细胞培养容器的制作方法

本发明涉及细胞培养容器、其制造方法及使用了该细胞培养容器的细胞凝集块(也称为细胞球(sphere))的制造方法。本发明尤其涉及特征在于在表面涂覆有具有抑制细胞附着的能力的共聚物的细胞培养容器及其制造方法。

背景技术：

近年来，用于使在动物、植物体内发挥不同作用的各种器官、组织、及细胞在机体外增殖或维持的技术逐渐发展。在机体外使这些器官、组织增殖或维持分别被称为器官培养、组织培养，在机体外使从器官、组织分离的细胞增殖、分化或维持被称为细胞培养。细胞培养是在培养基中使分离的细胞在机体外增殖、分化或维持的技术，对于详细分析机体内的各种器官、组织、细胞的功能及结构是不可缺少的。另外，利用该技术培养的细胞及/或组织已在化学物质、医药品等的药效及毒性评价、酶、细胞生长因子、抗体等有用物质的大量生产、修复由于疾病、缺损而丧失的器官、组织、细胞的再生医疗、植物的品种改良、基因重组作物的制成等各种领域中被利用。

来源于动物的细胞根据其形状主要可分为悬浮细胞和贴壁细胞。悬浮细胞是生长·增殖不需要固着位置的细胞，贴壁细胞是生长·增殖需要固着位置的细胞，构成机体的大部分细胞是后者的贴壁细胞。作为贴壁细胞的培养方法，已知有单层培养、分散培养、包埋培养、微载体培养、及细胞凝集块(细胞球)培养等。

尤其是，近年来，伴随着再生医疗领域的发展，作为在更接近机体内的环境中培养的方法，细胞球培养受到关注，报道了多种适于该培养的培养基组合物、培养基添加剂(例如，参见专利文献1及2)。另外，认为细胞球培养中，来自培养容器(基材)的刺激是影响培养结果的重要因素，人们需要在不存在来自培养容器的刺激的三维环境或完全的悬浮状态下培养细胞(尤其是细胞凝集块)(例如，参见专利文献3)。

本申请的发明人关注了作为具有抑制各种生物材料附着的能力的涂覆材料而受到期待的具有磷酸酯基的聚合物，并反复进行了研究。结果，报道了：对于用包含特定的阴离子性基团和阳离子性基团的共聚物涂覆表面的至少一部分而得到的细胞培养容器而言，不仅可抑制细胞在容器表面(内部表面)的附着，而且涂层能牢固地固着于容器表面，因此，作为涂层向培养液中的溶出、放射线耐性得以改善的细胞培养容器是有用的(例如，参见专利文献4)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2014/017513号公报

专利文献2：国际公开第2013/144372号公报

专利文献3：日本特开2008-61609号公报

专利文献4：国际公开第2014/0196652号公报

技术实现要素：

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供细胞培养容器、其制造方法及使用了该细胞培养容器的细胞凝集块的制造方法。尤其是，本发明的目的在于提供特征在于在表面涂覆有具有抑制细胞附着的能力的共聚物的细胞培养容器、其制造方法及使用了该细胞培养容器的细胞凝集块的制造方法。

以往，为了在三维环境中或完全的悬浮状态下培养细胞(尤其是细胞凝集块)，存在细胞附着于容器表面、以及细胞培养容器所带有的涂层向培养液中溶出这样的问题。另外，还存在通过细胞培养而生产·分泌的/培养基中包含的蛋白质附着于容器表面这样的问题。带有由亲水性化合物形成的涂层的细胞培养容器虽然能改善细胞向容器表面的附着，但仍然存在细胞培养容器所带有的涂层向培养液中溶出、蛋白质附着于容器表面等问题。

用于解决课题的手段

本申请的发明人继续关注于具有磷酸酯基的聚合物，并反复进行了深入研究。结果发现，对于用不仅包含特定的阴离子性基团和阳离子性基团、而且还包含特定的疏水性基团的共聚物涂覆表面的至少一部分而得到的细胞培养容器而言，不仅可抑制细胞以及蛋白质向容器表面的附着，而且涂层能牢固地固着于容器表面，因此，作为涂层向培养液中的溶出得以改善的细胞培养容器是有用的，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述：

1.细胞培养容器，其特征在于，在表面涂覆有下述共聚物，所述共聚物含有：包含下述式(a)表示的基团的重复单元、包含下述式(b)表示的基团的重复单元、和包含下述式(c)表示的基团的重复单元；

[化学式1]

[式中，

u^a1、u^a2、u^b1、u^b2及u^b3各自独立地表示氢原子、或碳原子数为1～5的直链或支链烷基；

r^c表示碳原子数为1～18的直链或支链烷基、碳原子数为3～10的脂环式烃基、碳原子数为6～10的芳基、碳原子数为7～15的芳烷基或碳原子数为7～15的芳基氧基烷基(此处，前述芳基部分可以被可经卤素原子取代的碳原子数为1～5的直链或支链烷基取代)；

an^-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子]

2.如上述1所述的细胞培养容器，其中，包含上述式(a)、(b)及(c)表示的基团的重复单元分别为由下述式(a)、(b)及(c)表示的单体衍生的重复单元；

[化学式2]

[式中，

t^a、t^b、t^c、u^a1、u^a2、u^b1、u^b2及u^b3各自独立地表示氢原子、或碳原子数为1～5的直链或支链烷基；

q^a及q^b各自独立地表示单键、酯键或酰胺键，q^c表示单键、醚键或酯键；

r^a及r^b各自独立地表示可以被卤素原子取代的碳原子数为1～10的直链或支链亚烷基，r^c表示碳原子数为1～18的直链或支链烷基、碳原子数为3～10的脂环式烃基、碳原子数为6～10的芳基、碳原子数为7～15的芳烷基或碳原子数为7～15的芳基氧基烷基(此处，前述芳基部分可以被可经卤素原子取代的碳原子数为1～5的直链或支链烷基取代)；an^-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子；

m表示0～6的整数]

3.如上述2所述的细胞培养容器，其中，m为1，r^a及r^b各自独立地表示亚乙基或亚丙基。

4.如上述1～3中任一项所述的细胞培养容器，其中，上述共聚物还包含由下述式(d)或(e)表示的单体衍生的交联结构；

[化学式3]

(式中，

t^d、t^e及u^e各自独立地表示氢原子、或碳原子数为1～5的直链或支链烷基；

r^d及r^e各自独立地表示可以被卤素原子取代的碳原子数为1～10的直链或支链亚烷基；

n表示1～6的整数)

5.如上述4所述的细胞培养容器，其中，t^d及t^e各自独立地表示氢原子或甲基，u^e表示氢原子，r^d及r^e各自独立地表示亚乙基或亚丙基。

6.如上述1～5中任一项所述的细胞培养容器，其具有抑制蛋白质附着的能力。

7.细胞培养容器的制造方法，其包括在容器表面的至少一部分涂覆下述共聚物的工序，所述共聚物含有：包含下述式(a)表示的基团的重复单元、包含下述式(b)表示的基团的重复单元、和包含下述式(c)表示的基团的重复单元；

[化学式4]

[式中，

u^a1、u^a2、u^b1、u^b2及u^b3各自独立地表示氢原子、或碳原子数为1～5的直链或支链烷基；

r^c表示碳原子数为1～18的直链或支链烷基、碳原子数为3～10的脂环式烃基、碳原子数为6～10的芳基、碳原子数为7～15的芳烷基或碳原子数为7～15的芳基氧基烷基(此处，前述芳基部分可以被可经卤素原子取代的碳原子数为1～5的直链或支链烷基取代)；

an-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子]

8.如上述7所述的制造方法，其中，包含上述式(a)、(b)及(c)表示的基团的重复单元分别为由下述式(a)、(b)及(c)表示的单体衍生的重复单元；

[化学式5]

[式中，

t^a、t^b、t^c、u^a1、u^a2、u^b1、u^b2及u^b3各自独立地表示氢原子、或碳原子数为1～5的直链或支链烷基；

q^a及q^b各自独立地表示单键、酯键或酰胺键，q^c表示单键、醚键或酯键；

r^a及r^b各自独立地表示可以被卤素原子取代的碳原子数为1～10的直链或支链亚烷基，r^c表示碳原子数为1～18的直链或支链烷基、碳原子数为3～10的脂环式烃基、碳原子数为6～10的芳基、碳原子数为7～15的芳烷基或碳原子数为7～15的芳基氧基烷基(此处，前述芳基部分可以被可经卤素原子取代的碳原子数为1～5的直链或支链烷基取代)；an^-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子；

m表示0～6的整数]

9.如上述7或8所述的制造方法，其中，使用包含共聚物的清漆来实施涂覆工序。

10.如上述9所述的制造方法，其中，包含共聚物的清漆预先经ph调节。

11.如上述7～10中任一项所述的制造方法，其中，还包括在干燥工序前和/或干燥工序后对经涂覆的细胞培养容器进行洗涤的工序。

12.如上述11所述的制造方法，其中，使用选自由水及包含电解质的水溶液组成的组中的至少1种溶剂来实施干燥工序后的洗涤。

13.细胞凝集块的制造方法，其特征在于，使用上述1～6中任一项所述的细胞培养容器或利用上述7～12中任一项所述的制造方法制造的细胞培养容器。

发明的效果

对于本发明的细胞培养容器而言，通过用包含式(a)表示的阴离子、式(b)表示的阳离子、和式(c)表示的疏水性基团的共聚物涂覆表面的至少一部分，从而能抑制细胞、蛋白质在容器表面的附着。认为通过该阳离子及阴离子的静电平衡，使得容器的表面保持电中性，能防止细胞、蛋白质的附着。另一方面，通过涂层中的该阳离子及阴离子形成离子键(离子络合)，从而成为能对容器基材种类没有选择性地固着于玻璃、纤维、无机粒子或树脂(合成树脂及天然树脂)等，并且，固着后对水系溶剂(水、磷酸缓冲液(pbs)、醇等)的耐久性优异的涂层。

另外，通过向共聚物中导入式(c)表示的疏水性基团，从而成为抑制蛋白质附着的能力提高，并且与塑料等树脂的密合性良好，固着后的对水系溶剂的耐久性更优异的涂层。

即，通过本发明，可提供不仅抑制细胞以及蛋白质向容器表面的附着，而且对溶剂的耐久性也优异的细胞培养容器。

附图说明

[图1]表示培养4天后利用倒置显微镜对细胞相对于实施例1、比较例1、阴性对照、阳性对照的培养板的附着进行观察而得到的结果。

具体实施方式

1.术语的说明

对于本发明中使用的术语而言，只要没有另外特别说明，则具有以下的定义。

本发明中，“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。

本发明中，“烷基”是指直链或支链的饱和脂肪族烃的1价的基团。作为“碳原子数为1～5的直链或支链烷基”，可举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基或1-乙基丙基。作为“碳原子数为1～18的直链或支链烷基”，除了上述碳原子数为1～5的直链或支链烷基的例子之外，还可举出己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基或十八烷基、或它们的异构体。

本发明中，“可经卤素原子取代的碳原子数为1～5的直链或支链烷基”是指上述碳原子数为1～5的直链或支链烷基、或被1个以上的上述卤素原子取代的上述碳原子数为1～5的直链或支链烷基。“碳原子数为1～5的直链或支链烷基”的例子如上所述。另一方面，“被1个以上的卤素原子取代的碳原子数为1～5的直链或支链烷基”是指上述碳原子数为1～5的直链或支链烷基的1个以上的任意的氢原子被卤素原子取代而得到的基团，作为例子，可举出氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、溴甲基、碘甲基、2,2,2-三氟乙基、2,2,2-三氯乙基、全氟乙基、全氟丁基、或全氟戊基等。

本发明中，“酯键”是指-c(＝o)-o-或-o-c(＝o)-，“酰胺键”是指-nhc(＝o)-或-c(＝o)nh-，“醚键”是指-o-。

本发明中，“可以被卤素原子取代的碳原子数为1～10的直链或支链亚烷基”是指碳原子数为1～10的直链或支链亚烷基、或被1个以上的卤素原子取代的碳原子数为1～10的直链或支链亚烷基。此处，“亚烷基”是指与上述烷基对应的2价的有机基团。作为“碳原子数为1～10的直链或支链亚烷基”的例子，可举出亚甲基、亚乙基、亚丙基、三亚甲基、四亚甲基、1-甲基亚丙基、2-甲基亚丙基、二甲基亚乙基、乙基亚乙基、五亚甲基、1-甲基四亚甲基、2-甲基四亚甲基、1,1-二甲基三亚甲基、1,2-二甲基三亚甲基、2,2-二甲基三亚甲基、1-乙基三亚甲基、六亚甲基、八亚甲基及十亚甲基等，这些中，优选亚乙基、亚丙基、八亚甲基及十亚甲基，例如，更优选亚乙基、亚丙基、三亚甲基、四亚甲基等碳原子数为1～5的直链或支链亚烷基，特别优选亚乙基或亚丙基。“被1个以上的卤素原子取代的碳原子数为1～10的直链或支链亚烷基”是指上述亚烷基的1个以上的任意的氢原子被卤素原子取代而得到的基团，特别优选亚乙基或亚丙基的氢原子的一部分或全部被卤素原子取代而得到的基团。

本发明中，“碳原子数为3～10的脂环式烃基”是指碳原子数为3～10的、单环式或多环式的、饱和或部分不饱和的、脂肪族烃的1价的基团。其中，优选碳原子数为3～10的、单环式或二环式的、饱和脂肪族烃的1价的基团，可举出例如环丙基、环丁基或环己基等碳原子数为3～10的环烷基、或双环[3.2.1]辛基、冰片基、异冰片基等碳原子数为4～10的双环烷基。

本发明中，“碳原子数为6～10的芳基”是指碳原子数为6～10的、单环式或多环式的、芳香族烃的1价的基团，可举出例如苯基、萘基或蒽基等。“碳原子数为6～10的芳基”可以被1个以上的上述“可经卤素原子取代的碳原子数为1～5的直链或支链烷基”取代。

本发明中，“碳原子数为7～15的芳烷基”是指-r-r’基(此处，r表示上述“碳原子数为1～5的亚烷基”，r’表示上述“碳原子数为6～10的芳基”)，可举出例如苄基、苯乙基、或α-甲基苄基等。“碳原子数为7～15的芳烷基”的芳基部分可以被1个以上的上述“可经卤素原子取代的碳原子数为1～5的直链或支链烷基”取代。

本发明中，“碳原子数为7～15的芳基氧基烷基”是指-r-o-r’基(此处，r表示上述“碳原子数为1～5的亚烷基”，r’表示上述“碳原子数为6～10的芳基”)，可举出例如苯氧基甲基、苯氧基乙基、或苯氧基丙基等。“碳原子数为7～15的芳基氧基烷基”的芳基部分可以被1个以上的上述“可经卤素原子取代的碳原子数为1～5的直链或支链烷基”取代。

本发明中，所谓“卤化物离子”，是指氟化物离子、氯化物离子、溴化物离子或碘化物离子。

本发明中，所谓“无机酸根离子”，是指碳酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、硝酸根离子、高氯酸根离子或硼酸根离子。

作为上述an^-，优选的是卤化物离子、硫酸根离子、磷酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子，特别优选的是卤化物离子。

本发明中，所谓(甲基)丙烯酸酯化合物，是指丙烯酸酯化合物和甲基丙烯酸酯化合物这两方。例如，(甲基)丙烯酸是指丙烯酸和甲基丙烯酸。

所谓具有抑制细胞附着的能力，例如是指：基于利用实施例中记载的方法进行的细胞数测定试剂的、与无涂层的情况相比时的相对吸光度(wsto.d.450nm)(％)(实施例的吸光度(wsto.d.450nm)/比较例的吸光度(wsto.d.450nm)×100)为50％以下，优选为30％以下，进一步优选为20％以下。

所谓具有抑制蛋白质附着的能力，例如是指：利用实施例中记载的方法进行的qcm-d测定中与无涂覆膜的情况相比时的相对单位面积的质量(％)(实施例的每单位面积的质量(ng/cm²)/比较例的每单位面积的质量(ng/cm²)×100)为50％以下，优选为30％以下，进一步优选为20％以下。

本发明中，作为蛋白质，可举出纤维蛋白原、牛血清白蛋白(bsa)、人白蛋白、各种球蛋白、β-脂蛋白、各种抗体(igg、iga、igm)、过氧化物酶、各种补体、各种凝集素、纤连蛋白、溶菌酶、冯·维勒布兰德因子(vwf，vonwillebrand’sfactor)、血清γ-球蛋白、胃蛋白酶、卵清白蛋白、胰岛素、组蛋白、核糖核酸酶、胶原蛋白、细胞色素c等，尤其是，相对于血清中包含的蛋白质(白蛋白及球蛋白)具有特别高的附着抑制能力。

2.本发明的说明

《细胞培养容器》

本发明的第一方式是一种细胞培养容器，其特征在于，在表面的至少一部分涂覆有下述共聚物，所述共聚物含有：包含下述式(a)表示的基团的重复单元、包含下述式(b)表示的基团的重复单元、和包含下述式(c)表示的基团的重复单元；

[化学式6]

[式中，

u^a1、u^a2、u^b1、u^b2及u^b3各自独立地表示氢原子、或碳原子数为1～5的直链或支链烷基；

r^c表示碳原子数为1～18的直链或支链烷基、碳原子数为3～10的脂环式烃基、碳原子数为6～10的芳基、碳原子数为7～15的芳烷基或碳原子数为7～15的芳基氧基烷基(此处，前述芳基部分可以被可经卤素原子取代的碳原子数为1～5的直链或支链烷基取代)；

an^-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子]

＜细胞＞

本发明中的细胞是指构成动物或植物的最基本的单位，作为其要素，在细胞膜的内部具有细胞质和各种细胞器。此时，细胞内部可包含内含dna的核，也可不包含内含dna的核。例如，本发明中的来源于动物的细胞包括精子、卵子等生殖细胞，构成机体的体细胞，干细胞(多能干细胞等)，前体细胞，从机体分离出的癌细胞，从机体分离、且获得不死能力、并可在体外稳定维持的细胞(细胞株)，从机体分离、且人为改变基因而得到的细胞，从机体分离、且人为更换了核的细胞等。作为构成机体的体细胞的例子，包括但不限于成纤维细胞、骨髓细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、骨细胞、骨髓细胞、周皮细胞、树突状细胞、角质化细胞、脂肪细胞、间质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝实质细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经细胞、神经胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、心脏细胞、食道细胞、肌肉细胞(例如，平滑肌细胞或骨骼肌细胞)、胰岛β细胞、黑素细胞、定向造血干细胞(例如，来源于脐带血的cd34阳性细胞)、及单核细胞等。该体细胞例如包括从皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰脏、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、精巢、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液(包括脐带血)、骨髓、心脏、眼、脑或神经组织等任意的组织采集的细胞。干细胞是指兼有复制自身的能力和分化成其他多种系统的细胞的能力的细胞，作为其例子，包括但不限于胚胎干细胞(es细胞)、胚胎肿瘤细胞、胚性生殖干细胞、诱导多能干细胞(ips细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛囊干细胞等。作为多能干细胞，可举出上述干细胞中的es细胞、胚性生殖干细胞、ips细胞。前体细胞是指处于从上述干细胞分化成特定的体细胞、生殖细胞中途的阶段的细胞。癌细胞是指从体细胞派生的获得无限增殖能力的细胞。细胞株是指利用机体外的人为操作而获得无限的增殖能力的细胞。

作为癌细胞株的例子，不受以下列举的例子的限制，作为人乳癌细胞株，可举出hbc-4、bsy-1、bsy-2、mcf-7、mcf-7/adrres、hs578t、mda-mb-231、mda-mb-435、mda-n、bt-549、t47d，作为人子宫颈癌细胞株，可举出hela，作为人肺癌细胞株，可举出a549、ekvx、hop-62、hop-92、nci-h23、nci-h226、nci-h322m、nci-h460、nci-h522、dms273、dms114，作为人大肠癌细胞株，可举出caco-2、colo-205、hcc-2998、hct-15、hct-116、ht-29、km-12、sw-620、widr，作为人前列腺癌细胞株，可举出du-145、pc-3、lncap，作为人中枢神经系统癌细胞株，可举出u251、sf-295、sf-539、sf-268、snb-75、snb-78、snb-19，作为人卵巢癌细胞株，可举出ovcar-3、ovcar-4、ovcar-5、ovcar-8、sk-ov-3、igrov-1，作为人肾癌细胞株，可举出rxf-631l、achn、uo-31、sn-12c、a498、caki-1、rxf-393l、786-0、tk-10，作为人胃癌细胞株，可举出mkn45、mkn28、st-4、mkn-1、mkn-7、mkn-74，作为皮肤癌细胞株，可举出lox-imvi、lox、malme-3m、sk-mel-2、sk-mel-5、sk-mel-28、uacc-62、uacc-257、m14，作为白血病细胞株，可举出ccrf-crm、k562、molt-4、hl-60tb、rpmi8226、sr、ut7/tpo、jurkat等。作为细胞株的例子，包括但不限于hek293(人源胚胎肾细胞)、mdck、mdbk、bhk、c-33a、ae-1、3d9、ns0/1、nih3t3、pc12、s2、sf9、sf21、highfive(注册商标)、vero等。作为肝细胞株的例子，不受以下列举的例子的限制，可举出hepg2、hep3b、heparg(注册商标)、jhh7、hlf、hle、plc/prf/5、wrl68、hb611、sk-hep-1、huh-4、huh-7等。

本发明中的来源于植物的细胞包括从植物体的各组织分离出的细胞，还包括人为地从该细胞除去细胞壁而得到的原生质体。

＜容器＞

构成本发明的细胞培养容器的涂覆有共聚物的容器可以是本技术领域中使用的任意形态的容器类，可举出例如细胞的培养中通常使用的培养皿、烧瓶、塑料袋、teflon(注册商标)袋、培养皿、petri培养皿、组织培养用培养皿、多用途培养皿、微孔培养板、微孔板、多用途培养板、多孔培养板、细胞培养玻片、细胞培养烧瓶、旋转式烧瓶、管、浅盘、培养袋、摇瓶等。可优选举出6～1536孔的多孔培养板及培养皿。

作为容器的原材料，典型地，可使用玻璃或树脂。从加工容易性、经济性等方面考虑，优选使用树脂。树脂可以是天然树脂或合成树脂中的任何，作为天然树脂，可举出例如纤维素、三乙酸纤维素(cta)、硫酸葡聚糖经固定化而成的纤维素等，作为合成树脂，可举出例如聚丙烯腈(pan)、聚酯类-多聚物合塑体(pepa)、聚苯乙烯(ps)、聚砜(psf)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚乙烯醇(pva)、聚氨酯(pu)、乙烯-乙烯醇(eval)、聚乙烯(pe)、聚酯、聚丙烯(pp)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚醚砜(pes)、聚碳酸酯(pc)、聚氯乙烯(pvc)、聚四氟乙烯(ptfe)、超高分子量聚乙烯(uhpe)、聚二甲基硅氧烷(pdms)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂(abs)、teflon(注册商标)、环烯烃聚合物(cop)(例如，zeonor(注册商标)、zeonex(注册商标)(日本zeon(株)制))或各种离子交换树脂等。在制造本发明的细胞培养容器时，以使得共聚物存在于该容器的表面的至少一部分的方式进行涂覆时，不需要高温下的处理，因此，也可应用耐热性低的树脂等。

＜共聚物＞

本发明的细胞培养容器的特征在于，用特定的共聚物涂覆容器表面的至少一部分。本发明涉及的共聚物为含有包含下述式(a)表示的基团的重复单元、包含下述式(b)表示的基团的重复单元、和包含下述式(c)表示的基团的重复单元的共聚物；

[化学式7]

[式中，

u^a1、u^a2、u^b1、u^b2及u^b3各自独立地表示氢原子、或碳原子数为1～5的直链或支链烷基；

r^c表示碳原子数为1～18的直链或支链烷基、碳原子数为3～10的脂环式烃基、碳原子数为6～10的芳基、碳原子数为7～15的芳烷基或碳原子数为7～15的芳基氧基烷基(此处，前述芳基部分可以被可经卤素原子取代的碳原子数为1～5的直链或支链烷基取代)；

an^-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子]。

本发明涉及的共聚物没有特别限制，只要是含有包含上述式(a)表示的基团的重复单元、包含上述式(b)表示的基团的重复单元、和包含上述式(c)表示的基团的重复单元的共聚物即可。需要说明的是，本发明中，包含上述式(c)表示的基团的重复单元与包含上述式(a)表示的基团的重复单元及包含上述式(b)表示的基团的重复单元不同。该共聚物优选为使包含上述式(a)表示的基团的单体、包含上述式(b)表示的基团的单体、和包含上述式(c)表示的基团的单体进行自由基聚合而得到的聚合物，也可使用进行缩聚、加聚反应而得到的聚合物。作为共聚物的例子，可举出烯烃进行反应而得到的乙烯基聚合聚合物、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚氨酯等，这些中，特别优选烯烃进行反应而得到的乙烯基聚合聚合物或使(甲基)丙烯酸酯化合物聚合而得到的(甲基)丙烯酸类聚合物。

优选包含上述式(a)、(b)及(c)表示的基团的单体分别为下述式(a)、(b)及(c)表示的单体。

[化学式8]

[式中，

t^a、t^b、t^c、u^a1、u^a2、u^b1、u^b2及u^b3各自独立地表示氢原子、或碳原子数为1～5的直链或支链烷基；

q^a及q^b各自独立地表示单键、酯键或酰胺键，q^c表示单键、醚键或酯键；

r^a及r^b各自独立地表示可以被卤素原子取代的碳原子数为1～10的直链或支链亚烷基，r^c表示碳原子数为1～18的直链或支链烷基、碳原子数为3～10的脂环式烃基、碳原子数为6～10的芳基、碳原子数为7～15的芳烷基或碳原子数为7～15的芳基氧基烷基(此处，前述芳基部分可以被可经卤素原子取代的碳原子数为1～5的直链或支链烷基取代)；an^-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子；

m表示0～6的整数]

因此，由式(a)、(b)及(c)表示的单体衍生的重复单元分别由下述式(a1)、(b1)及(c1)表示。

[化学式9]

(式中，t^a、t^b、t^c、u^a1、u^a2、u^b1、u^b2及u^b3、q^a、q^b及q^c、r^a、r^b及r^c、an^-以及m与上文所述含义相同)

t^a、t^b及t^c优选各自独立地为氢原子、甲基或乙基，更优选各自独立地为氢原子或甲基。

u^a1、u^a2、u^b1、u^b2及u^b3优选各自独立地为氢原子、甲基、乙基或叔丁基。u^a1及u^a2更优选为氢原子。u^b1、u^b2(及u^b3)更优选为甲基或乙基，特别优选为甲基。

q^a及q^b优选各自独立地为酯键(-c(＝o)-o-或-o-c(＝o)-)或酰胺键(-nhc(＝o)-或-c(＝o)nh-)，更优选各自独立地为-c(＝o)-o-或-c(＝o)nh-，特别优选为-c(＝o)-o-。q^c优选为醚键或酯键(-c(＝o)-o-或-o-c(＝o)-)，更优选为-o-或-c(＝o)-o-，特别优选为-c(＝o)-o-。

r^a及r^b优选各自独立地为可以被卤素原子取代的碳原子数为1～3的直链或支链亚烷基，更优选各自独立地为亚乙基或亚丙基、或被1个氯原子取代的亚乙基或亚丙基，特别优选为亚乙基或亚丙基。r^c优选为碳原子数为4～8的直链或支链烷基、或碳原子数为3～8的脂环式烃基，更优选为碳原子数为4～6的直链或支链烷基、或碳原子数为3～6的脂环式烃基，特别优选为丁基或环己基。

作为上述an^-，优选的是卤化物离子、硫酸根离子、磷酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子，特别优选的是卤化物离子。

式(a)及(b)中，m优选表示0～3的整数，更优选表示1或2的整数，特别优选为1。

作为上述式(a)的具体例，可举出乙烯基膦酸、(甲基)丙烯酸磷酰氧基乙酯、(甲基)丙烯酸3-氯-2-磷酰氧基丙酯、(甲基)丙烯酸磷酰氧基丙酯、(甲基)丙烯酸磷酰氧基甲酯、磷酰氧基聚氧乙二醇单(甲基)丙烯酸酯、磷酰氧基聚氧丙二醇单(甲基)丙烯酸酯等，其中，可优选使用乙烯基膦酸、甲基丙烯酸磷酰氧基乙酯(＝磷酸2-(甲基丙烯酰基氧基)乙酯)。

乙烯基膦酸、甲基丙烯酸磷酰氧基乙酯(＝磷酸2-(甲基丙烯酰基氧基)乙酯)、磷酰氧基聚氧乙二醇单甲基丙烯酸酯及磷酰氧基聚氧丙二醇单甲基丙烯酸酯的结构式分别由下述式(a-1)～式(a-4)表示。

[化学式10]

在合成上述化合物时，有时包含后述的通式(d)或(e)表示那样的具有2个官能团的(甲基)丙烯酸酯化合物。

作为上述式(b)的具体例，可举出(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸二乙基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸二甲基氨基丙酯、(甲基)丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯、甲基丙烯酰基胆碱氯化物等，这些中，可优选使用(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙酯、甲基丙烯酰基胆碱氯化物或(甲基)丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯。

丙烯酸二甲基氨基乙酯(＝丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(＝甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯)、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(＝甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯)、甲基丙烯酰基胆碱氯化物及甲基丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯(＝甲基丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯)的结构式分别由下述式(b-1)～式(b-5)表示。

[化学式11]

作为上述式(c)的具体例，可举出(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸月桂基酯、(甲基)丙烯酸硬脂基酯等(甲基)丙烯酸的直链或支链烷基酯类；(甲基)丙烯酸环己酯、(甲基)丙烯酸异冰片基酯等(甲基)丙烯酸的环状烷基酯类；(甲基)丙烯酸苄酯、(甲基)丙烯酸苯乙酯等(甲基)丙烯酸的芳烷基酯类；苯乙烯、甲基苯乙烯、氯甲基苯乙烯等苯乙烯系单体；甲基乙烯基醚、丁基乙烯基醚等乙烯基醚系单体；乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯等乙烯基酯系单体。其中，可优选使用(甲基)丙烯酸丁酯或(甲基)丙烯酸环己酯。

甲基丙烯酸丁酯(＝甲基丙烯酸丁基酯)及甲基丙烯酸环己酯(＝甲基丙烯酸环己基酯)的结构式分别由下述式(c-1)及式(c-2)表示。

[化学式12]

本发明涉及的共聚物中含有的包含式(a)表示的基团的重复单元(或式(a1)表示的重复单元)的比例为3摩尔％～80摩尔％，优选为3.5摩尔％～50摩尔％，进一步优选为4摩尔％～40摩尔％。需要说明的是，本发明涉及的共聚物可含有2种以上包含式(a)表示的基团的重复单元(或式(a1)表示的重复单元)。

本发明涉及的共聚物中含有的包含式(b)表示的基团的重复单元(或式(b1)表示的重复单元)的比例为3摩尔％～80摩尔％，优选为5摩尔％～70摩尔％，进一步优选为8摩尔％～65摩尔％。需要说明的是，本发明涉及的共聚物可含有2种以上包含式(b)表示的基团的重复单元(或式(b1)表示的重复单元)。

本发明涉及的共聚物中含有的包含式(c)表示的基团的重复单元(或式(c1)表示的重复单元)的比例可以是从全部共聚物中减去上述式(a)及式(b)后剩余的部分全部，也可以是从全部共聚物中减去上述式(a)及式(b)和下文中记载的第4成分的总比例后剩余的部分全部，例如为1摩尔％～90摩尔％，优选为3摩尔％～88摩尔％，进一步优选为5摩尔％～87摩尔％。需要说明的是，本发明涉及的共聚物可含有2种以上包含式(c)表示的基团的重复单元(或式(c1)表示的重复单元)。

对于本发明涉及的共聚物中的上述式(a1)、式(b1)及式(c1)表示的重复单元的比例的组合而言，

优选为：

式(a1)：3摩尔％～80摩尔％，式(b1)：3摩尔％～80摩尔％，式(c1)：1摩尔％～90摩尔％，

更优选为：

式(a1)：3.5摩尔％～50摩尔％，式(b1)：5摩尔％～70摩尔％，式(c1)：3摩尔％～88摩尔％，

进一步优选为：

式(a1)：4摩尔％～40摩尔％，式(b1)：8摩尔％～65摩尔％，式(c1)：5摩尔％～87摩尔％。

此外，本发明涉及的共聚物中可以共聚有任选的第4成分。例如，共聚具有2个以上官能团的(甲基)丙烯酸酯化合物作为第4成分，聚合物的一部分可以部分地三维交联。作为这样的第4成分，可举出例如下述式(d)或(e)表示的二官能性单体。

[化学式13]

[式中，t^d、t^e及u^e各自独立地表示氢原子或碳原子数为1～5的直链或支链烷基，r^d及r^e各自独立地表示可以被卤素原子取代的碳原子数为1～10的直链或支链亚烷基；n表示1～6的整数]

即，本发明涉及的共聚物优选为包含由这样的二官能性单体衍生的交联结构的共聚物。

式(d)及(e)中，t^d及t^e优选各自独立地为氢原子、甲基或乙基，更优选各自独立地为氢原子或甲基。

式(e)中，u^e优选为氢原子、甲基或乙基，更优选为氢原子。

式(d)中，r^d优选为可以被卤素原子取代的碳原子数为1～3的直链或支链亚烷基，更优选各自独立地为亚乙基或亚丙基、或被1个氯原子取代的亚乙基或亚丙基，特别优选为亚乙基或亚丙基。另外，式(d)中，n优选表示1～5的整数，特别优选为1。

式(e)中，r^e优选为可以被卤素原子取代的碳原子数为1～3的直链或支链亚烷基，更优选各自独立地为亚乙基或亚丙基、或被1个氯原子取代的亚乙基或亚丙基，特别优选为亚乙基或亚丙基。另外，式(e)中，n优选表示1～5的整数，特别优选为1。

关于式(d)表示的二官能性单体，优选可举出乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、或来自上述式(a-3)的二官能性单体等。

关于式(e)表示的二官能性单体，优选可举出磷酸双(甲基丙烯酰基氧基甲基)酯、磷酸双[(2-甲基丙烯酰基氧基)乙基]酯、磷酸双[3-(甲基丙烯酰基氧基)丙基]酯、或来自上述式(a-3)的二官能性单体。

任选的第4成分可以是3官能性单体。关于作为这样的第4成分的3官能性单体，可举出例如三丙烯酸氧次膦基三(氧基-2,1-乙烷二基)酯(triacrylicacidphosphinylidynetris(oxy-2,1-ethanediyl)ester)。

这些第4成分中，尤其是乙二醇二甲基丙烯酸酯、来自上述式(a-3)及(a-4)的二官能性单体中，具有乙二醇及丙二醇的重复单元的二甲基丙烯酸酯、磷酸双[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]酯以及来自上述式(a-3)及(a-4)的二官能性单体中，优选经由磷酸酯基具有乙二醇及丙二醇的重复单元的二甲基丙烯酸酯，其结构式分别由下述式(d-1)～(d-3)及式(e-1)～(e-3)表示。

[化学式14]

共聚物中可以包含上述第4成分中的1种或2种以上。

上述共聚物中的第4成分、例如由上述式(d)或(e)表示的二官能性单体衍生的交联结构的比例为0摩尔％～50摩尔％。

式(a)表示的化合物相对于形成上述共聚物的全部单体的比例为3摩尔％～80摩尔％，优选为3.5摩尔％～50摩尔％，进一步优选为4摩尔％～40摩尔％。另外，式(a)表示的化合物可以为2种以上。

式(b)表示的化合物相对于形成上述共聚物的全部单体的比例为3摩尔％～80摩尔％，优选为5摩尔％～70摩尔％，进一步优选为8摩尔％～65摩尔％。另外，式(b)表示的化合物可以为2种以上。

式(c)表示的化合物相对于形成上述共聚物的全部单体的比例可以是减去上述式(a)及(b)的比例后剩余的部分全部，也可以是减去上述式(a)及(b)和上述第4成分的总比例后剩余的部分，例如为1摩尔％～90摩尔％，优选为3摩尔％～88摩尔％，进一步优选为5摩尔％～87摩尔％。另外，式(c)表示的化合物可以为2种以上。

本发明涉及的共聚物中可以进一步共聚有烯键式不饱和单体、或多糖类或其衍生物作为任选的第5成分。作为烯键式不饱和单体的例子，可举出选自由(甲基)丙烯酸及其酯、乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、乙烯、乙烯醇、以及它们的亲水性的官能性衍生物组成的组中的1种或2种以上的烯键式不饱和单体。作为多糖类或其衍生物的例子，可举出羟基烷基纤维素(例如，羟乙基纤维素或羟丙基纤维素)等纤维素系高分子、淀粉、葡聚糖、凝胶多糖。

所谓亲水性的官能性衍生物，是指具有亲水性的官能团或结构的烯键式不饱和单体。作为亲水性的官能性基团或结构的例子，可举出甜菜碱结构、酰胺结构、亚烷基二醇残基、氨基、以及亚磺酰基等。

甜菜碱结构是指具有季铵型的阳离子结构、和酸性的阴离子结构的两性中心的化合物的一价或二价的基团，可举出例如磷酰胆碱基。

[化学式15]

作为具有这样的结构的烯键式不饱和单体的例子，可举出2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酰胆碱(mpc)等。

酰胺结构是指下述式表示的基团。

[化学式16]

[此处，r¹⁶、r¹⁷及r¹⁸相互独立地为氢原子或有机基团(例如，甲基、羟基甲基或羟基乙基等)]

作为具有这样的结构的烯键式不饱和单体的例子，可举出(甲基)丙烯酰胺、n-(羟基甲基)(甲基)丙烯酰胺等。此外，具有这样的结构的单体或聚合物例如在日本特开2010-169604号公报等中被公开。

亚烷基二醇残基是指亚烷基二醇(ho-alk-oh；此处，alk为碳原子数为1～10的亚烷基)的一侧末端或两末端的羟基与其他化合物进行缩合反应后残留的亚烷基氧基(-alk-o-)，也包括亚烷基氧基单元重复而成的聚(亚烷基氧基)基团。作为具有这样的结构的烯键式不饱和单体的例子，可举出(甲基)丙烯酸2-羟基乙酯、甲氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯等。此外，具有这样的结构的单体或聚合物例如在日本特开2008-533489号公报等中被公开。

氨基是指式-nh2、-nhr¹⁹或-nr²⁰r²¹[此处，r¹⁹、r²⁰及r²¹相互独立地为有机基团(例如，碳原子数为1～5的直链或支链烷基等)]表示的基团。本发明中的氨基包括经季铵化或氯化的氨基。作为具有这样的结构的烯键式不饱和单体的例子，可举出(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯、甲基丙烯酰基胆碱氯化物等。

亚磺酰基是指下述式表示的基团。

[化学式17]

[此处，r²²为有机基团(例如碳原子数为1～10的有机基团，优选具有1个以上羟基的碳原子数为1～10的烷基等)]

作为具有这样的结构的聚合物，可举出日本特开2014-48278号公报等中公开的共聚物。

＜共聚物的制造方法＞

本发明涉及的共聚物可利用常规的作为丙烯酸类聚合物或甲基丙烯酸类聚合物等的合成方法的自由基聚合、阴离子聚合、阳离子聚合等方法合成。其方式可以是溶液聚合、悬浮聚合、乳液聚合、本体聚合等各种方法。

作为反应用溶剂，可以是水、磷酸缓冲液或乙醇等醇或将它们组合而成的混合溶剂，优选包含水或乙醇。进一步优选地，包含10质量％以上且100质量％以下的水或乙醇。进一步优选地，包含50质量％以上且100质量％以下的水或乙醇。进一步优选地，包含80质量％以上且100质量％以下的水或乙醇。进一步优选地，包含90质量％以上且100质量％以下的水或乙醇。优选地，水和乙醇合计为100质量％。

作为反应浓度，例如，优选使包含上述式(a)表示的基团的单体、包含上述式(b)表示的基团的单体、和包含上述式(c)表示的基团的单体的反应溶剂中的浓度为0.01质量％～4质量％。浓度高于4质量％时，例如由于式(a)表示的磷酸基所具有的强缔合性，有时共聚物在反应溶剂中发生凝胶化。浓度低于0.01质量％时，得到的清漆的浓度过低，因此，难以制成用于得到膜厚足够厚的涂覆膜的涂覆膜形成用组合物。浓度更优选为0.01质量％～3质量％，例如为3质量％或2质量％。

本发明涉及的共聚物的合成中，可以在将包含上述式(a)表示的基团的单体、和包含上述式(b)表示的基团的单体形成为例如式(1)中记载的盐后，与包含上述式(c)表示的基团的单体进行聚合来制作共聚物。

[化学式18]

含有磷酸基的单体是容易缔合的单体，因此，当将其向反应系中滴加时，为了能快速地分散，可每次少量地向反应溶剂中滴加。此外，对于反应溶剂而言，为了提高单体及聚合物的溶解性，可以进行加热(例如40℃～100℃)。

为了高效地进行聚合反应，优选使用聚合引发剂。作为聚合引发剂的例子，可使用2,2’-偶氮双(异丁腈)、2,2’-偶氮双(2-甲基丁腈)、2,2’-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)(和光纯药工业(株)制：va-065，10小时半衰期温度：51℃)、4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)、2,2’-偶氮双(4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈)、1,1’-偶氮双(环己烷-1-甲腈)、1-[(1-氰基-1-甲基乙基)偶氮]甲酰胺、2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]、2,2’-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐、2,2’-偶氮双[2-甲基-n-(2-羟基乙基)丙酰胺](和光纯药工业(株)制：va-086，10小时半衰期温度：86℃)、过氧化苯甲酰(bpo)、2,2’-偶氮双[n-(2-羧基乙基)-2-甲基丙脒]n^-水合物(和光纯药工业(株)制：va-057，10小时半衰期温度：57℃)、4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)(和光纯药工业(株)制：v-501)、2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(和光纯药工业(株)制：va-044，10小时半衰期温度：44℃)、2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二硫酸盐二水合物(和光纯药工业(株)制：va-046b，10小时半衰期温度：46℃)、2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷](和光纯药工业(株)制：va-061，10小时半衰期温度：61℃)、2,2’-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(和光纯药工业(株)制：v-50，10小时半衰期温度：56℃)、过二硫酸或叔丁基过氧化氢等，这些中，考虑到离子平衡、在水中的溶解性，优选使用2,2’-偶氮双[2-甲基-n-(2-羟基乙基)丙酰胺]、2,2’-偶氮双[n-(2-羧基乙基)-2-甲基丙脒]n^-水合物、4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)、2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐、2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二硫酸盐二水合物、2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]、2,2’-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐或过二硫酸中的任何。

作为聚合引发剂的添加量，相对于聚合中使用的单体的总重量而言，为0.05质量％～10质量％。

对于反应条件而言，通过利用油浴等将反应容器加热至50℃～200℃，进行1小时～48小时搅拌，更优选加热至80℃～150℃，进行5小时～30小时搅拌，从而使得聚合反应得以进行，得到本发明涉及的共聚物。反应气氛优选为氮气气氛。作为反应步骤，可以将所有反应物质全部放入室温的反应溶剂中，然后加热至上述温度，进行聚合，也可以逐次少量地向经预先加热的溶剂中滴加反应物质的混合物的全部或一部分。

例如，作为后者的反应步骤，将包含上述式(a)、(b)及(c)表示的化合物、溶剂及聚合引发剂的混合物滴加至保持为比该聚合引发剂的10小时半衰期温度高的温度的溶剂中，进行反应(聚合)。通过采用上述反应步骤和温度条件，可使上述式(a)、式(b)或式(c)表示的化合物在反应溶剂中的浓度为例如0.01质量％～10质量％。这种情况下，即使浓度超过4质量％，也会在反应前，滴加相及反应相成为透明均匀，可抑制反应后的共聚物在反应溶剂中凝胶化。

本发明涉及的共聚物的分子量可以为数千至数百万程度，优选为5,000～5,000,000。进一步优选为10,000～2,000,000。另外，可以是无规共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物中的任何，用于制造该共聚物的共聚反应自身没有特别限制，可使用利用自由基聚合、离子聚合、光聚合、乳液聚合的聚合等在已知的溶液中合成的方法。对于上述共聚物而言，根据目标用途，可单独使用本发明的共聚物中的任何，也可混合多种共聚物，并且改变其比率地使用。

如上所述地制造的各种共聚物可以是二维聚合物也可以是三维聚合物，为在含有水的溶液中分散的状态。即，优选在含有这些聚合物的清漆中，不发生不均匀的凝胶化、白浊沉淀，优选为透明的清漆、分散胶体状的清漆、或溶胶。

本发明的细胞培养容器的特征在于，在容器表面的至少一部分涂覆有上述共聚物，优选在可与细胞及培养液接触的容器的内部表面涂覆上述共聚物，更优选在容器的整个表面涂覆上述共聚物。上述共聚物在细胞培养容器上的涂层可利用已知的手段(具体为后述的《细胞培养容器的制造方法》项及实施例中记载的手段)形成。本发明的细胞培养容器的涂层的厚度可根据容器的形状、目的适当选择，优选为更优选为特别优选为本发明的细胞培养容器通过这样的涂层从而具有优异的抑制细胞、蛋白质附着的能力。

《细胞培养容器的制造方法》

本发明的第二方式是细胞培养容器的制造方法，其包括在容器表面的至少一部分涂覆下述共聚物的工序，所述共聚物含有：包含下述式(a)表示的基团的重复单元、包含下述式(b)表示的基团的重复单元、和包含下述式(c)表示的基团的重复单元，

[化学式19]

(式中，u^a1、u^a2、u^b1、u^b2及u^b3、r^c以及an^-与上文所述含义相同)

＜涂覆工序＞

本发明的细胞培养容器的制造方法的涂覆工序中，将共聚物涂覆于容器表面的至少一部分。例如，容器为圆底的多孔培养板时，可以仅涂覆在孔的凹陷部分，但也可涂覆培养板整体。此处，容器及共聚物分别为上文中的＜容器＞及＜共聚物＞项中的说明所示的那样。

涂覆工序没有特别限制，可利用能使得容器与共聚物接触的、本领域技术人员已知的任何涂覆手段(例如，涂布、浸渍等)实施。例如，可通过将包含共聚物的清漆涂布于容器、或在包含共聚物的清漆中浸渍容器而实施。优选通过在包含共聚物的清漆中浸渍容器而实施。

包含共聚物的清漆可通过以所期望的浓度将上述的＜共聚物的制造方法＞项中得到的共聚物溶解到适当的溶剂中来制备，或也可将在所述制造方法中得到的含有共聚物的反应溶液直接作为清漆使用或稀释成所期望的固态成分浓度后作为清漆使用。作为清漆中含有的溶剂，可举出水、磷酸缓冲液(pbs)、醇。作为醇，可举出碳数2～6的醇、例如，乙醇、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-庚醇、2-庚醇、2,2-二甲基-1-丙醇(＝新戊醇)、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇(＝叔戊醇)、3-甲基-1-丁醇、3-甲基-3-戊醇、环戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇、2,3-二甲基-2-丁醇、3,3-二甲基-1-丁醇、3,3-二甲基-2-丁醇、2-乙基-1-丁醇、2-甲基-1-戊醇、2-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、3-甲基-1-戊醇、3-甲基-2-戊醇、3-甲基-3-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、4-甲基-3-戊醇及环己醇，可单独使用或使用它们组合而成的混合溶剂，优选从水、pbs及乙醇中选择。为了将共聚物溶解，一定含有水。

作为清漆中的共聚物的浓度，为0.01～4质量％，进一步优选为0.01～3质量％、进一步优选为0.01～2质量％、进一步优选为0.01～1质量％。共聚物的浓度低于0.01质量％时，无法形成膜厚足够厚的涂层，高于4质量％时，清漆的保存稳定性变差，可能会发生溶解物的析出、凝胶化。

需要说明的是，在清漆中，除了上述共聚物和溶剂之外，根据需要，也可在不损害得到的涂层的性能的范围内添加其他物质。作为其他物质，可举出防腐剂、表面活性剂、提高与基材(容器)的密合性的底漆、防霉剂及糖类等。

为了调节清漆中的共聚物的离子平衡，包含共聚物的清漆可预先经ph调节。ph调节例如可通过向包含共聚物的清漆中添加ph调节剂、使清漆的ph为3.5～8.5、优选为4.0～8.0而实施。可使用的ph调节剂的种类及其量可根据清漆中的共聚物的浓度、共聚物的阴离子与阳离子的存在比等适当选择。作为ph调节剂的例子，可举出氨、二乙醇胺、吡啶、n-甲基-d-葡萄糖胺、三(羟基甲基)氨基甲烷等有机胺；氢氧化钾、氢氧化钠等碱金属氢氧化物；氯化钾、氯化钠等碱金属卤化物；硫酸、磷酸、盐酸、碳酸等无机酸或其碱金属盐；胆碱等季铵阳离子；或它们的混合物(例如，磷酸缓冲生理盐水等缓冲液)。这些中，优选氨、二乙醇胺、n-甲基-d-葡萄糖胺、三(羟基甲基)氨基甲烷、氢氧化钠及胆碱，特别优选氨、二乙醇胺、氢氧化钠及胆碱。

使这样的包含共聚物的清漆与容器接触，在其表面的至少一部分形成涂层。涂层优选遍及容器的整个表面地形成。

需要说明的是，在涂覆工序之前，可针对容器的表面实施已知的uv/臭氧处理而将其洗涤。所述洗涤工序可使用市售的uv/臭氧清洁器等实施。

＜干燥·洗涤·灭菌工序＞

在涂覆工序后，优选于-200℃～200℃的温度将经涂覆的容器干燥。通过干燥，不仅得以除去上述涂覆膜形成用组合物中的溶剂，而且，本发明涉及的共聚物的式(a)及式(b)彼此形成离子键，完全固着于基体。本发明的细胞培养容器的涂层的膜厚优选为更优选为特别优选为本申请的发明人发现，通过本发明的细胞培养容器的制造方法，不需要高温下的处理，通过低温下的处理，即可在容器的表面上形成具有所期望的特性的涂层，而且即使是程度的薄膜厚，耐久性也优异，并且，具有优异的抑制细胞、蛋白质附着的能力。

干燥例如可于室温(10℃～35℃、例如25℃)实施，但为了更快速地形成涂覆膜，例如也可于40℃～50℃实施。另外，也可利用冷冻干燥法于极低温～低温(-200℃～-30℃左右)实施。冷冻干燥也被称为真空冷冻干燥，通常是用制冷剂将想要干燥的物质冷却，在真空状态下，利用升华而除去溶剂的方法。作为在冷冻干燥中使用的常规的制冷剂，可举出干冰和甲醇的混合介质(-78℃)、液氮(-196℃)等。更优选的干燥温度为10℃～180℃，进一步优选的干燥温度为25℃～150℃。

需要说明的是，在干燥工序之前和/或干燥工序之后，可用乙醇等碳原子数1～5的醇和/或水对经涂覆的容器的表面进行洗涤。上述洗涤工序可于0℃～60℃、优选25℃(室温)～40℃的温度，实施30分钟～48小时、优选1～24小时。

此外，在干燥工序后，为了除去残留于该涂层的杂质、未反应单体等，进一步地为了调节膜中的共聚物的离子平衡，也可使用选自由水及包含电解质的水溶液组成的组中的至少1种溶剂，利用流水洗涤或超声洗涤等进行洗涤。此处，也可在例如40℃～95℃的范围内，加热水或包含电解质的水溶液。包含电解质的水溶液优选为pbs及生理盐水(仅含有氯化钠)、dulbecco磷酸缓冲生理盐水、tris缓冲生理盐水、hepes缓冲生理盐水及veronal缓冲生理盐水，特别优选为pbs。

即使用醇、水、及pbs等洗涤，在容器的表面上形成的涂层也不溶出，保持原状态地牢固地固着于基材(即，容器)。形成的涂层具有抑制包括细胞、蛋白质在内的多种生物材料附着的能力。因此，本发明的细胞培养容器除了抑制细胞、蛋白质的附着之外，相对于溶剂的耐久性也优异。

根据需要，为了将经涂覆的容器灭菌，可实施放射线、电子束、环氧乙烷、高压釜等已知的灭菌处理。

《细胞凝集块的制造方法》

本发明的第三方式是细胞凝集块的制造方法，其特征在于，使用本发明的细胞培养容器及利用本发明的制造方法得到的细胞培养容器(以下将两者统称为“本发明的细胞培养容器”)。使用本发明的细胞培养容器时，可抑制细胞凝集块附着在容器的表面上，并且，可抑制涂层向培养液中的溶出，因此，可在不存在来自容器的刺激的状态下，培养细胞凝集块。优选使用具有以下特征的培养基培养细胞凝集块：在本发明的细胞培养容器中，包含多糖类(尤其是脱酰基化结冷胶)，所述多糖类具有使细胞或组织悬浮的效果。这样的培养基的具体组成、培养方法例如在国际公开第2014/017513号公报中公开。

[实施例]

以下，示出关于本发明的培养容器及其制造方法的合成例、实施例及试验例，但它们是为了进一步详细地说明本发明而示出的，本发明不受它们的限制。

＜原料组成的测定方法＞

包含含磷化合物的原料的各含磷化合物的浓度(质量％)测定通过³¹p-nmr进行。使用下述标准物质，算出原料中含有的各含磷化合物的绝对浓度(绝对质量％)。

(测定条件)

·模式：反门控去耦模式(定量模式)

·装置：varian400mhz

·溶剂：cd3od(氘代甲醇)(30重量％)

·转速：0hz

·数据点：64000

·翻转角(flipangle)：90°

·等待时间：70s

·累积次数：16次，n＝4，

·标准物质：三甲基磷酸+d2o(制备75％tmp溶液)

＜合成例1＞

向甲基丙烯酸磷酰氧基乙酯(制品名；phosmerm，uni-chemical公司制，干固法100℃·1小时时的不挥发成分：91.8％，甲基丙烯酸磷酰氧基乙酯(44.2质量％)、磷酸双[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]酯(28.6质量％)、其他物质(27.2质量％)的混合物)7.00g中添加纯水16.05g，将其充分溶解。接下来，将乙醇48.16g、甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯9.41g(东京化成工业(株)制)、甲基丙烯酸丁酯1.34g(东京化成工业(株)制)、2,2’-偶氮双(n-(2-羧基乙基)-2-甲基丙脒)n^-水合物(va-057，和光纯药工业(株)制)0.09g保持在20℃以下，并依次向phosmerm的水溶液中添加。将充分搅拌而变得均匀的包含上述全部物质的混合液导入至滴液漏斗中。另一方面，另行向带有冷凝管的三颈烧瓶中添加纯水96.31g，流通氮气流并进行搅拌，同时升温至回流温度。在维持该状态的同时，将导入了上述混合液的滴液漏斗设置于三颈烧瓶，经2小时向纯水和乙醇的沸腾液内滴加混合液。滴加后，在维持了上述环境24小时的状态下进行加热搅拌，由此得到固态成分约10质量％的含有共聚物的清漆178.35g。

＜比较合成例1＞

一边将甲基丙烯酸磷酰氧基乙酯(制品名；phosmerm，uni-chemical公司制，干固法100℃·1小时时的不挥发成分：91.8％，甲基丙烯酸磷酰氧基乙酯(44.2质量％)、磷酸双[2-(甲基丙烯酰基氧基)乙基]酯(28.6质量％)、其他物质(27.2质量％)的混合物)28.00g维持为60℃一边进行搅拌，滴加甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯21.37g。一边保持为20℃以下，一边向其中依次添加纯水133.96g、以及乙醇44.65g、(东京化成工业(株)制)、2,2’-偶氮双(n-(2-羧基乙基)-2-甲基丙脒)n^-水合物(va-057，和光纯药工业(株)制)0.25g。将充分搅拌而变得均匀的包含上述全部物质的混合液导入至滴液漏斗中。另一方面，另行向带有冷凝管的三颈烧瓶中装入纯水267.93g，在其中流通氮气并进行搅拌，同时升温至回流温度。在维持该状态的同时，将导入了上述混合液的滴液漏斗设置于三颈烧瓶，经2小时将混合液滴加至纯水和乙醇的沸腾液内。滴加后，在维持了上述环境24小时的状态下进行加热搅拌，由此得到固态成分约9.70质量％的含有共聚物的清漆496.16g。得到的透明液体的gfc的重均分子量约为280,000。

＜制备例1＞

(硅晶圆的准备)

直接使用半导体评价用的市售的硅晶圆。

(qcm传感器(ps)的制成)

使用uv/臭氧洗涤装置(uv253e，filgen,inc.制)，对蒸镀有au的晶体振荡器(q-sense，qsx304)进行10分钟洗涤，然后立即在将2-氨基乙烷硫醇(东京化成工业(株)制)0.0772g溶解于乙醇1000ml中而得到的溶液中浸渍24小时。用乙醇洗涤传感器表面，然后自然干燥，利用旋涂机，以3500rpm/30秒，将使聚苯乙烯(ps)(aldrich公司制)1.00g溶解于甲苯99.00g中而得到的清漆旋涂于膜传感器侧，进行120℃/1分钟干燥，由此，制成qcm传感器(ps)。

(涂层的制备)

向上述合成例1中得到的含有共聚物的清漆5.00g中添加纯水31.5g、乙醇1.35g、1mol/l氢氧化钠水溶液(1n)(关东化学(株)公司制)0.24g，充分搅拌，制备涂覆膜形成组合物。ph为7.3。将上述硅晶圆浸渍在得到的涂覆膜形成组合物中，在烘箱中于45℃进行24小时干燥。然后，用pbs和纯水对在涂覆膜上附着的未固化的膜形成用组合物进行充分洗涤，得到形成了涂覆膜的硅晶圆。使用上述硅晶圆，用光学式干涉膜厚计对涂覆膜的膜厚进行确认，结果为

另外，以3500rpm/30秒将上述涂覆膜形成用组合物旋涂于qcm传感器(ps)，作为干燥工序，在45℃的烘箱中进行24小时烘烤。然后，作为洗涤工序，用pbs和超纯水对过量附带的未固化的涂覆膜形成用组合物进行各2次洗涤，得到经表面处理的qcm传感器(ps)。

＜制备例2＞

直接使用上述qcm传感器(ps)。

＜制备例3＞

向上述比较合成例1中得到的含有共聚物的清漆45.00g中添加纯水265.92g、乙醇125.58g、1mol/l氢氧化钠水溶液(1n)(关东化学(株)公司制)8.18g，充分搅拌，制备涂覆膜形成用组合物。利用与实施例同样的方法，得到形成了涂覆膜的硅晶圆、或经表面处理的qcm传感器(ps)。使用上述硅晶圆，用光学式干涉膜厚计对涂覆膜的膜厚进行确认，结果为

＜试验例1：抑制蛋白质附着的效果＞

将制备例1～3中得到的经表面处理的qcm传感器(ps)安装于耗散型石英晶体微天平qcm-d(e4，q-sense)，流通pbs，直到确立了频率的变化在1小时内成为1hz以下的稳定的基线。接下来，将稳定的基线的频率作为0hz，流通约10分钟pbs。接着，流通在41010-basalmediumeagle(bme),无谷氨酰胺(thermofisherscientific公司制)中添加15wt％的牛血清(fbs)、l-谷氨酰胺、作为抗生素的青霉素和链霉素而得到的溶液约30分钟，然后，再次流通pbs约20分钟，然后读取11次谐波的吸附诱导的频率的位移(δf)。为了进行分析，使用q-tools(q-sense)，针对吸附诱导的频率的位移(δf)，将由sauerbrey式说明的吸附诱导的频率的位移(δf)换算为每单位面积的质量(ng/cm²)，将所得值作为生物材料的附着量示于下述的表1。使用了本发明涉及的合成例1的共聚物作为涂层的制备例1与无涂层的制备例2及使用了比较合成例1的共聚物作为涂层的制备例3相比，显示出了低一个数位的各种蛋白质吸附量。

[表1]

＜实施例1＞

依次实施以下的各处理工序，制备本发明中的细胞培养容器。

处理1：使用筛孔尺寸为0.22μm的过滤器对合成例1中制备的含有共聚物的清漆进行过滤，然后，以200μl(固态成分1质量％)/孔的量向96孔细胞培养板(bdbiosciences公司制，#351172)的孔中添加，于室温静置1小时，然后除去过量的清漆。

处理2：使用烘箱(advantectoyokaisha,ltd.制，干燥机fc-612)，于50℃干燥一夜。然后，每孔添加200μl灭菌水，然后除去并进行洗涤。同样地，进一步进行2次洗涤，得到经涂覆的细胞培养容器。

＜比较例1＞

将实施例1中使用的合成例1中制备的含有共聚物的清漆替换为比较合成例1中制备的含有共聚物的清漆，除此之外，与实施例1同样地操作，得到经涂覆的细胞培养容器。

＜试验例2：抑制细胞附着的效果＞

(涂覆培养板的制备)

使用实施例1及比较例1中得到的经涂覆的细胞培养容器。作为阳性对照的样品，使用市售的细胞低贴壁培养板(corning公司制，#3474)。作为阴性对照，使用未施以涂层的96孔细胞培养板(bdbiosciences公司制，#351172)。

(细胞的制备)

关于细胞，使用了小鼠胚胎成纤维细胞c3h10t1/2(dspharmabiomedical公司制)。作为细胞的培养中使用的培养基，使用含有10％fbs(hyclone公司制)和l-谷氨酰胺-青霉素-链霉素稳定化溶液(sigma-aldrich公司制)的bme培养基(thermofisherscientific公司制)。使用直径为10cm的培养皿(10ml培养基)，在37℃/co2培养箱内，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，将细胞静置培养2天以上。接着，用5mlpbs洗涤该细胞，然后添加胰蛋白酶-edta溶液(invitrogen公司制)1ml，将细胞剥离，将其分别悬浮于上述的培养基10ml中。将该悬浮液离心分离(tomyseikoco.,ltd.制，型号lc-200，1000rpm/3分钟，室温)后，除去上清液，添加上述的培养基，制备细胞悬浮液。

(细胞附着实验)

向上文中制备的培养板中，以2×10³个细胞/孔的量添加各100μl的各细胞悬浮液。然后，在保持5％二氧化碳浓度的状态下，于37℃在co2培养箱内静置4天。

(细胞附着的观察)

培养4天后，用倒置显微镜(奥林巴斯公司制，ckx31)对细胞在实施例1的培养板、比较例1的培养板、阳性对照、及阴性对照的培养板上的附着情况进行观察，基于观察结果进行比较。在实施例1的培养板、比较例1的培养板、及阳性对照的培养板中，几乎未观察到细胞的附着。将各培养板的结果(培养4天后)示于图1。另外，每孔添加10μl的cellcountingkit-8溶液(同仁化学研究所制)，于37℃在co2培养箱内静置2小时。然后，用吸光度计(moleculardevices公司制，spectramax)测定450nm的吸光度。对于各测定值而言，减去仅添加了各培养基的孔中的测定值。将其结果示于表2。

[表2]

如上所述，示出了除了阴性对照以外，所有培养板中均未附着有细胞。此时，未附着的细胞形成了细胞凝集块(细胞球)。

产业上的可利用性

对于本发明的细胞培养容器而言，在表面的至少一部分涂覆了包含特定的基团的共聚物。对于所述涂层而言，不仅可抑制细胞、蛋白质向容器表面的附着，而且涂层能牢固地固着在容器表面，因此，涂层向培养液中的溶出的抑制被改善。因此，本发明的细胞培养容器在能够在不存在来自容器的刺激的状态下培养细胞凝集块方面是有利的。