um微滤膜、8kd超滤膜、1kd超滤膜收集透过液，在透过液中加入b-环糊精包埋、真空冷冻干燥获得核桃降血压肽，该法采用传统的碱溶酸沉法处理核桃粕，因核桃蛋白结构的特殊致密性，难以获得理想纯度(蛋白含量90％以上)的核桃蛋白，另酶解前变性处理及酶解后膜分离过于复杂、对设备要求高、不易工业化，产品的生产成本高。
技术实现要素：
为了解决上述现有技术的难点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种以低温压榨核桃粕为原料工业化生产高纯度核桃肽的方法。该方法以低温压榨核桃粕为原料，采用单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶处理，结合适度热处理钝化酶、改变蛋白结构以及水洗提纯核桃蛋白，再加入复合蛋白酶分步酶解、灭酶，对酶解产物离心分离、板框压滤后，滤过液浓缩、干燥制备高纯度的核桃肽，工艺紧凑优化，适合工业化生产。
本发明的另一目的在于提供所述的方法的应用。
本发明的再一目在于提供通过上述方法制备得到的高纯度核桃肽。该肽可用作保健食品、普通食品的原料，尤其可用于健脑益智、增强免疫力产品。
本发明是通过下述技术方案来实现的：一种以低温压榨核桃粕为原料工业化生产高纯度核桃肽的方法，包括以下步骤：
(1)核桃粕的分散、水化：称量冷榨核桃粕，用水配制为核桃蛋白溶液；将核桃蛋白溶液剪切分散均匀、水化；
(2)单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至45℃～55℃，加入单宁酶、纤维素酶和中温淀粉酶，酶解；各个酶的质量用量以核桃粕质量为基准计算，如下：单宁酶0.1％～0.2％、纤维素酶0.1％～1.0％、中温淀粉酶0.5～2.0％；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)酶解后的核桃蛋白溶液于100～121℃下处理0.5～1.0h，离心弃去上层液体(油脂层、水溶液层)，收集沉淀，再加入温度为50～60℃的水，搅拌均匀，离心弃去上层液体，收集沉淀；
(4)蛋白酶分步酶解、灭酶：在步骤(3)获得的沉淀中加入温度为50～60℃的水，搅拌均匀，得到核桃蛋白浆；调节核桃蛋白浆的ph值为7.5～8.5，先加入碱性蛋白酶于50℃～55℃搅拌水解1h～2h，再加入中性蛋白酶于50℃～55℃搅拌水解4h～16h；酶解结束后灭酶；各个酶的质量用量以核桃蛋白浆中蛋白质质量为基准计算，如下：碱性蛋白酶0.5％～2％、中性蛋白酶0.5％～2％；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白酶解产物离心分离，得到的清液经板框压滤，取澄清滤过液，得到高纯度核桃肽。
所述的以低温压榨核桃粕为原料工业化生产高纯度核桃肽的方法，还包括以下步骤：
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)得到的澄清滤过液浓缩，将浓缩液进行喷雾干燥，得到核桃肽成品。
本发明中所述的水优选为去离子水。
步骤(1)中：
所述的冷榨核桃粕，是指采用液压冷榨法脱脂后的核桃粕。
所述的核桃蛋白溶液中核桃粕的浓度优选为质量百分比5％～15％。
所述的剪切的条件优选为于2000rpm～3000rpm的速度剪切10～30min；更优选于2000rpm～3000rpm的速度剪切10～20min。
步骤(2)中：
所述的酶解的温度优选为45℃～50℃。
所述的酶解的时间优选为30min～90min。
所述的酶解优选在搅拌状态下进行，搅拌速度优选为低于60rpm，更优选为18～36rpm。
步骤(3)中：
所述的离心的条件优选为于3000rpm～6000rpm离心10min～20min；更优选为于3000rpm～4000rpm离心15min～20min。
所述的水的用量以能将所述的沉淀充分分散为宜，优选相当于所述的沉淀质量的3～5倍。
所述的水的温度优选为50～55℃。
步骤(4)中：
所述的水的用量以能将所述的沉淀充分分散为宜，优选相当于所述的沉淀质量的3～8倍；更优选为6～8倍。
所述的水的温度优选为55℃。
所述的ph值优选为8～8.5。
所述的ph值优选通过氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节。
所述的氢氧化钠溶液的浓度优选为1mol.l-1～5mol.l-1。
所述的盐酸溶液的浓度优选为1mol.l-1～4mol.l-1。
所述的碱性蛋白酶优选为胰酶、胰蛋白酶和地衣芽胞杆菌蛋白酶中的至少一种。
所述的中性蛋白酶优选为诺维信中性蛋白酶neutrase、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶中的至少一种。
所述的酶解优选在搅拌状态下进行，搅拌速度优选为低于60rpm，更优选为18～36rpm。
所述的灭酶的条件优选为于85～95℃灭酶10～40min；更优选于85～90℃灭酶15～30min。
步骤(5)中：
所述的离心分离是指将灭酶后的核桃蛋白酶解产物泵入卧螺离心机离心，弃渣取清液。
所述的板框压滤是指采用板框式硅藻土过滤机压滤，进一步去除离心清液中残存的蛋白质和大分子肽，富集小分子肽成分。
步骤(6)中：
所述的浓缩的程度优选为浓缩至固形物含量是20～45％。
所述的浓缩优选通过双效或多效降膜蒸发器浓缩。
所述的干燥优选通过干燥塔干燥，操作参数优选为进风温度为170℃～200℃，出风温度为75℃～95℃。
所述的方法在工业化生产高纯度核桃肽中的应用。
一种高纯度核桃肽，通过上述方法制备得到。
所述的高纯度核桃肽，其核桃肽蛋白质含量90％以上，肽含量85％以上，相对分子量小于2000dal肽占比85％以上，相对分子量小于1000dal肽占比50％以上。
所述的高纯度核桃肽产品品质好，苦味弱，可广泛用作保健食品、普通食品的原料，尤其可用于制备健脑益智、增强免疫力产品。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)由于高温热榨法核桃粕中残存一定量的核桃壳，不易去除，且蛋白质已发生严重过度变性、色泽深，本发明采用低温冷榨法副产物核桃粕为原料，低温压榨法工艺温和、蛋白质变性程度低，为高品质的核桃肽制备提供了底物保障。
(2)科学采用组合酶(单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶)协同增效酶解工艺结合蛋白质变性、离心、水洗工艺，一方面高效去除核桃蛋白粉中的核桃仁皮、淀粉、纤维，提升酶解底物核桃蛋白粉的纯度、风味，其中单宁酶可有效去除核桃仁皮产生的色泽和风味影响，纤维素酶和淀粉酶可有效降解核桃蛋白粉中的纤维、淀粉类，便于在水洗、离心中和蛋白分离；另一方面适度变性处理可有效促进蛋白质和杂质(主要是碳水化合物)的分离，同时打开核桃蛋白的紧密结构，降低其疏水性，便于后续酶解，提高核桃肽产品得率，改善了产品色泽和风味，此法能耗低、操作方便、易于工业化实现。
(3)因核桃蛋白中谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸含量高，本发明酶解工艺中采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶分步酶解以提高酶解效率及核桃肽得率，ph值调节采用控制初始ph值和终点ph值，可充分发挥酶组合的作用优势，且避免引入过多的酸液、碱液，降低生产成本。
(4)酶解结束后通过离心分离、板框压滤去除离心清液中残存的蛋白质和大分子肽，富集小分子肽成分，工艺简单紧凑，设备成本低，生产效率高，易工业化实现。
本发明通过预处理、酶解、精制工艺的科学优选实现非常经济性的工业化制备高纯度的核桃肽，蛋白质含量90％以上，肽含量85％以上，相对分子量小于2000dal肽占比85％以上，相对分子量小于1000dal肽占比50％以上，产品品质好，苦味弱、易于和其他食品配料搭配，健脑益智、增强免疫力功效突出，可以作为优质功能性基料广泛应用于各类食品、保健品中。本发明可实现核桃加工副产物的高附加值综合利用，提升核桃精深加工企业经济效益，促进核桃种植、加工的良性循环。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为10％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.15％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、0.5％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)、1.0％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌水解1.5h，再加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(36rpm)水解8h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形30％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为180℃，出口温度控制为85℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
实施例2
((1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为5％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以3000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化10min；
(2)单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至45℃，加入相当于核桃粕质量0.1％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、0.1％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)、0.5％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(18rpm)酶解90min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度121℃下处理0.5h，采用离心分离机以3000r/min转速离心20min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入3倍55℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.5，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量0.5％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)于50℃搅拌水解2h，再加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量0.5％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(18rpm)水解16h，酶解结束后升温至85℃灭酶40min；
(5)离心分离、离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形20％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为170℃，出口温度控制为75℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
实施例3
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为15％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.2％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、1.0％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)、2.0％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(25rpm)酶解30min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入5倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入8倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.5，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量2.0％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌水解1h，再加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量2.0％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(25rpm)水解4h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形45％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为190℃，出口温度控制为80℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
实施例4
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为12％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.15％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、0.8％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)、1.5％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4.5倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入7倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌水解2h，再加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(36rpm)水解8h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形40％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为200℃，出口温度控制为90℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
对比例1
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为10％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)纤维素酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.5％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)、1.0％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌水解1.5h，再加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(36rpm)水解8h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形30％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为180℃，出口温度控制为85℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
对比例2
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为10％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.15％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、1.0％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌水解1.5h，再加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(36rpm)水解8h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形30％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为180℃，出口温度控制为85℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
对比例3
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为10％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、纤维素酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.15％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、0.5％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌水解1.5h，再加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(36rpm)水解8h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形30％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为180℃，出口温度控制为85℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
对比例4
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为10％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.15％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、1.5％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌水解1.5h，再加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(36rpm)水解8h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形30％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为180℃，出口温度控制为85℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
对比例5
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为10％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、纤维素酶、酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.15％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、1.5％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌水解1.5h，再加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(36rpm)水解8h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形30％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为180℃，出口温度控制为85℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
对比例6
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为10％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.15％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、0.5％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)、1.0％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度90℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌水解1.5h，再加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(36rpm)水解8h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形30％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为180℃，出口温度控制为85℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
对比例7
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为10％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.15％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、0.5％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)、1.0％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(36rpm)水解9.5h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形30％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为180℃，出口温度控制为85℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
对比例8
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为10％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.15％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、0.5％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)、1.0％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为7.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(36rpm)水解9.5h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形30％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为180℃，出口温度控制为85℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
对比例9
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为10％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.15％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、0.5％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)、1.0％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量2.0％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(36rpm)水解9.5h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形30％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为180℃，出口温度控制为85℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
对比例10
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为10％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.15％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、0.5％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)、1.0％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为7.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量2.0％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌(36rpm)水解9.5h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形30％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为180℃，出口温度控制为85℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
对比例11
(1)核桃粕的分散、水化：用去离子水将低温压榨脱脂的核桃粕(以干基计，蛋白质含量≥55％、油脂含量≤15％)配制成质量百分比为10％的核桃蛋白溶液，用搅拌机以2000rpm的转速将核桃蛋白粉分散、水化20min；
(2)单宁酶、纤维素酶、中温淀粉酶酶解：将分散、水化好的核桃蛋白溶液加热至50℃，加入相当于核桃粕质量0.15％单宁酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)、0.5％纤维素酶(中性，北京夏盛生物科技开发有限公司)、1.0％中温淀粉酶(湖南世纪华星生物工程有限公司)，恒温搅拌(36rpm)酶解60min；
(3)蛋白质变性、离心、水洗：将步骤(2)处理后的核桃蛋白溶液泵入罐内，在温度100℃下处理1.0h，采用离心分离机以4000r/min转速离心15min，去脂肪和液体，收集沉淀，再加入4倍50℃去离子水，搅拌均匀，离心去上层液体，收集沉淀；
(4)酶解、灭酶：将步骤(3)获得的沉淀加入6倍55℃去离子水，搅拌均匀，调节核桃蛋白浆的ph值为8.0，加入相当于核桃蛋白浆中蛋白质质量1.0％的碱性蛋白酶(alcalase2.4l，诺维信(中国)投资有限公司)、1.0％的中性蛋白酶(中性蛋白酶neutrase，诺维信(中国)投资有限公司)于55℃搅拌水解9.5h，酶解结束后升温至90℃灭酶30min；
(5)离心分离、板框压滤：将灭酶后的核桃蛋白浆泵入卧螺离心机离心，离心后的清液再经板框式硅藻土过滤机压滤；
(6)浓缩、干燥、包装：将步骤(5)滤过液浓缩至固形30％，再将浓缩液进行喷雾干燥，进口温度控制为180℃，出口温度控制为85℃，干燥结束，包装，即得到核桃肽成品。
效果实施例
对实施例1～4和对比例1～11制得的核桃肽粉进行如下检测：分别采用gb/t5492、gb/t5009.3、gb/t5009.4、gb/t5009.5、gb/t5009.6规定的方法测定核桃肽粉色泽、水分、灰分、蛋白质含量；将核桃肽粉加入50℃纯水制成3％溶液，尝其滋味、嗅其气味；采用按gb/t22729-2008中6.3规定的方法分析核桃肽粉肽含量；采用gb/t22729-2008附录a高效凝胶过滤色谱法分析核桃肽粉相对分子量小于2000dal、1000dal肽所占比例，结果见表1～3。
表1实施例1～4制得的核桃肽粉分析检测结果
注：其中实施例1～4制得的核桃肽粉分别记为1#、2#、3#、4#。
表2对比例1～5制得的核桃肽粉分析检测结果
注：其中对比例1～5制得的核桃肽粉分别记为5#、6#、7#、8#、9#。
表3对比例6～11制得的核桃肽粉分析检测结果
注：其中对比例6～10制得的核桃肽粉分别记为10#、11#、12#、13#、14#、15#。
由表1可见，采用本发明方法实施例1～4制得的核桃肽中蛋白质的质量百分比为91.88％～93.12％(均≥90％)，肽含量为86.95％～88.21％(均≥85％)，相对分子量小于2000dal肽占比均≥85％，相对分子量小于1000dal肽占比均≥50％，是优质的高纯度蛋白肽产品。
由表2～3可见，与实施例1比较，对比例1未添加单宁酶，产品色泽黄色加深，有苦涩味，蛋白质含量、肽含量及相对分子量小于2000dal、1000dal肽占比差异不明显，可见添加单宁酶可改善产品的色泽和风味。对比例2未添加纤维素酶，对比例3未添加中温淀粉酶，获得产品色泽浅黄色加深，风味和实施例1差异不大，蛋白质含量、肽含量及相对分子量小于2000dal、1000dal肽占比均下降，对比例3下降更明显，可见添加纤维素酶、中温淀粉酶能提高产品的蛋白质含量、肽含量及小分子肽含量。对比例4未添加纤维素酶，中温淀粉酶用量增加至1.5％，获得产品色泽浅黄色加深，风味和对比例2差异不大，蛋白质含量、肽含量及相对分子量小于2000dal、1000dal肽占比较实施例1均下降，与对比例2差异不明显；对比例5未添加中温淀粉酶，纤维素酶用量增加至1.5％，获得产品色泽浅黄色加深，风味和对比例3差异不大，蛋白质含量、肽含量及相对分子量小于2000dal、1000dal肽占比较实施例1均下降，与对比例3差异不明显；可见单一地采用纤维素酶、中温淀粉酶对核桃蛋白底物去除碳水化合效果没有两者组合使用效果好，组合使用有明显的增效作用。对比例6仅改变核桃蛋白溶液变性条件为温度90℃下处理1.0h，与实施例1相比，色泽、风味、蛋白质含量无明显变化，但肽含量及相对分子量小于2000dal、1000dal肽占比明显下降，可见冷榨核桃粕中核桃蛋白变性程度对其酶解产物特性有明显的影响。对比例7未添加中性蛋白酶，对比例8未添加碱性蛋白酶(初始酶解ph调节成7.0)，色泽、风味及蛋白质含量和实施例1差异不明显，但肽含量下降，相对分子量小于2000dal、1000dal肽占比下降明显，可见复合酶选择有利于提高肽含量和小分子肽含量。对比例9未添加中性蛋白酶，碱性蛋白酶用量增加至2.0％，产品色泽、风味、蛋白质含量和实施例1差异不大，肽含量及相对分子量小于2000dal、1000dal肽占比较实施例1均下降，与对比例7差异不明显；对比例10未添加碱性蛋白酶，中性蛋白酶用量增加至2.0％(初始酶解ph调节成7.0)，产品色泽、风味、蛋白质含量和实施例1差异不大，肽含量及相对分子量小于2000dal、1000dal肽占比较实施例1均下降，与对比例8差异不明显；可见单一地采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶对核桃蛋白酶解制备核桃肽效果没有两者组合使用效果好，组合使用有明显的增效作用。对比例11中碱性蛋白酶、中性蛋白酶采用同步酶解，色泽、风味及蛋白质含量和实施例1差异不明显，但肽含量下降，相对分子量小于2000dal、1000dal肽占比下降明显，肽含量以及相对分子量小于2000dal、1000dal肽占比接近对比例7，可见复合酶添加顺序对核桃肽理化特性影响明显，碱性蛋白酶、中性蛋白酶同步酶解增效作用不明显。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。