发明涉及烟草病害鉴定技术领域，具体涉及一种烟草对烟草镰刀菌根腐病抗性的鉴定方法。
背景技术：
烟草是重要的经济作物，其病害种类很多，以根茎类病害损失最为严重。长期以来烟草根茎类病害以黑胫病发生较多。近年来，随着连作的面积扩大，根茎类病害日益严重，除了黑胫病外，一种新的病害正在蔓延扩展，即镰刀菌根腐病。黑胫病的发生已经引起了高度的关注，所以在品种培育、抗性鉴定、栽培措施、药物防治等手段上，都有深入的研究。镰刀菌根腐病在烟草上发现较晚，其研究主要集中在病原菌的鉴定、分离等方面，病害的鉴定研究很少见到。
镰刀菌属于土壤习居菌，种类繁多，分布很广，可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)引起植物的根腐、茎腐、花腐和穗腐等。镰刀菌产孢能力很强，孢子传播途径很多，除土传外还可以通过空气传播，侵染植物维管束系统，破坏植物的输导组织。许多研究表明镰刀菌在植物的生长发育过程中还产生毒素，造成植物萎蔫死亡。镰刀菌病害在生产上属于防治最困难的重要病害之一，目前主要采用抗病育种及生物防治方法，但这些方法的使用因条件限制有一定程度的局限性。化学防治只能以预防为主，植物一旦受到侵染其治病效果甚微。只有充分认识到病原菌对植物的作用机理，才能找到最经济、有效、环保的防治措施。
研究认为，在河南省引起烟草枯萎病与根腐病的镰刀菌种类较多，其中茄病镰刀菌(f.oxysporum)和尖孢镰刀菌(f.oxysporum)是引起烟草根腐病和枯萎病的主要致病菌。目前，要培育出抗病品种，首先要对资源材料做抗性鉴定，在鉴定的基础上，再进一步进行机理、分子方面的研究。所以准确快速有效的鉴定是对烟草抗源的挖掘、利用和抗病品种选育的首要环节。
研究认为，在河南省引起烟草枯萎病与根腐病的镰刀菌种类较多，其中茄病镰刀菌(f.oxysporum)和尖孢镰刀菌(f.oxysporum)是引起烟草根腐病和枯萎病的主要致病菌。目前，要培育出抗病品种，首先要对资源材料做抗性鉴定，在鉴定的基础上，再进一步进行机理、分子方面的研究。所以准确快速有效的鉴定是对烟草抗源的挖掘、利用和抗病品种选育的首要环节。
目前的鉴定方法:目前，没有镰刀菌根腐病抗性的鉴定标准，在文献中能找到的是在其它研究种关于该病的接种方法，一种是利用镰刀菌粗毒素经提取纯化后处理刚出芽的烟苗(烟草镰刀菌根腐病病菌致病粗毒素的研究，赵杰)；另一种是利用菌饼接种10叶期的烟苗，在烟苗根茎部用接种针针刺伤口，把制好的菌饼贴于伤口处，用脱脂棉蘸取无菌水包裹在接种处(河南烟草镰刀菌的初步分子鉴定，田艳艳)，这两种方法均能达到使烟株发病的目的，但对品种发病程度起不到鉴定的作用。
技术实现要素：
针对现有烟草镰刀菌根腐病抗性鉴定技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种快速鉴定烟苗对烟草镰刀菌根腐病抗性的方法，可有效地鉴别烟草镰刀菌根腐病。
本发明解决问题的技术方案是：
一种烟草对烟草镰刀菌根腐病抗性的鉴定方法，包括以下步骤：
步骤一、烟草镰刀菌病菌培养：首先制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potatodextroseagar)，然后将尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在25-30℃条件下培养7-14天，0-4℃储存于冰箱中备用；所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potatodextroseagar)的制作方法为：
1)将马铃薯洗净去皮，再称取200-400g切成小块，加蒸馏水煮20-30分钟，使马铃薯能被玻璃棒戳破即可，用2-6层纱布过滤，滤出马铃薯的蒸煮液，向所述蒸煮液中加入10-30g葡萄糖搅拌均匀，稍冷却后再加蒸馏水定容至1000毫升，得马铃薯葡萄糖的混合液，将所述混合液分装到500ml三角瓶中；2)再将琼脂加入到所述三角瓶中；高压115-125℃，灭菌20-30min，无菌条件下分装于一次性无菌培养皿中，每皿10ml；琼脂与所述混合液的料液比为15-20g/l；
步骤二、菌液的制备：取发育成长成熟的菌皿，按照菌饼的重量，每皿加入8-12ml纯净水，在匀浆机中打成匀浆，密封备用；
步骤三、烟苗的培育：将需要鉴定品种的种子，在漂浮盘内播种，间苗，待烟苗长到5-7叶时备用；
步骤四、烟苗的前处理：将步骤三培育的烟苗，选择生长健壮、大小一致的，从漂盘里面拔出，用水冲掉基质，放入不放基质的空漂盘中；
步骤五、接菌：将两种病菌按照1:1混均匀，用hoagland营养液再稀释到32倍，倒入托盘内；托盘大小要以能放入漂盘为准；将处理好的烟苗，连同漂盘，放入托盘内；调整菌液量和苗入水深度，确保三分之二根系没入菌液；同时设置对照组，对照组只用营养液，不加菌，其他所有步骤与实验组相同；
步骤六、调查：浸泡烟苗根部一段时间后，幼苗会出现根部变色，叶面萎蔫等症状，参考材料分级标准，将镰刀菌对烟草幼苗的作用分为以下几个级别；
“0”无反应：整株烟苗无萎蔫，健康良好；
“1”轻度反应：烟草幼苗侧根变色，或老叶下垂；
“3”中度反应：烟草幼苗主根变黄变黑，侧根数量不变或新叶下垂；
“5”重度反应：整株烟苗萎蔫；
“7”重度反应：整株烟苗干枯；
病菌接种后第2天开始调查发病情况，随后，每2天调查一次，连续调查5次；根据发病情况，即可检测出品种对镰刀菌根腐病的抗性。
进一步的，本发明的步骤五中，设有菌液梯度处理，分别为4倍、8倍、16倍、32倍、64倍，实验发现浓度大于32倍的，都100％发病，不可用，小于32倍的，几乎不发病，也不可用，所以选择32倍作为适宜处理浓度。
本发明的有益效果是：
本发明涉及的一种烟苗对烟草镰刀菌根腐病鉴定的方法，具有以下特点，
第一，直接利用烟苗鉴定，与移栽到盆内或大田接种病菌相比较，具有以下优点：
1、可以省去移栽后盆栽培养烟株繁琐的工作，降低了工作量；漂盘接种，一批可以接种几百-几千个植株，扩大了接种量；苗期直接接种，还大幅度的缩短鉴定所需的时间。
2、使烟草对镰刀菌根腐病的抗性不受生长季节限制，任何季节都能展开鉴定工作。
3、鉴定在漂盘内进行，减少了土壤中其它菌的干扰，鉴定结果更准确可靠。
第二，与毒素接种芽相比较，具有如下特点：
1、该方法试验条件要求较低，不用培养毒素，直接利用菌饼，减少了毒素的培养、提纯等过程，减少了投入，缩短了时间。
2、该方法完全实现了低成本，高通量、快速鉴定烟草镰刀菌根腐病的目的，更适宜于烟草育种研究中大批量种质材料镰刀菌根腐病抗性鉴定，以加速抗病种质资源筛选、抗性遗传特性研究、抗病品种的育种与推广应用。
具体实施方式
实施例1
一种烟苗对烟草镰刀菌根腐病鉴定的方法，包括以下步骤：
步骤一、烟草镰刀菌病菌培养：首先制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potatodextroseagar)，然后将尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在25-30℃条件下培养7-14天，0-4℃储存于冰箱中备用；所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potatodextroseagar)的制作方法为：
2)将马铃薯洗净去皮，再称取200-400g切成小块，加蒸馏水煮20-30分钟，使马铃薯能被玻璃棒戳破即可，用2-6层纱布过滤，滤出马铃薯的蒸煮液，向所述蒸煮液中加入10-30g葡萄糖搅拌均匀，稍冷却后再加蒸馏水定容至1000毫升，得马铃薯葡萄糖的混合液，将所述混合液分装到500ml三角瓶中；2)再将琼脂加入到所述三角瓶中；高压115-125℃，灭菌20-30min，无菌条件下分装于一次性无菌培养皿中，每皿10ml；琼脂与所述混合液的料液比为15-20g/l；
步骤二、菌液的制备：取发育成长成熟的菌皿，按照菌饼的重量，每皿加入8-12ml纯净水，在匀浆机中打成匀浆，密封备用；
步骤三、烟苗的培育：将需要鉴定品种的种子，在漂浮盘内播种，间苗，待烟苗长到5-7叶时备用；
步骤四、烟苗的前处理：将步骤三培育的烟苗，选择生长健壮、大小一致的，从漂盘里面拔出，用水冲掉基质，放入不放基质的空漂盘中；
步骤五、接菌：将两种病菌按照1:1混均匀，用hoagland营养液再稀释到32倍，倒入托盘内；托盘大小要以能放入漂盘为准；将处理好的烟苗，连同漂盘，放如托盘内；调整菌液量和苗入水深度，确保三分之二根系没入菌液；同时设置对照组，对照组只用营养液，不加菌，其他所有步骤与实验组相同；
步骤六、调查：浸泡烟苗根部一段时间后，幼苗会出现根部变色，叶面萎蔫等症状，参考材料分级标准，将镰刀菌对烟草幼苗的作用分为以下几个级别；
“0”无反应：整株烟苗无萎蔫，健康良好；
“1”轻度反应：烟草幼苗侧根变色，或老叶下垂；
“3”中度反应：烟草幼苗主根变黄变黑，侧根数量不变或新叶下垂；
“5”重度反应：整株烟苗萎蔫；
“7”重度反应：整株烟苗干枯；
病菌接种后第2天开始调查发病情况，随后，每2天调查一次，连续调查5次；根据发病情况，即可检测出品种对镰刀菌根腐病的抗性。检测结果，见表1。
表1.检测结果统计：
表中a、b为抗、感对照、c、d为待鉴定的品种
由上表的调查结果可知：
c品种发病率和病情指数与抗性品种a接近，差异不显著；d品种发病率和病情指数与感病品种b接近，差异不显著；从而判定c为抗病品种，d为感病品种。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。