热稳定聚合酶抑制剂组合物和方法与流程
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本公开内容通常涉及热稳定聚合酶活性的核酸抑制剂、包含所述抑制剂的组合物及其使用方法。所述核酸抑制剂可以适应二级结构以可逆地抑制热稳定聚合酶，其中抑制活性是温度依赖性的。所述抑制剂可用于包括通过热稳定聚合酶的核酸合成的方法和测定，其中方法和测定受益于利用热启动方法。
背景技术：
核酸靶序列的体外合成(许多研究测定和诊断产物的基础)通常部分依赖于使用热稳定dna聚合酶和至少一种寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物被设计来特异性结合在怀疑含有靶标的样品中的靶核酸底物。虽然设计使用聚合酶和引物的测定以产生特定序列，但众所周知，如果测定需要在较低或环境温度下的一段时间，则靶特异性引物可与非靶序列杂交或可形成引物二聚体，导致错误启动(mispriming)并随后产生非特异性产物。这些产品是不希望的，因为它们可以掩盖目的产物以及过早耗尽必要试剂的反应混合物。
用于减少错误启动影响的主要手段是在更可能发生这种错误启动的较低温度下可逆地抑制热稳定聚合酶活性。在将聚合酶反应混合物的温度升高至接近热稳定聚合酶的最佳反应温度的温度时，除去抑制活性并且热稳定聚合酶延伸与底物核酸分子结合的引物。这种可逆地抑制嗜热dna聚合酶以防止引物在较低温度下延伸的方法被称为“热启动(hot-start)”。
热启动可以通过各种物理、化学或生物化学方法完成。在物理热启动中，dna聚合酶或dna聚合酶活性必需的一种或多种反应组分不允许与样品dna接触，直到反应所需的所有组分都处于高温(horton，r.m.等人，biotechniques，16；42-43，1994)。化学热启动是指涉及使用化学上可逆地失活的dna聚合酶的方法，使得聚合酶在环境温度下被抑制并且在更高温度下最具活性(美国专利号5,773,258和6,183,998)。实现热启动的另一种方法是将dna聚合酶与抗dna聚合酶抗体结合，然后将其加入试剂中。抗体在环境温度下抑制聚合酶活性，但在高聚合酶反应温度下，抗体变性并与聚合酶解离，从而激活聚合酶(sharkey等人，bio/technology，12：506-509(1994)；kellogg等人，biotechniques，16：1134-1137(1994))。
在环境温度下抑制嗜热dna聚合酶的另一种方法涉及使用结合至dna聚合酶并抑制dna聚合酶的核酸适体(aptamer)(美国专利号6,183,967)。适体是通过除经典watson-crick碱基配对之外的相互作用对分子具有特异性结合亲和力的核酸分子。已经选择并设计了各种适体以显示对热稳定聚合酶的特异性和亲和力，并且已经显示它们能够可逆地抑制聚合酶。与热稳定聚合酶的其他可逆抑制剂一样，设计适体以在环境温度下结合和抑制热稳定聚合酶。随后温度的升高导致适体与热稳定聚合酶解离，以允许在高反应温度下的引物延伸和/或核酸扩增。
当设计及选择用于需要热稳定聚合酶活性的反应的抑制性适体时，重要的是产生在合适的温度范围(例如最佳聚合酶活性的温度范围)内结合并抑制聚合酶的适体，但是在选定的引物与靶核酸底物杂交的温度下，适体也在允许最佳热稳定聚合酶活性的温度下与聚合酶解离。本文描述了适体，其可以形成二级结构，并且可以在依赖于热稳定聚合酶活性的各种测定中减少非特异性聚合酶产物的产生，但是可以与聚合酶解离以促进靶产物的产生和检测。
发明概述
在一个方面，提供了一种适体，其中适体在5′至3′方向包含：第一核苷酸序列，其包含tataattgcaaaataa(seqidno：1)或其变体或ttattttgcaattata(seqidno：2)或其变体；第二核苷酸序列，其包含ttcttagcgttt(seqidno：3)或其变体；第三核苷酸序列，其包含seqidno：1或其变体或seqidno：2或其变体；和第四核苷酸序列，其包含seqidno：3或其变体，其中第一序列与第二序列互补。
在一些实施方案中，适体具有二级结构，其中所述第一和第三核苷酸序列在低于约45℃、42℃、40℃、39℃或38℃的温度下杂交以形成茎(stem)，并且第二和第三核苷酸序列中的每一个保持单链以形成环，其中茎位于由第二和第三核苷酸序列形成的环之间。
在一些实施方案中，共价键存在于第一序列的5′末端和第四序列的3′末端之间。在其他实施方案中，共价键是磷酸二酯键。
在一些实施方案中，seqidno：1的变体包含1、2、3或4个核苷酸置换，并且第三核苷酸序列与seqidno：2的变体互补，其中seqidno：1和seqidno：2之间不存在错配。
在一些实施方案中，seqidno：2的变体包含1、2、3或4个核苷酸置换，并且第一核苷酸序列与seqidno：2的变体互补，其中seqidno：1和seqidno：2之间不存在错配。
在一些实施方案中，第一序列和第三序列中的每一个序列的长度为14-18、15-16或16-17个核苷酸。在其他实施方案中，第一序列和第三序列中的每一个序列的长度为14、15、16、17或18个核苷酸。在一个具体实施方案中，第一序列和第三序列中的每一个序列的长度为16个核苷酸。
在一些实施方案中，第一序列包含seqidno：1，第二序列包含seqidno：2。在其他实施方案中，第一序列由seqidno：1组成，第二序列由seqidno：2组成。
在一些实施方案中，第一序列选自seqidno：11-41或其变体，其中所述变体包含1、2、3或4个核苷酸置换。在其他实施方案中，第三序列与第一序列的长度相同，并且第三序列与第一序列互补，其中第一序列和第三序列之间不存在错配。在其他实施方案中，第一序列选自seqidno：11-41。
在一些实施方案中，第二序列沿着第二和第四序列的整体长度与第四序列相同。
在一些实施方案中，第二和第四序列中的每一个序列的长度为12个核苷酸。
在一些实施方案中，第二序列包含seqidno：3，第四序列包含seqidno：3。在其他实施方案中，第二序列由seqidno：3组成，第四序列由seqidno：3组成。
在一些实施方案中，适体不具有5′末端或3′末端。
在一些实施方案中，适体包含5′末端和3′末端，其中在第一序列内或在第二序列内的2个核苷酸之间不存在共价键。在其他实施方案中，seqidno：1或seqidno：2的核苷酸1和2、2和3、3和4、4和5、5和6、6和7、7和8、8和9、9和10、10和11、11和12、12和13、13和14、14和15，或15和16之间不存在共价键。
在一些实施方案中，第一序列包含seqidno：1，第三序列包含seqidno：2，并且在seqidno：1的核苷酸8和9之间不存在磷酸二酯键。在其他实施方案中，第一序列包含seqidno：2，第三序列包含seqidno：1，并且在seqidno：2的核苷酸8和9之间不存在磷酸二酯键。
在一些实施方案中，适体的第一和第三序列以双链构型彼此杂交。在其他实施方案中，当适体在25℃或37℃的溶液中时，适体的第一和第三序列以双链构型彼此杂交。在其他实施方案中，溶液的ph为约6至8。
在一些实施方案中，第二序列和第四序列都是单链构型。在其他实施方案中，当适体在25℃或37℃的溶液中时，第二序列和第四序列都是单链构型。在其他实施方案中，溶液的ph为约6至8。
在一些实施方案中，适体的熔解温度为约40℃至50℃、45℃至65℃、45℃至60℃、45℃至55℃、45℃至50℃、50℃至65℃或50℃至60℃。
在一些实施方案中，适体包含选自seqidno：42-53的序列或其变体，其中所述变体包含1、2、3或4个核苷酸置换。在其他实施方案中，适体包含选自seqidno：42-53的序列。在其他实施方案中，适体具有5′末端和3′末端。
在一些实施方案中，适体的5′末端包含磷酸基团。在其他实施方案中，适体的3′末端包含磷酸基团。在其他实施方案中，5′和3′末端各自包含磷酸基团。
在其他实施方案中，适体的3′末端与3′加帽(capping)部分连接。在另一个实施方案中，适体的5′末端与5′加帽部分连接。在其他实施方案中，适体的3′末端与5′加帽部分连接，适体的3′末端与5′加帽部分连接。
在一些实施方案中，5′加帽部分选自胺基团和反向脱氧胸苷帽。
在一些实施方案中，与3′末端连接的3′加帽部分选自磷酸、反向脱氧胸苷帽和丙二醇间隔基(c3)。
在一些实施方案中，适体包含：
caaaataattcttagcgtttttattttgcaattatattcttagcgttttataattg-c3(seqidno：106)；
caaaataattcttagcgtttttattttggaattatattcttagcgttttataattc-c3(seqidno：107)；
gaaaataattcttagcgtttttattttcgaattatattcttagcgttttataattc-c3(seqidno：108)；
caattatattcttagcgttttataattggaaaataattcttagcgtttttattttc-c3(seqidno：109)；
caattatattcttagcgttttataattgcaaaataattcttagcgtttttattttg-c3(seqidno：110)；或
gaattatattcttagcgttttataattcgaaaataattcttagcgtttttattttc-c3(seqidno：111)。在其他实施方案中，在包含seqidno：106-111之一的序列的适体的第一核苷酸和最后一个核苷酸之间不存在共价键。
在另一个方面，提供了适体，其中所述适体在5′至3′方向包含以下组分：包含seqidno：4或其变体或seqidno：5或其变体的第一多核苷酸；包含seqidno：3或其变体的第二多核苷酸；包含seqidno：5或其变体或seqidno：4或其变体的第三多核苷酸；和包含seqidno：3或其变体或seqidno：5或其变体的第四多核苷酸，其中第二和第四序列中的每一个长度为14-18个核苷酸，长度相等，并且沿其整体长度彼此互补；并且其中所述适体包含5′末端和3′末端。
在一些实施方案中，第一多核苷酸和第三多核苷酸彼此退火以形成茎。
在一些实施方案中，第二和第四多核苷酸中的每一个不与适体的另一区域退火，并且第二和第四多核苷酸中的每一个形成第一环和第二环。
在一些实施方案中，茎位于第一环和第二环之间。
在一些实施方案中，第四序列的3′末端与第一序列的5′末端共价结合，并且在第四序列内的2个核苷酸之间不存在磷酸二酯键。
在一些实施方案中，第四序列的3′末端与第一序列的5′末端共价结合，并且在第三序列的最后的核苷酸和第四序列的第一个核苷酸之间不存在磷酸二酯键。
在一些实施方案中，在第四序列中的seqidno：3的核苷酸1和2、2和3、3和4、4和5、5和6、6和7、7和8、8和9、9和10、10和11，或11和12之间不存在磷酸二酯键。
在一些实施方案中，第一多核苷酸包含选自seqidno：54-77的序列。
在一些实施方案中，第一多核苷酸和第三多核苷酸具有相同的长度。在其他实施方案中，第一多核苷酸和第三多核苷酸之间不存在错配。
在一些实施方案中，第一序列沿第一和第三序列的整体长度与第三序列相同。
在一些实施方案中，第一和第三序列中的每一个的长度为12个核苷酸。
在一些实施方案中，第一序列包含seqidno：3，第三序列包含seqidno：3。在其他实施方案中，第一序列由seqidno：3组成，第三序列由seqidno：3组成。
在一些实施方案中，适体包含选自seqidno：82-105的序列。
在一些实施方案中，适体的5′末端包含磷酸基团。在其他实施方案中，适体的3′末端包含磷酸基团。在其他实施方案中，5′和3′末端各自包含磷酸基团。
在其他实施方案中，适体的3′末端与3′加帽部分连接。在另一个实施方案中，适体的5′末端与5′加帽部分连接。在其他实施方案中，适体的3′末端与5′加帽部分连接，适体的3′末端与5′加帽部分连接。
在一些实施方案中，5′加帽部分选自胺基团和反向脱氧胸苷帽。
在一些实施方案中，与3′末端连接的3′加帽部分选自磷酸、反向脱氧胸苷帽和丙二醇间隔基(c3)。
在一个方面，提供了一种组合物，其包含热稳定聚合酶和根据前述方面和实施方案中任一项的适体，其中所述适体抑制所述聚合酶的活性。
在一些实施方案中，组合物中适体：聚合酶的摩尔比为约1∶1至20∶1、2∶1至15∶1、5∶1至20∶1、10∶1至20∶1、12∶1至18∶1、14∶1至16∶1、1∶1至10∶1、5∶1至10∶1，或12∶1至18∶1。在其他实施方案中，组合物中适体：聚合酶的摩尔比为约1∶1、2∶1、4∶1、5∶1、8∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、16∶1、17∶1、18∶1、19∶1或20∶1。
在一些实施方案中，聚合酶选自栖热水生菌(thermusaquaffcus)、嗜热栖热菌(thermusthermophilus)或海栖栖热菌(thermusmaritima)。
在一些实施方案中，组合物还包含脱氧核糖核苷酸三磷酸和二价金属阳离子。
在一些实施方案中，组合物还包含正向引物。在其他实施方案中，组合物包含正向引物和反向引物。在其他实施方案中，正向和/或反向引物对靶核酸是特异性的。
在一些实施方案中，组合物是干燥的组合物。
在一些实施方案中，组合物是液体组合物。
在一个方面，提供了用于延伸引物的方法，其中所述方法包括将引物与热稳定聚合酶和根据前述方面和实施方案中任一项的适体混合以形成反应混合物。
在一些实施方案中，引物对靶核酸序列是特异性的。
在一些实施方案中，所述方法还包括添加反向引物。在其他实施方案中，所述反向引物对靶核酸序列是特异性的。
在一些实施方案中，所述方法还包括向反应混合物中加入脱氧核糖核苷酸三磷酸和二价金属阳离子。
在一些实施方案中，适体在低于45℃、40℃、37℃、35℃、32℃或30℃的温度下抑制、降低或消除聚合酶活性。
在一个方面，提供了一种试剂盒，其中所述试剂盒包含组合物，所述组合物包含根据前述方面和实施方案中任一项的适体和热稳定聚合酶。
在一些实施方案中，试剂盒还包含正向和反向引物，每种引物对靶核酸序列是特异性的。
在一些实施方案中，试剂盒包含引物和至少一种用于检测和/或确定靶核酸序列的序列的探针。
在一些实施方案中，组合物还包含对靶核酸序列特异性的正向寡核苷酸引物。在其他实施方案中，组合物还包含反向寡核苷酸引物，其对靶核酸序列是特异性的。
在一些实施方案中，试剂盒还包含逆转录酶。
在一些实施方案中，组合物还包含逆转录酶。
在一些实施方案中，组合物是干燥的组合物。
在一些实施方案中，组合物是液体组合物。
当结合以下详细描述阅读时，本发明的这些和其他目的和特征将变得更加明显。
附图说明
图1a和1b说明了不具有5′和3′末端的封闭适体(1a)以及可被合成以产生图1a中所示的封闭适体的寡核苷酸序列(1b)。
图2a和2b说明了具有5′末端(下划线c)和3′末端(方框g)的适体(图2a)以及可被合成以产生图2a中所示的开放适体的寡核苷酸序列(图2b)。在这个具有预期的两个环之间的茎结构的开放适体的图示中，在5′c和3′g之间不存在共价键。
图3a和3b说明了具有3′突出端(overhang)的发夹型适体(图3a)以及可被合成以产生图3a中所示的开放预期的发夹型适体的寡核苷酸序列(图3b)。下划线表示包含ttcttagcgttt(seqidno：3)的环序列的两个部分，其中seqidno：3内的两个核苷酸之间不存在共价键(例如，磷酸二酯键)允许在环境温度下形成预期的发夹结构。
图4a和4b说明了用于检测基因组dna中的2种靶序列的实时pcr反应(实施例4)的结果。在不存在(图4a)和存在(图4b)根据本公开内容的适体的情况下进行反应。荧光的增加表明pcr产物的产生。
图5a和5b说明了图4a和4b中所示的实时pcr反应的pcr后熔解曲线分析(实施例4)。在不存在(图5a)和存在(图5b)根据本公开内容的适体的情况下产生的pcr产物的熔解曲线分析显示，存在根据本公开内容的适体导致产生更大量的靶扩增子和更少量的非特异性产物。
发明详述
现在将在下文中更全面地描述各个方面。然而，这些方面可以以许多不同的形式实施，并且不应该被解释为限于本文中阐述的实施方案；相反，提供这些实施方案是为了使本公开内容充分和完整，并且将其范围完全传达给本领域技术人员。
除非另有说明，否则本公开内容的实践将采用本领域技术范围内的化学、生物化学和药理学的常规方法。这些技术在文献中有充分解释。参见，例如；a.l.lehninger，biochemistry(worthpublishers，inc.，当前添加(currentaddition))；morrisonandboyd，organicchemistry(allynandbacon，inc.，当前添加)；j.march，advancedorganicchemistry(mcgrawhill，当前添加)；remington：thescienceandpracticeofpharmacy，a.gennaro，ed.，第20版；goodman&gilmanthepharmacologicalbasisoftherapeutics，j.griffithhardman，l.l.limbird，a.gilman，第10版。
在提供数值范围的情况下，意图是该范围的上限和下限之间的每个中间值以及该规定范围内的任何其他规定值或中间值被包含在本公开内容内。例如，如果规定1％至8％的范围，则意图是也明确公开2％、3％、4％、5％、6％和7％，以及大于或等于1％的值的范围以及小于或等于8％的值的范围。
i.定义
必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文中描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法、装置和材料。本文中提及的所有出版物均通过引用并入本文，用于描述和公开可与本发明结合使用的出版物中报道的方法。
短语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连锁(linkage)的核酸，其是合成的、天然存在的或非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-o-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(pna)。
如本文所用，术语“热稳定聚合酶”或“嗜热聚合酶”是指当与例如来自大肠杆菌(e.coli)的核苷酸聚合酶比较时对热相对稳定，并且催化核苷三磷酸的模板依赖性聚合的酶。“热稳定聚合酶”当经受用于pcr的反复加热和冷却循环时，将例如保持用于聚合的酶活性和核酸外切酶活性。优选地，“热稳定核酸聚合酶”在高于45℃的温度下，或在40℃至80℃，更优选55℃至75℃的温度下具有最佳活性。从栖热水生菌分离的代表性热稳定聚合酶(taq)描述于美国专利号4,889,818中，在常规pcr中使用它的方法描述于saiki等人，1988，science239：487中。其他热稳定dna聚合酶包括但不限于来自嗜热真细菌(eubacteria)或古细菌(archaebacteria)的dna聚合酶，例如嗜热栖热菌、布氏栖热菌(t.brockianus)、黄色栖热菌(t.flavus)、红色栖热菌(t.rubber)、thermococcuslitoralis、激烈热球菌(pyroccocusfuriousus)、p.wosei、火球菌属(pyrococcus)物种kgd、海栖热袍菌(thermatogamaritime)、嗜酸热原体(thermoplasmaacidophilus)和硫化叶菌属(sulfolobus)物种。在55-60℃之间起作用的逆转录酶包括但不限于mmlv逆转录酶、amv逆转录酶、rsv逆转录酶、hiv-1逆转录酶和hiv-2逆转录酶。
如本文所用的术语“适体”是指对靶分子(例如蛋白质)具有特异性结合亲和力的核酸。与所有核酸一样，特定核酸配体可以通过核苷酸的线性序列(a、u、t、c和g)进行描述，通常为30-75个核苷酸长。适体也可以用预期的二级结构区域来描述，其中适体的单链部分与相同适体的另一个单链部分互补，从而可以彼此杂交(退火)以形成在本文中被称为“茎”的双链体，预期不与相同适体的其他部分杂交的适体部分在本文中称为“环”。通常，环的每个末端连接至茎的末端从而提供环构型。
术语“加帽部分”是指与适体或其他核酸的3′或5′末端连接的部分，其改变核酸的稳定性、防止核酸的聚合酶延伸和/或增加核酸二聚体形成的效率。“帽结构”是指化学修饰，其已被掺入寡核苷酸的末端(参见，例如，matulic-adamic等人，美国专利号5,998,203)。在非限制性实例中：合适的5′-帽可以是选自以下的一种：反向无碱基残基；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-d-赤呋喃糖基)核苷酸；4′-硫代核苷酸；碳环核苷酸；1，5-脱水己糖醇核苷酸；l-核苷酸；α-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏-戊呋喃糖基核苷酸；无环3′，4′-断核苷酸；无环3，4-二羟丁基核苷酸；无环3，5-二羟基戊基核苷酸；3′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-反向无碱基部分；3′-2′-反向核苷酸部分；3′-2′-反向无碱基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3′-氨基磷酸酯；已基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3′-磷酸；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥接或非桥接的膦酸甲酯部分。
在另一个非限制性实例中，合适的3′-帽可选自4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-d-赤呋喃糖基)核苷酸；4′-硫代核苷酸；碳环核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1，5-脱水己糖醇核苷酸；l-核苷酸；α-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏-戊呋喃糖基核苷酸；无环3′，4′-断核苷酸；3，4-二羟丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸；5′-5′-反向核苷酸部分；5′-5′-反向无碱基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；桥接和/或非桥接的5′-氨基磷酸酯；硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯；桥接或非桥接的膦酸甲酯和5′-巯基部分。有关更多细节，参见beaucageandiyer，1993，tetrahedron49∶1925，其通过引用并入本文中。
第一核酸序列的“变体”是指相对于第一核酸序列具有一个或多个核苷酸置换的第二核酸序列。
“引物”是指单链寡核苷酸，其与由可变数目的核苷酸分开的模板核酸分子上的序列部分互补。与模板核酸退火的引物可以通过在热稳定聚合酶催化的核酸分子的扩增或聚合过程中核苷酸单体的共价键合来延伸。通常，引物长度为12至35个核苷酸，优选长度为15至20个核苷酸。引物由模板的已知部分设计，其与模板核酸分子的双链的每条链互补，位于待合成区域的相对的两侧。如本领域所熟知的，可以设计和合成制备引物。
本文使用的术语“正向引物”是指与以3′至5′方向排列的核酸序列的链互补的引物。“反向引物”具有与核酸序列的另一条链互补的序列。
如本文所用的“模板”是指双链或单链核酸分子，其用作核酸合成的底物。在双链dna分子的情况下，在这些分子可用作核酸合成的底物之前，进行其链的变性以形成第一和第二链。与作为镜腿(temple)模板的单链核酸分子的一部分互补的引物在适当条件下杂交，然后合适的聚合酶可合成与模板或其部分互补的分子。新合成的分子的长度可以等于或短于原始模板。
“靶”或“靶核酸”是指在包括聚合酶和寡核苷酸引物的反应中寻求复制或扩增的单链或双链多核苷酸序列。
如本文所用的术语“杂交”是指核酸分子优先与特定核苷酸序列的结合、双链体化或杂交。杂交通常涉及在多核苷酸的两条单链之间形成氢键。
如本文所用的术语“互补”是指两个核苷酸之间精确配对的能力；即，如果核酸的给定位置上的核苷酸能够与另一核酸的核苷酸氢键合(例如，通过标准watson-crick碱基配对和hoogsteen型氢键合)以形成规范碱基对，则两个核酸被认为在该位置上彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”。当两个单链核苷酸序列之间不存在错配时，互补性是“完全的”、“全部的”或“100％”。“沿着序列全长的100％互补性”表明在可以杂交并且长度相同的两条核酸链之间不存在错配。
如本文所用的术语“寡核苷酸”是指核苷酸单体的序列，每个核苷酸单体通过共价键与相邻的核苷酸单体结合。“寡核苷酸”还可以包括核苷酸单体序列内的非核苷酸亚基或核苷酸类似物，其中所述非核苷酸亚基或核苷酸类似物通过共价键与相邻的亚基、类似物或核苷酸结合。通过共价键结合。寡核苷酸中两个相邻核苷酸单体之间的共价键是磷酸二酯键。
本文的术语“干燥的”是指含水量小于约10％、8％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的组合物。
“聚合酶链式反应”(“pcr”)是这样的反应，即其中使用一种或多种引物和聚合的催化剂(例如dna聚合酶，特别是热稳定的聚合酶)，由靶多核苷酸制备复制拷贝。通常，pcr涉及重复执行三个步骤的“循环”：“熔解”，其中调节温度使得dna解离成单链；“退火”，其中调节温度使得寡核苷酸引物被允许使用碱基对识别来匹配它们的互补碱基序列，以在待扩增的多核苷酸跨度的一端形成双链体；和“延伸”或“合成”，其可以在与退火相同的温度下发生，或者其中将温度调节到稍高和更优的温度，使得将已形成双链体的寡核苷酸用dna聚合酶延长。然后重复该循环直至获得所需量的扩增多核苷酸。用于pcr扩增的方法教导于，例如，美国专利号4,683,195和4,683,202。
引物延伸或pcr扩增中的“特异性”是指产生单一“特异性”pcr产物，其具有由引物序列和核酸的基因组或转录区域(引物被设计成以碱基互补的方式退火到的区域)的序列预期的大小和序列。“非特异性”pcr产物具有与这种预期不同的大小或序列。
“靶核酸”是核酸的基因组或转录区域，其末端与包含在一整套pcr试剂中的引物碱基互补(具有适当的方向)。引物是指核酸序列，其与靶核酸序列的已知部分互补并且是通过dna聚合酶启动合成所必需的。“适当的方向”是为了两个引物与双链靶核酸的相反链退火，它们的3′末端指向彼此。将这些引物称为靶向与其碱基互补的基因组或转录序列的末端。如关于pcr扩增的权利要求中所提及的“适当温度”表示引物与靶核酸序列之间发生特异性退火的温度。
“寡核苷酸”是指包含共价连接的核苷酸序列的合成或天然分子，所述核苷酸通过一个核苷酸的戊糖的3′位置与相邻核苷酸的戊糖的5′位置之间的磷酸二酯键连接。
“引物延伸测定”是指体外方法，其中与单链核酸模板分子的互补序列部分杂交的引物通过核苷酸顺序共价键合至引物的3′末端而延伸，形成与dna模板分子互补的新的dna分子。引物延伸方法将单链核酸模板转化为部分或完全的双链核酸分子。如本文所用的引物延伸方法是单步核酸合成方法，不扩增模板核酸分子的拷贝数。
如本文所用，术语“调整(modulate)”或“调节(regulate)”是指丙酮酸脱氢酶激酶(pdk)活性的变化。例如，调整或调节可以引起pdk的蛋白质活性、结合特征或任何其他生物学、功能或免疫学性质的增加或减少。
本文公开的涉及核酸的分子操作的方法是本领域技术人员已知的。一般参见fredrickm.ausubel等人(1995)，“shortprotocolsinmolecularbiology，”johnwileyandsons，andjosephsambrook等人(1989)，“molecularcloning，alaboratorymanual，”seconded.，coldspringharborlaboratorypress，两者都通过引用并入。
ii.聚合酶活性的适体抑制剂
本公开内容提供了热稳定聚合酶的可逆抑制剂，其用于需要通过聚合酶延伸引物的反应。这些可逆抑制剂是适体——被设计为采用包含茎和环的二级结构的核酸。适体可用于反应和测定，其受益于掺入热启动并且可以改善核酸合成的灵敏度和特异性。
在一些实施方案中，适体具有“哑铃”结构(参见例如图1a和2a)。由于合成的寡核苷酸的5′和3′末端的连接，哑铃适体可以作为没有5′或3′末端的“封闭”结构存在(图1a中所示)。例如，通过合成具有本文提供的序列的线性寡核苷酸，允许退火以形成预期的哑铃结构，然后连接5′和3′，可以产生封闭的哑铃适体。在一些实施方案中，哑铃适体以产生5′和3′末端的方式合成，5′和3′末端在折叠的适体的茎内彼此相邻定位。
预期折叠成具有茎和两个环的适体的线性寡核苷酸的实例提供于图1b和2b中，其中线性寡核苷酸的5′和3′部分与同一寡核苷酸中的内部互补序列杂交以形成茎结构，其中线性寡核苷酸的5′和3′末端彼此相邻。图1a显示了由图1b中所示的寡核苷酸序列形成的适体结构，其中图1b的寡核苷酸的5′和3′末端连接在一起。图2a显示了由图2b中所示的序列形成的适体结构，其中寡核苷酸的5′和3′末端未连接在一起，留下具有5′末端和3′末端的适体，其中5′和3′末端在预期的茎结构内彼此相邻。
因此，参照图1a，提供了一种适体，其中线性寡核苷酸可以折叠并退火(杂交)以包含以下组分：第一多核苷酸序列，其包含茎的一条链(例如，图1a中的ttattttgcaattata(seqidno：2，在图中从右向左书写))；第二多核苷酸序列，其不与适体的部分(例如，ttcttagcgttt(seqidno：3))退火以形成环；第三多核苷酸序列，其与seqidno：1互补并在适当的条件和温度中与seqidno：1退火以形成茎(例如，tataattgcaaaataa(seqidno：1))；和第四多核苷酸序列，其也不与适体的部分(例如，ttcttagcgttt(seqidno：3))退火以形成环。
图2a和2b说明了“开放”适体，其中5′和3′末端未连接，即适体具有5′末端和3′末端。值得注意的是，5′和3′末端的核苷酸在预期的适体二级结构的茎内彼此相邻。如图2b所示，合成寡核苷酸并在其3′末端进行修饰。在该具体实施方案中，3′末端与丙二醇间隔基(c3)连接，防止5′和3′末端的连接以形成封闭的适体。在热变性和冷却时，寡核苷酸的5′和3′部分可以与寡核苷酸的内部互补序列杂交，如图2a所示。
哑铃适体的两个环(如上所述的第二和第四多核苷酸序列，并示于图1a和2a中)可彼此相同或可为彼此的微小变体，其中第一环与第二环有1或1个核苷酸不同。所述环包含多核苷酸序列ttcttagcgttt(seqidno：3)或其变体，其中所述变体在seqidno：3中含有1或2个核苷酸置换。seqidno：3中的可接受的置换是相对于其中环序列各自具有seqidno：3的适体，不影响适体的可逆抑制活性超过约5％或10％的那些置换。
位于适体的两个环之间的茎是双链结构(通过如上所述的第一和第三多核苷酸序列的杂交或退火形成，示于图1a中)，其长度为约12至18个碱基对，然而，茎的长度可以变化，了解到所述变化可以影响适体与聚合酶解离并且不再抑制聚合酶活性的温度。具有相对于它们与聚合酶解离的温度而变化的适体是有利的。因此，本公开内容的适体包括那些包含长度为12至16、14至18、14至17、14至16、15至16、15至17，或15至18个碱基对或者长度约为12、13、14、15、16、17或18个碱基对的茎的适体。茎由两个相等长度的单链寡核苷酸组成，使得目前描述的适体是包含两个单链寡核苷酸序列的多核苷酸，所述两个单链寡核苷酸序列的长度为12至16、14至18、14至17、14至16、15至16、15至17，或15至18个核苷酸或长度为约12、13、14、15、16、17或18个核苷酸，并且彼此互补。在一些实施方案中，两个寡核苷酸序列通过氢键杂交，并且在所得的适体的茎中不存在错配。为了形成包含2个环和茎的适体，一个单链茎寡核苷酸序列的3′末端共价键合到两个环之一的5′末端，而第二个单链茎寡核苷酸序列的3′末端共价键合到两个环中第二个环的5′末端。
包含如本文所述的两个环的适体可以是封闭的或开放的形式。换句话说，在封闭的形式中，适体多核苷酸没有游离末端。因此，尽管如本领域所熟知的，序列保持5′至3′方向，但适体不包含5′末端(例如5′磷酸)或3′末端(例如3′羟基)。相反，适体中的每个核苷酸通过共价键与相邻的核苷酸结合。在一些实施方案中，共价键是磷酸二酯键。在其他实施方案中，连接适体中核苷酸单体的每个共价键是磷酸二酯键。在一个替代实施方案中，适体茎的一条链包含非核苷酸连接部分，例如包含dmt-乙二醇亚磷酰胺(c-2间隔基)的接头。
在一些实施方案中，适体中的茎结构仅在茎的一条链中的两个核苷酸之间缺乏共价键。在这些实施方案中，适体具有5′末端和3′末端。由于茎中的所有核苷酸可以保持与相对的完全互补链杂交，当适体折叠成其预期的二级结构时，5′和3′末端保持彼此相邻(参见例如图1a)。在一些实施方案中，5′末端包含磷酸基团，而3′末端包含羟基。在替代实施方案中，5′末端、3′末端或两个末端与加帽部分连接。加帽部分可用于稳定适体和/或防止在适体的3′末端引发的聚合。缺少共价键和/或加帽部分的存在也可能破坏最靠近5′和/或3′末端的核苷酸之间的氢键，但这不一定会影响适体的抑制活性。
为了合成根据本公开内容的具有两个环和茎的适体，使用常规化学合成方法以3′至5′方向合成线性寡核苷酸。为了产生如上文所述的封闭适体(没有5′或3′游离末端)，首先合成所需的适体序列，然后通过加热变性并缓慢冷却至室温以使寡核苷酸退火以形成具有所需预期哑铃结构的适体。例如，合成的寡核苷酸可以在ph7.5的5mmhepes-koh缓冲液中用50ml盐(如kcl)在约95℃的温度下变性，然后缓慢冷却(约45分钟至1小时)至室温。
在如上所述的寡核苷酸的合成、变性和退火后，可以通过化学或酶促方法(参见例如实施例1)实现5′和3′末端的连接。通过使用t4连接酶可以实现酶促连接，其中合成的寡核苷酸的5′末端被磷酸化并在合适的条件下与t4连接酶一起孵育。化学连接可以使用例如溴化氰或本领域常规的其他方法进行。在一些实施方案中，随后合成的寡核苷酸首先被修饰以在寡核苷酸的5′末端放置氨基。然后将5′-修饰的寡核苷酸与咪唑-hcl(ph6.0)和16.7mgedc(1-乙基-e-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)一起孵育，将5′和3′末端连接在一起，形成具有茎和2个环的预期结构的适体，其中适体内的每个核苷酸与2个相邻的核苷酸共价键合。
为了产生具有游离5′和3′末端的适体，可以在上面化学合成所需的适体序列，其中合成寡核苷酸中的第一个和最后一个核苷酸是将在茎结构的单链内彼此相邻的核苷酸(如上所述并在图2a和2b中示出)，但在5′和3′末端之间缺乏共价键(例如磷酸二酯键)。在一些实施方案中，5′末端缺少磷酸基团。合成的寡核苷酸将在适当的条件下折叠以具有预期的二级结构，其具有被茎分开的两个环，其中在茎的一条链中存在与3′末端相邻的5′末端。5′-磷酸末端可以连接至加帽部分，例如本文所述的氨基或其他相关的加帽部分。寡核苷酸的3′-羟基可以连接至加帽部分，例如丙二醇间隔基c3或如本文所述的其他相关加帽部分(参见实施例3)。适体可包括5′帽、3′帽，或5′帽和3′帽。5′帽和/或3′帽的存在可以抑制寡核苷酸的两末端的连接，并且还可以抑制寡核苷酸的聚合。
如上所述，可以结合聚合酶并抑制聚合酶活性的适体被设计成具有2个环，其包含序列ttcttagcgttt(seqidno：3)，如由yakimovich等人(2003，biochem(moscow)，68∶228-235)所测定的，负责结合聚合酶并在结合时产生对聚合酶活性的抑制。在一些实施方案中，seqidno：3的环序列具有1或2个核苷酸置换。两个环由包含两个相等长度的互补序列的茎分开。因此，适体结构(其实例如图1中所示)具有两个由茎分开的环。虽然茎的示例性单链序列是tataattgcaaaataa(seqidno：1)并且其互补序列是ttattttgcaattata(seqidno：2)，但是预期在茎内可以存在1、2或3个碱基对置换。重要的是，一条链中的置换总是与茎的互补链中的互补置换偶联。
茎序列，例如由与seqidno：2配对的seqidno：1组成的茎序列，是富含at的。例如，茎序列的长度为12-18个碱基对，其中这些碱基对中的至少14、15或16个是a-t碱基对。在一些实施方案中，位于两个环之间的茎的长度为16个碱基对，并包含14个a-t碱基对和两个g-c碱基对。两个g-c碱基对可以彼此相邻。
如上所述，适体可以缺少茎部分内的一条链中存在的两个核苷酸之间的共价键。例如，包含seqidno：1和seqidno：2或其变体的茎链可以在seqidno：1或seqidno：2的核苷酸1和2、2和3、3和4、4和5、5和6、6和7、7和8、8和9、9和10、10和11、11和12、12和13、13和14、14和15，或15和16之间缺乏共价键。因此，在2个核苷酸之间缺乏共价键的适体包含单个5′末端和单个3′末端。如上所述，包含单个5′末端和单个3′末端的适体可以化学合成为包含适体的整个序列的单链寡核苷酸。换句话说，合成的单链寡核苷酸包含以下组分：包含seqidno：1的第一茎序列的5′部分或其变体；包含seqidno：3的第一环序列或其变体；包含seqidno：2的第二茎序列或其变体；第二环序列或其变体；和包含seqidno：1的第一茎序列的剩余3′部分或其变体。一旦合成为单链核苷酸，它可以在适当条件下折叠以具有由单个茎分开的两个环，其中所述茎的一条链在2个相邻核苷酸之间不具有共价键。不受理论束缚，预期的茎结构的一条链中的2个相邻核苷酸之间缺乏共价键可以允许灵活性，例如弯曲，从而促进两个预期的环结构中的每一个环与聚合酶的活性位点的相互作用。在预期的哑铃结构中通过茎连接的两个环的存在可以增加适体环的局部浓度，导致适体在较低温度(例如约25℃至30℃)下更有效地结合聚合酶。因此，在反应混合物中可能需要较少的适体以提供所需的热启动功能。
还确定通过设计包含游离5′和3′末端的哑铃适体(在茎的一条链的两个核苷酸之间缺乏共价键)，适体在约30℃或低于约30℃的温度下仍然能够抑制热稳定聚合酶的聚合酶活性。开放式哑铃适体序列中的变异可以影响这一温度，即低于该温度则聚合酶活性被抑制。在一些实施方案中，开放式哑铃适体在约32℃、35℃、38℃或40℃或低于约32℃、35℃、38℃或40℃下抑制聚合酶活性。特别有利的是在高于40℃、45℃、50℃或55℃的温度下这些开放适体组合物完全丧失聚合酶活性抑制作用。
下面的表1提供了如上所述的关于适体的示例性第一和第三序列，适体退火以形成预期的哑铃结构，其中适体的第一和第三多核苷酸序列彼此互补并且可以退火以形成预期的茎结构。应理解，下面的第一和第三序列的每个5′和3′末端连接到环结构的一个末端。还应理解，在一些实施方案中，第一和第三多核苷酸序列之一可缺少第一或第三序列内的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。另外，在预期的茎的链上预期形成的任何这些序列可以在序列中的1、2、3或4位具有核苷酸置换。因此，预期与该链退火的相反链具有完全互补的序列。
表1
哑铃适体茎序列
下表2提供了示例性寡核苷酸序列，其可以被合成并预期折叠成具有茎和两个环的适体。粗体的核苷酸代表茎序列的部分，当寡核苷酸如预期折叠时，其与由下划线部分指示的第二茎序列杂交。
表2
合成为线性寡核苷酸的哑铃适体
在本文所述的其他实施方案中，设计适体以形成发夹结构，其中预期适体包含具有互补的两条单链并终止于单环的单茎。如本文所述的预期的发夹结构中的单茎包含与第三多核苷酸序列退火的第一多核苷酸序列，其中第一和第三多核苷酸序列是互补的并且长度相等。第一多核苷酸序列的3′末端与第二多核苷酸序列的5′末端共价结合，预期其在预期的发夹适体中形成单链环，并且第二多核苷酸序列的3′末端与第三个多核苷酸序列的5′末端共价结合。下表3提供了发夹适体中第一和/或第三多核苷酸序列的一些示例性寡核苷酸序列。应理解，这些序列中的任何序列可在序列中的1、2、3或4位具有核苷酸置换。在优选的实施方案中，预期形成环的第二多核苷酸序列包含ttcttagcgttt(seqidno：3)。
表3
发夹适体茎序列
在一些实施方案中，发夹适体具有5′和/或3′突出端，其代表seqidno：3或其变体的完整或部分序列。根据本公开内容的发夹适体的实例提供于图3a和3b中。图3a的下划线部分表示seqidno：3的序列。因此，图3a的发夹适体具有包含seqidno：3的3′部分的突出端。具体而言，图3a说明了发夹适体，其中seqidno：3的3′部分(gttt)与包含序列ttattttaaaattata(seqidno：58)的茎链的5′核苷酸连接，并且seqidno：3的剩余5′部分与包含序列tataattttaaaataa(seqidno：59)的第二茎链的3′核苷酸连接。因为在seqidno：3的核苷酸4和5之间不存在共价(磷酸二酯)键，所以预期seqidno：90(图3b)的寡核苷酸折叠成如图3a所述的发夹结构。
为了合成发夹适体，基于下表4中所示的序列，可以化学合成寡核苷酸。加下划线的碱基表示seqidno：3的3′和5′部分(切割环)。粗体碱基表示茎序列，它们彼此完全互补，并且预期它们当适体折叠成发夹结构时进行杂交。seqidno：79说明了发夹结构，其中3′突出端代表seqidno：3的完整环序列，同时seqidno：80说明了发夹结构，其中5′突出端代表seqidno：3的完整环序列。seqidno：84是具有3′突出端的发夹适体的实例，其中由seqidno：3组成的序列的5′部分与一个茎序列的3′末端共价连接，由seqidno：3组成的序列的剩余3′部分与互补茎序列的5′末端共价连接，并且在由seqidno：3组成的序列的核苷酸7和8之间不存在共价(例如磷酸二酯)键。
表4
合成为线性寡核苷酸的发夹适体
适体抑制活性
还考虑了一种用于可逆地抑制聚合酶活性的方法，其包括将如本文所述的适体与热稳定聚合酶一起孵育。设计本公开内容的适体以结合热稳定聚合酶并在较低温度下抑制该聚合酶的聚合酶活性，然后随着反应温度升高而与聚合酶解离。在一些实施方案中，热稳定聚合酶选自但不限于来自嗜热真细菌或古细菌的dna聚合酶，包括但不限于栖热水生菌、嗜热栖热菌、布氏栖热菌、黄色栖热菌、红色栖热菌、thermococcuslitoralis、激烈热球菌、p.wosei、火球菌属物种kgd、海栖热袍菌、嗜酸热原体和硫化叶菌属。在一些实施方案中，聚合酶可以是在55-60℃之间起作用的逆转录酶，包括但不限于mmlv逆转录酶、amv逆转录酶、rsv逆转录酶、hiv-1逆转录酶和hiv-2逆转录酶。
适体结合并抑制聚合酶然后与聚合酶解离的能力部分地取决于其在反应混合物中的二级结构。本公开内容的适体具有范围为约45℃至70℃的熔解温度。在一些实施方案中，封闭的(连接的)哑铃适体具有更高的熔解温度，范围为约60℃至70℃、60℃至65℃，或65℃至70℃，而在茎的一条链中缺乏磷酸二酯键的开放式哑铃适体具有范围为约45℃至55℃、45℃至50℃、50℃至55℃，或48℃至53℃的熔解温度。在一些实施方案中，在ph为约8的缓冲溶液中，在约8μm的适体浓度下测定熔解温度。在一些实施方案中，缓冲溶液包含3mmmgcl2、15kcl、25mmhepes，ph8.0。每种适体的熔解温度可使用uv-vis-nir分光光度计测量(参见，例如，实施例2)。
尽管抑制性适体的二级结构的丧失可导致适体保持与聚合酶结合并抑制聚合酶的能力降低，但随着温度升高，与聚合酶的解离可取决于其他因素，例如适体的一级序列以及适体与聚合酶之间的界面。因此，预期和描述的是在低于约50℃、45℃、44℃、43℃、42℃、41℃、40℃、39℃或38℃的温度下抑制、降低或消除热稳定聚合酶活性的适体。在一些实施方案中，适体和聚合酶在ph为约6-8、6-9、7-8、7-9或8-9的溶液中。
适体抑制、降低或消除热稳定聚合酶的聚合酶活性的能力可以进行测量和定量，其使用在不同温度下在适体存在或不存在下测量聚合酶活性的测定来进行。应当理解，可以使用几种替代方法来测量适体以温度依赖性方式抑制聚合酶活性的能力，这里仅简要描述其中的一些。
用于测量适体对热稳定聚合酶活性的抑制作用的一种方法在下面的实施例3中举例说明，并在nikiforov等人，2011，analyticalbiochemistry，412∶229-236中进一步描述。具体地，提供了发夹模板，其中荧光标记(例如，荧光素(fam；5′-二甲氧基三苯甲氧基-5-[n-((3′，6′-二新戊酰基荧光素基)-氨基己基)-3-丙烯酰亚胺基]-2′-脱氧尿苷-3′-[(2-氰基乙基)-(n，n-二异丙基)]-亚磷酰胺)dt残基)在3′末端附近(例如，距离寡核苷酸底物的3′末端2、3、4或5个碱基)掺入。向pcr反应混合物(例如，50mmtris-hcl，ph8.3，50mmnacl，5mmmgcl2和2μl的2mmdatp)中加入聚合酶制剂，其中所述聚合酶存在或不存在抑制剂适体。在包含聚合酶和抑制剂适体的一些实施方案中，将约0.8μm聚合酶与8μm适体(1∶10比率)混合。在其他实施方案中，聚合酶/适体比率为约1∶5至1∶15或约1∶5或1∶15。在将聚合酶添加到含有标记的发夹底物的pcr反应混合物后，将反应从约25℃加热至75℃并使用标准解链曲线程序(例如，mx3005p，agilenttechnologies)测量fam信号以确定聚合酶具有活性的温度，以及低于该温度时聚合酶被适体抑制。
在存在和不存在适体的情况下测量热稳定聚合酶活性的另一种方法涉及使用聚合酶的寡核苷酸底物，所述聚合酶形成具有茎和环的发夹结构，其中茎具有终止于3′末端的长的单链部分。猝灭剂(例如，n，n′-四甲基罗丹明，tamra)附着于环的5′末端附近的茎上，并且荧光染料(例如，羧基荧光素，fam)附着于环的3′末端附近的茎上。当适体底物处于其预期的折叠结构中时，通过猝灭剂的共振能量转移淬灭染料的荧光，直到添加寡核苷酸引物并使其退火至茎单链部分的3′末端并延伸以通过聚合酶合成互补链，导致环的打开以及猝灭剂和染料的空间分离。将聚合酶和适体在合适的试剂溶液中混合，试剂至少包括三磷酸核苷酸、二价金属阳离子、合适的缓冲剂和引物，并且随时间测量荧光，荧光以与聚合酶活性成比率的速率增加。酶促dna合成的动力学表现出对底物浓度的michaelis-menten依赖性。因此，可以通过在增加量的适体存在下进行一系列聚合酶反应来产生各种适体的抑制谱。得到的数据可用于确定每个适体的ic50值(summererandmarx，angewchemint，2002，41：3620-3622)。此外，可以在一定温度范围内确定每种适体的ic50值。
用于测量如本文所述的适体以温度依赖性方式抑制热稳定聚合酶的能力的第三种替代方法是通过使用模板寡核苷酸dna分子，其在5′末端用32p-γ-atp标记并且其形成发夹，其中所述寡核苷酸的5′部分(例如，12-24个核苷酸)是单链的，接着是双链茎和小环。如上所述，将热稳定聚合酶与如本文所述的不同浓度的适体一起孵育，然后加入到底物和标准pcr反应混合物中，使pcr反应在不同温度(例如，25℃至75℃)下进行一段设定的时间(例如，45分钟至1小时)，通过加入edta终止，然后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。标准磷成像仪检测和定量方法可用于确定聚合酶活性水平，因为只有当聚合酶具有活性时(在给定温度下不被适体抑制)，发夹底物的3′末端才会延长以形成更长的产物，该产物被放射标记并检测。与上述测定一样，可以通过定量和分析确定给定温度下每种适体的ic50。
本文所述的适体用于可以减少非特异性产物生成的热启动聚合酶应用依赖于适体随温度与聚合酶解离的能力。因此，当含有适体和聚合酶的反应混合物升高至至少约45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃的温度时，根据本公开内容的适体与热稳定聚合酶解离。由于聚合酶的抑制作用丧失可能是适体与聚合酶解离的指示，在其他实施方案中，当含有适体和聚合酶的反应混合物升高至至少约45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃的温度时，根据本公开内容的可逆抑制性适体不抑制热稳定聚合酶活性。应理解，适体在高于此温度不再抑制聚合酶活性的温度取决于适体在具有聚合酶的溶液中的序列、组成和固有结构。因此，如本文所述的任何适体序列可以通过其在特定温度或高于特定温度下缺乏聚合酶活性抑制作用来进一步表征或定义。
此外，如本文所述的任何适体序列和预期结构可通过其在特定温度或低于特定温度下抑制聚合酶活性的能力来进一步表征或定义。在一些实施方案中，在约25℃、30℃或35℃的温度或低于约25℃、30℃或35℃的温度下，相对于不存在适体的情况下的聚合酶活性，适体抑制聚合酶95％至100％、98％至100％或者约100％的聚合酶活性。随着含有适体和聚合酶的混合物的温度升高，将会有相应的抑制作用丧失。实验研究表明，在约4℃至10℃，或5℃至7℃的温度范围内，可发生从约95％至100％的聚合酶活性到基本上所有抑制作用丧失的转变。如本文所述的适体对聚合酶活性的抑制也可受混合物中适体和聚合酶的浓度或适体：聚合酶的比率的影响。例如，当适体以约100nm至1000nm、100nm至500nm、25nm至750nm、500nm至1000nm的浓度存在于混合物中时，适体有效抑制聚合酶活性。所述的适体可用于可逆地抑制热稳定聚合酶，包括dna聚合酶、rna聚合酶和逆转录酶。
本文提供的适体在环境温度或低于聚合酶活性最佳的温度的温度下抑制聚合酶活性的能力对于至少基于在这些更低的温度下产生的非特异性产物的减少或消除的原因是有利的。如至少在实施例4和5以及图4-5中所示，使用适体可以减少非特异性产物的产生并增加靶扩增子的产生。
应用
如上所述，本公开内容的适体具有在环境温度或低于各种热稳定聚合酶的最佳温度的温度下可逆地抑制热稳定聚合酶的能力。因此，这些适体可以容易地应用于其中使用热稳定核苷酸聚合酶，并且其中希望在较低温度下停止聚合酶活性但是随后能够在较高温度下恢复其活性(热启动)的任何应用。此类应用包括但不限于标准pcr、逆转录酶pcr、原位pcr、定量pcr和微测序，或其中存在热稳定聚合酶并且热启动方法是有利的涉及引物延伸的其他反应。这些方法在本领域中是公知的。在一些实施方案中，由所公开的组合物提供的增加的灵敏度和特异性在医学遗传学研究和诊断、病原体检测、法医分析和动物和植物遗传学应用中的dna和rna的扩增和分析期间是有用的。本公开内容的方法和组合物可用于需要热稳定聚合酶在40℃至80℃之间的任何温度循环的任何多核苷酸合成反应。
以下实施例4和5描述了在存在或不存在根据本公开内容的适体情况下使用taq聚合酶进行的pcr实验。这些研究证明了本文所述的适体既能减少非特异性扩增产物的产生又能增加反应混合物中靶扩增子的量的能力。实施例4描述了含有基因组dna和2对引物的双重pcr反应，用于扩增两个靶序列。在通过加入热稳定聚合酶开始pcr反应之前，将4单位taq聚合酶与200nm一起孵育，然后将taq加入到pcr主混合物(mastermix)中。在该特定实验中，使用未连接的(开放式)哑铃适体，其显示(实施例2)具有约42℃的熔解温度。荧光信号的检测和分析以及pcr产物的凝胶分析显示对非特异性产物产生和靶扩增子产生量的影响。预期本文所述的具有低于反应混合物中热稳定聚合酶的最佳温度的熔解温度的任何适体可增强靶扩增子的产生和检测。
实施例5探索了适体：热稳定聚合酶对非特异性产物和靶扩增子产生的不同比率。测试了约2.5∶1至15∶1的比率。虽然所有比率均导致产生所需产物，但15∶1比率在减少非特异性产物产生同时保持靶扩增子产生水平方面最有效。
因此，本文考虑的方法涉及使用热稳定聚合酶来延伸引物，所述引物退火至核苷酸模板或底物分子。如本领域所熟知的，其中引物在核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸、datp、dgtp、dctp、dttp)、二价金属阳离子(例如mg2+或mn2+)、缓冲剂和至少一种底物的存在下通过聚合酶延伸。
在一些实施方案中，本文所述的抑制剂可以与其他热启动技术(例如基于抗体的热启动)组合使用。在其他实施方案中，例如，在不同温度下与聚合酶解离的两种或更多种适体可以在单一反应中组合。
示例性自动化和系统
在一些实施方案中，复制或扩增靶核酸序列，然后使用自动化样品处理和/或分析平台检测。在一些实施方案中，使用市售的自动化分析平台。例如，在一些实施方案中，使用
使用genexpert系统来说明本公开内容。以下描述示例性样品制备和分析方法。然而，本公开内容不限于特定的检测方法或分析平台。本领域技术人员认识到可以使用任何数量的平台和方法。
盒的组件包括但不限于含有可用于提取、纯化和扩增靶核酸的试剂、过滤器和捕获技术的加工腔室。阀门使得流体能够从腔室转移到腔室，并且包含核酸裂解和过滤组分。光学窗口可实现实时光学检测。反应管能够实现非常快速的热循环。
在一些实施方案中，
在将样品加入到盒中后，使样品与裂解缓冲液接触，并将释放的dna与dna结合底物如二氧化硅或玻璃底物结合。然后除去样品上清液，并在洗脱缓冲液如tris/edta缓冲液中洗脱dna。然后可以在盒中处理洗脱液以检测如本文所述的靶基因。在一些实施方案中，洗脱液用于复原至少一些pcr试剂，其作为冻干颗粒存在于盒中。
在一些实施方案中，pcr用于扩增和检测靶核酸序列和/或指示基因组拷贝数的核酸序列的存在。在一些实施方案中，pcr使用taq聚合酶，其具有通过使用本文提供的适体赋予的热启动功能。
试剂盒
还提供了用于检测固体、半固体或液体生物样品中存在的核酸靶序列的试剂盒。所述试剂盒包括试剂混合物，其包含热稳定聚合酶和如本文所述的可以可逆地抑制聚合酶活性的适体。在一些实施方案中，试剂盒可用于检测、定量或测序任何靶核酸。或者，试剂盒包括一种或多种与特定的靶核酸特异性杂交的寡核苷酸引物(例如正向和/或反向引物)，并且还可以包括本领域常规的标记引物和/或探针。
试剂盒可以包括用于以下的说明书：用于获得生物样品并使它们与样品缓冲液接触，用于将样品与样品缓冲液混合，将标记放置在设备上并记录相关测试数据；用于运输设备等。试剂盒可包括用于读取和解释测定结果的说明书。试剂盒可以进一步包括参考样品，其可以用于将测试结果与样本样品进行比较。
实施例
实施例1
寡核苷酸合成和连接
使用标准寡核苷酸合成方法合成如本文所述的适体。在mermade12dna合成仪(bioautomation)上进行寡核苷酸合成。使用标准亚磷酰胺合成循环，并且对于修饰的亚磷酰胺，偶联时间增加至360秒。从固体支持物切割并脱保护在浓氨水中在室温下进行24小时。hplc分析在配备有四元泵、自动进样器和二极管阵列检测器的agilent1100仪器上进行。使用反相hplc(rphplc)在c18gemini柱(4.6mmx250mm，5μm，phenomenex)上分析寡核苷酸，用乙腈/0.1m三乙基碳酸氢铵，ph7的线性梯度洗脱：对于dmt保护的(dmt-on)寡核苷酸为16-23％乙腈持续20min，对于去除了dmt基团的(dmt-off)寡核苷酸为7-14％乙腈。使用反相hplc纯化dmt保护的寡核苷酸，切割dmt基团，并且通过乙醇沉淀分离最终的寡核苷酸产物并通过uv定量。
在指出的情况下，一些适体在合成后在5′和/或3′末端被修饰。使用(3-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)-2，2-(二羧基甲基氨基)丙基-1-o-琥珀酰基-长链烷基氨基-cpg)(glenresearch目录号10-1901；美国专利号5,959,090和ep专利号ep0816368)和(3-(4，4′-二甲氧基三苯甲氧基)-2，2-二羧基乙基]丙基-(2-氰基乙基)-(n，n-二异丙基)-亚磷酰胺)(glenresearch目录号20-2903；美国专利号5,959,090)实现5′和3′磷酸化。使用5′-氨基-dt-ce亚磷酰胺(glenresearch目录号10-1932)、(5′-单甲氧基三苯甲基氨基-2′-脱氧胸苷，3′-[(2-氰乙基)-(n，n-二异丙基)]-亚磷酰胺)实现用氨基对5′末端进行修饰。使用((1-二甲氧基三苯甲氧基-丙二醇-3-琥珀酰基)-长链烷基氨基-cpg)(目录号20-2913)实现用丙二醇间隔基cpg(-c3)对3′末端进行修饰。
为了产生连接的哑铃适体，将如上合成的寡核苷酸酶促或化学连接。对于酶促连接，将1ml在50mmkcl溶液中的16μm5′-磷酸修饰的寡核苷酸在加热模块中加热至95℃并持续5min，并通过关闭电源在相同的加热模块中缓慢冷却至室温以使寡核苷酸退火(分子内杂交)。将900μl退火的寡核苷酸与100μlt4连接缓冲液混合，然后与10μlt4连接酶(newenglandbiolabs)混合，并在16℃下放置过夜。通过rp-hplc方法纯化连接的适体。
为了产生化学连接的适体，将在5mmhepes-koh缓冲液ph7.5和50mmkcl中的5’((氨基-t))修饰的寡核苷酸(220μm)在95℃变性5min。然后缓慢(约1小时)冷却-退火至室温。然后将100μl退火的寡核苷酸与66.7μl0.1m咪唑-hcl(ph6.0)和16.7mgedc(1-乙基-e-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)混合。在短暂涡旋和离心后，将另外266μl的0.1m咪唑-hcl(ph6.0)供应至反应，并将混合物在室温下放置过夜。通过rp-hplc纯化连接的寡核苷酸。
实施例2
熔化温度(tm)测定
对根据以上实施例1产生的各种适体进行uv-熔解曲线分析。在缓冲液(3mmmgcl2、15kcl，25mmhepes，ph8.0)中制备浓度为1μm的寡核苷酸，并使用agilenttechnologiescary4000系列uv-vis-nir分光光度计和相关软件，根据制造商的说明进行分析。结果如下表5所示。如所预期的，未连接的哑铃适体的tm低于连接的哑铃适体的tm。
表5
实施例3
聚合酶抑制
进行研究以测量本文所述的适体随温度变化的抑制活性。在适体的存在下，taq聚合酶的聚合酶活性通过本领域描述的方法测定(nikiforovt.，analyticalbiochemistry，412：229-236(2011)，具有以下修饰。因为本发明的适体在环境温度以上抑制taq聚合酶活性，修饰发夹底物的结构以提高其tm。将以下发夹底物用于测定：
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(seqidno：6)，其中x表示荧光素dt残基。向150nm发夹底物在50mmtris-hcl、50mmnacl、5mmmgcl2和taq聚合酶中的溶液中加入2μl2mmdatp，并监测fam信号，同时使用标准解离曲线程序(mx3005p，agilent)将反应混合物从25℃加热到74℃。该测定法测量适体的可逆抑制活性，由此在加热反应混合物时重新获得聚合酶活性。失去抑制作用的温度取决于适体的序列和结构。
实施例4
热启动活性
为了测试如本文所述设计的适体减少pcr反应中非特异性产物产生的能力，进行人基因组双重pcr扩增测定，其中检测到β-珠蛋白基因的两个区域，随后使用eva-green进行pcr后的熔解曲线分析。两对引物具有以下序列：
aaaaggcattcctgaagctgacagcattc(seqidno：7，正向引物1)和gagagagtagcgcgagcacagcta(seqidno：8，反向引物1)；和aaaacctgccttctgcgtgagattct(seqidno：9，正向引物2)和ctgtacgaaaagaccacagggcccat(seqidno：10，反向引物2)。在室温下制备的pcr主混合物含有100μmdntp、5mmmgcl2、25mmhepes，ph8.5，x1
通过相对于循环数的荧光增加而测量的产物产生的结果(图4a和4b)显示，与不存在适体(图4a)相比，存在适体(图4b)导致更高的产物产生。熔解曲线分析(图5a和5b)显示，在具有和不具有适体的反应中检测到对应于β-珠蛋白扩增子的两个特异性条带，但在缺乏taq聚合酶的反应中未检测到。而且，图5a和5b证明与在不存在适体的情况下进行的反应相比，在含有taq聚合酶和适体的反应中非特异性产物的产生显著减少。数据显示，在含有taq和适体的反应中，特定β-球蛋白扩增子的数量更高。(泳道1：分子量标记物；相应的bp值在凝胶图像的左侧和右侧；泳道2、3、6、7、8、9：仅有taq和适体，无pcr主混合物；泳道4、10、11：具有taq但不具有适体的pcr主混合物；泳道5、12、13：具有taq和适体的pcr主混合物)
实施例5
热启动pcr
如本文所述，适体可在低于聚合酶的最佳反应温度的温度下可逆地抑制聚合酶活性。使用
(caaaataattcttagcgtttttattttgcaattatattcttagcgttttataattg-c3)的适体，如实施例1中所述用丙二醇间隔基cpg修饰其3′末端。
将在人粪便背景基质中3种浓度(275、92或23cfu/测试)的活的艰难梭菌细胞用于测定。该实验用在实验当天制备的所有湿的主混合物在
目的靶标的扩增子长度如下：毒素b(tcdb)为81bp，tcdc缺失nt117为91bp，spc(样品处理对照)为133bp，二元毒素(cdt)为143bp。在所有测试的反应混合物中均观察到210bp处的非特异性条带，但对于15∶1适体∶taq比率，该条带是最微弱的。对于2.5∶1适体∶taq比率，210bp和400bp处的非特异性条带是最突出的(数据未显示)。
此外，二元毒素终点随着非特异性结合的量减少而增加(数据未显示)。用2.5∶1适体∶taq比率观察到最低的二元毒素终点。用15∶1适体∶taq比率观察到最高的二元毒素终点。这表明当非特异性扩增受限时，产生更多的目标二元毒素产物。该研究的结果表明，对于包含seqidno：106的适体，适体∶taq比率为15∶1对于使用栖热水生菌dna聚合酶的热启动pcr方法是最佳的。
序列表
<110>s·g·洛霍夫
a·a·高尔
v·巴拉兹奈诺克
e·v·维亚佐夫基那
i·希什金娜
d·h·佩尔森
<120>热稳定聚合酶抑制剂组合物和方法
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<151>2016-06-07
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