基因沉默的改善或与基因沉默有关的改善的制作方法

潜在沉默基因表达的rna干扰现象是熟知的。rna相对不稳定并且可以通过例如普遍存在于甚至细胞外的核糖核酸酶迅速降解。将dsrna直接应用于靶生物体，抑或经由外源性施用至靶生物体存在的场所的问题在于rna的稳定性差。外源性应用意指以生物体可将其并入其中的方式施用于靶生物体，或者dsrna在与靶生物体不同的第一生物体中产生并且靶生物体并入第一生物体或其包含dsrna的部分，使得-无论哪种方式-所述dsrna能够实现包含对应于由dsrna包含的核苷酸序列的核苷酸序列的基因的转录后沉默。外源性应用与内源性产生(所述内源性产生是指能够在转录后沉默靶向基因的双链rna的靶生物体的细胞中产生(通常经由从适当的异源序列表达))不同。尽管外源施用的dsrna通常能够在短期内、可能甚至在施用后多至几天内施加相关的生物效应，但所述效应通常迅速下降，因为dsrna在例如土壤中典型地具有小于约12小时至24小时的半衰期，并且还要进一步取决于其施用的精确环境条件。已经提出了对这个问题的不同解决方案，包括通过封装或以其他的方式将其结合到增强其稳定性的聚合物上来稳定dsrna，从而提供增加的作用持续时间。然而，这种稳定的dsrna并非没有其自身的问题，因为它与阳离子聚合物形成的络合物可以通过存在于或处于如下场所的带电荷的粒子结合或以其他方式与所述带电荷的粒子结合，所述场所降低其可用性或阻碍络合物穿过所述场所的运动，并且典型地阻碍朝向靶生物体所在位点的运动。靶生物体远离最初施用dsrna的位点的运动加剧了这个问题。因此，本发明涉及以下问题的解决方案：一方面稳定dsrna以使其足以能够发挥所希望的生物效应，以及另一方面使得由此稳定的dsrna保持可用或在靶生物体所在的场所处或场所内移动或被移动。根据本发明，提供了抑制或基本上降低组合物(所述组合物包含阳离子聚合物和多核苷酸形成的络合物)与存在于土壤中的带负电荷分子结合的方法，所述方法包括将能够基本上中和络合物上的正电荷的猝灭剂包含于所述组合物中。在本发明的组合物的特别优选的实施例中，多核苷酸是dsrna，聚合物是多胺，并且猝灭剂是单醛或单环氧化物。在本发明的特别优选的实施例中，聚合物是直链或支链的聚乙烯亚胺、多肽或阳离子多糖。在本发明的特别优选的实施例中，聚合物是直链或支链的聚乙烯亚胺。在本发明的特别优选的实施例中，带负电荷的粒子包含腐殖酸。本发明还提供了控制地下植物有害生物侵袭的方法，所述方法包括提供：a)包含阳离子聚合物和dsrna形成的络合物的组合物，b)用猝灭剂基本上中和a)的络合物的表面暴露的正电荷，以及c)将b)的组合物施用于土壤，其中dsrna在所述地下植物有害生物中实现靶基因的转录后沉默。地下植物有害生物包括在其生命周期的至少一部分(例如幼虫阶段)中驻留于土壤的那些有害生物。地下有害生物包括来自由以下组成的组中的那些：西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、南美叶甲(葫芦甲虫(cucurbitbeetle))、线虫、金针虫和蛴螬、以及适当的土壤病原体，如细菌和真菌。优选地，地下有害生物是根萤叶甲属物种。本发明还提供了猝灭剂用于基本上中和络合物中残留的带正电荷的基团的用途，所述络合物包含多核苷酸和阳离子聚合物。本发明还提供了组合物，所述组合物包含阳离子聚合物和多核苷酸形成的络合物、以及能够基本上中和所述络合物上残留的表面暴露的带正电荷的基团的猝灭剂，其中所述聚合物选自由以下组成的组：支链或直链的聚乙烯亚胺，含咪唑的聚合物，壳聚糖，阳离子多糖，聚酰胺基胺，包含胺基团的氨基酸(如赖氨酸、组氨酸和精氨酸)的聚合物和共聚物，以及多胺。在本发明的特别优选的实施例中，存在于组合物中的阳离子聚合物是支链或直链的聚乙烯亚胺。络合物意指通过涉及两个或更多个组分分子实体(离子的或不带电荷的)的松散缔合而形成的分子实体。当阳离子聚合物和多核苷酸形成络合物时，多核苷酸上的净负电荷可能不足以抵消或“中和”阳离子聚合物上所有表面暴露的带正电荷的基团，结果是所述络合物包含残留的表面暴露的带正电荷的基团。本发明的多核苷酸可以是rna。rna可以是dsrna，但它也可以是sirna、mirna或能够进行rnai基因沉默的任何其他rna分子。优选地，多核苷酸是dsrna。优选地，dsrna包含至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个与靶生物体中靶基因一致或互补的核苷酸。适合的靶基因是其中转录后沉默对靶生物体具有不利影响的那些。例如，改变生长、发育迟缓、死亡率增加、生殖能力下降或繁殖力下降、摄食行为或运动减少或停止、或变态阶段发展减少或停止。阳离子聚合物可以选自由以下组成的组：支链或直链的聚乙烯亚胺、含咪唑的聚合物、壳聚糖、阳离子多糖、聚酰胺基胺、和包含叔胺基团的氨基酸(如赖氨酸和精氨酸)的聚合物。可替代地，阳离子聚合物可以是多胺、或包含至少5个胺基团的支链多胺。在多核苷酸是dsrna的情况下，简单的多胺(如精胺、亚精胺、腐胺和尸胺)不是特别优选的，因为使用猝灭剂来中和这种简单的多胺和dsrna形成的络合物上的任何残留电荷可以使所述络合物解离。在组合物的优选的实施例中，络合物包含于细胞裂解物中或在完整细胞内形成，并将所述猝灭剂添加至所述络合物中。就猝灭剂而言-含有能够与胺反应以猝灭其上正电荷的单个基团的任何物质都是能胜任的，尽管一些试剂是优选的，包括异氰酸酯、单环氧化物、单酯、单羧酸、单酸酐、单醛和焦碳酸酯。但是，特别优选的猝灭剂是单醛或单环氧化物。单醛可以是水溶性的或水不溶性的。存在于本发明的组合物中的水溶性单醛包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、戊醛和己醛。优选的水不溶性单醛包括庚醛、辛醛和癸醛。优选的单环氧化物包括聚合度在从1至约10范围内的聚乙二醇缩水甘油醚。猝灭剂应以如下量存在于组合物中，所述量应足以基本上猝灭络合物中任何残留的表面暴露的带正电荷的基团，使得所述络合物基本上不与带负电荷的粒子(如存在于土壤中的带负电荷的粒子)结合，其中腐殖酸就是一个实例。熟练的配方化学师有能力容易地确定这些量是多少，但典型地它们在组合物中以如下量存在，所述量使得单价猝灭剂的摩尔数等于络合物中存在的胺摩尔数的从约10％至约190％(认识到对于猝灭反应，伯胺是二价的，而仲胺是单价的)。在多核苷酸是dsrna的情况下，所述dsrna包含与真核细胞中基因的mrna的序列基本上一致的序列。具体而言，真核生物可以是选自由以下组成的组中的昆虫：西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、南美叶甲(葫芦甲虫(cucurbitbeetle))、线虫、金针虫和蛴螬、以及适当的土壤病原体，如细菌和真菌。包含多核苷酸和阳离子聚合物的络合物中残留的正电荷的中和使得所述络合物能够在含有负电荷的底物上更自由地移动或在所述底物中更自由地移动-其中将所述络合物施用于所述底物。熟知的是，如果将包含杀昆虫剂的组合物施用于包含根虫幼虫的场所来作为土壤浇灌的一部分，则对玉米根虫的控制不一定是完全有效的。一个可能的原因是杀昆虫组合物的可用性或穿过土壤的移动可能受到活性成分和/或杀昆虫配制品(作为一个整体)以及被施用的土壤的带电荷组分之间的静电和/或其他结合相互作用的阻碍。可用性意指活性成分保留在土壤的水相中，而不是吸附到固体组分上。从以下一个或多个非限制性实例中，本发明将进一步明显。使用了以下缩写：-％w/w＝作为总重量的函数的百分比odu＝光密度单位(在600nm处的吸光度)pbs缓冲液＝磷酸盐缓冲盐水缓冲液bpei25kd＝分子量为25kd(25000g/mol)的支链的聚乙烯亚胺实例1.对照样品a.将标称1mg/ml的10μl的ivtdsrna与13μl的bpei(支链的聚乙烯亚胺)60kda在pbs缓冲液中的10％溶液进行合并。将其在pbs中稀释至500μl总体积，然后与10mg胶体二氧化硅[aerosil200，赢创公司(evonik)]进行合并。将样品在离心机中以2000rpm短暂旋转并收集上清液。添加1μl的1％肝素na盐以去络合任何bpei-dsrna。当在电泳凝胶上运行时，没有看到对应于dsrna的条带，这指示所有络合物都已经与胶体二氧化硅结合。测试样品b.以与对照样品a相同的方式制备这个样品，不同之处在于在与胶体二氧化硅合并之前，添加在pbs缓冲液中的25μl的猝灭戊醛10％溶液，并允许其在环境条件下反应1小时。在这种情况下，可看到对应于游离dsrna的条带，并且条带强度指示总dsrna的约25％未以bpei-dsrna络合物的形式与胶体二氧化硅结合。实例2.pei(＝聚乙烯亚胺)涂层的细胞可以改善dsrna在土壤中的稳定性。然而，由于土壤中胺基团与酸基团的相互作用，细胞的pei涂层可能导致细胞强力吸附到土壤中。这可能损害土壤迁移率和dsrna向crw的递送。通过使pei涂层与戊二醛或单醛(戊醛)反应，可以使pei上的游离胺基团猝灭，从而降低它们与土壤的相互作用。然而，用戊二醛猝灭导致一定程度的絮凝，这可能损害土壤迁移率。如下所示，单醛处理不会导致絮凝，并且因此可能是猝灭游离胺的优选方式。1.将完整细胞(先前用0.002％w/w/odu戊二醛处理，并且然后洗涤)以12odu/ml再悬浮于pbs缓冲液中并分成1ml等分试样。2.将bpei25kd溶液以2％w/wbpei(ph约11)和1.25％w/wbpei(ph约7)制备。3.用bpei溶液如下处理每个完整细胞等分试样，并记录观察结果：等分试样1：添加bpei(ph11)至0.1％w/w最终bpei浓度，然后用0.2％戊二醛进行处理。观察到立即出现严重絮凝。等分试样2：添加bpei(ph11)至0.1％w/w最终bpei浓度，然后用0.2％戊醛进行处理。没有观察到絮凝。等分试样3：添加bpei(ph7)至0.1％w/w最终bpei浓度，然后用0.2％戊二醛进行处理。观察到立即出现絮凝，不像等分试样1那样严重，目测评估的絮凝物的粒度较小。等分试样4：添加bpei(ph7)至0.1％w/w最终bpei浓度，然后用0.2％戊醛进行处理。没有观察到絮凝。实例3.聚乙烯亚胺(pei)的修饰通过环氧官能化的peg进行pei的聚乙二醇化首先用tris-hcl(ph7)猝灭peg-二缩水甘油醚(500d)，目标为猝灭双官能化的peg中的一半环氧基团，以产生单官能化的peg。这通过将20％tris-hcl溶液(ph7)的peg-二缩水甘油醚以目标为与peg上的一半环氧基团反应的比率进行混合，然后在升高的温度下孵育过夜来完成。将由此获得的单官能化的peg与支链pei溶液(调节至ph7)以目标为pei上伯胺的各种聚乙二醇化水平(标称目标为伯胺的30％、60％和90％猝灭)的比率混合。通过进行比色tnbsa(2,4,6-三硝基苯磺酸)测定来确定pei上伯胺的实际猝灭程度。获得的实际聚乙二醇化水平如下(表1)，并且如预期的那样与标称目标略有不同，这是由于若干个可能的原因，包括双官能的peg向单官能的转化不是特定反应，并且由于位阻阻碍了伯胺的可用性。标称和实际猝灭程度之间的差异不会影响实验的结果，因为它被设计成跨越实际猝灭程度的范围。pei伯胺的目标猝灭pei伯胺的测量猝灭30％11％60％28％90％22％表1通过二乙基焦碳酸酯对pei进行修饰pei上的伯胺通过与二乙基焦碳酸酯(depc)反应(通过将depc直接添加至调节到ph7的pei溶液中进行)来猝灭，目标为depc对伯胺的不同猝灭水平(标称目标为25％、50％和75％猝灭)。通过进行比色tnbsa(2,4,6-三硝基苯磺酸)测定来确定pei上伯胺的实际猝灭程度。测量的depc修饰的实际水平如下(表2)，并且如上讨论的，目标猝灭程度和实际猝灭程度之间的差异不会影响实验的结果。pei伯胺的目标猝灭pei伯胺的测量猝灭25％30％50％40％75％50％表2实例4.评估修饰的和未修饰的pei与土壤的结合亲和力将未修饰的pei溶液和通过聚乙二醇化或depc修饰的pei溶液与土壤以2:1(溶液:土壤)wt/wt的比率孵育1小时。测试溶液的浓度在pei的0-0.08％之间变化。在土壤孵育后，通过离心将土壤从pei溶液中分离。通过tnbsa测定来评估溶液中剩余的未结合的pei。pei与土壤的结合分布由结合等温线表示(图1)。pei上的伯胺猝灭水平用图例括号中的数字来指示。实例5.dsrna-pei络合物的结合亲和力将表达dsrna的大肠杆菌细胞裂解物与pei溶液混合如下：将裂解物稀释至25od/ml，并向所述裂解物中添加pei溶液至0.75％的终浓度。将裂解物dsrna-pei络合物溶液进一步稀释2.5倍并与土壤以2:1(溶液:土壤)wt/wt的比率孵育1小时。将未配制的裂解物溶液用作对照。随后通过离心沉淀土壤，并通过添加聚阴离子从络合物中提取上清液中未结合的总rna，以从pei中使dsrna去络合，然后进行rnazolrt提取。通过uv-vis光谱定量样品上清液中存在的总rna浓度(图2)。实例6评估用修饰的pei制备的络合物中裂解物-dsrna的稳定性将表达dsrna的大肠杆菌细胞裂解物与pei溶液混合如下：将裂解物稀释至50od/ml，并向裂解物中添加pei溶液至0.5％(1xpei)或1.5％(3xpei)的终浓度。将裂解物dsrna-pei络合物溶液与核糖核酸酶iii在37℃孵育过夜。通过添加聚阴离子从络合物中提取总rna，以从pei使dsrna去络合，然后进行rnazolrt提取。使用琼脂糖凝胶电泳评估dsrna的完整性(图3和4)。实例7评估用修饰的pei制备的络合物中dsrna的生物利用度对用修饰的pei和表达dsrna的大肠杆菌裂解物制备的络合物进行人工西方玉米根虫饲料掺入生物测定。将裂解物配制品使用不含核糖核酸酶的水稀释，并通过涡旋混合与等量的饲料(0.5ml饲料和0.5ml稀释的配制品溶液)充分混合直至均匀。对每种配制品类型进行三次重复，并且对于每个重复板，添加大约12只新生幼虫。将板在室温下孵育。在测定期间每隔一天记录死亡率。最终死亡率在图5和6中表示，并显示猝灭的络合物的活性改善。土壤中的生物测定也证实了这一发现。附图说明图1.与未修饰的pei相比，聚乙二醇化的和depc处理的pei均具有降低的结合亲和力。图2.用聚乙二醇化的pei制备的络合物与土壤结合较弱，因此在土壤孵育后保留在上清液中。聚乙二醇化程度越高，络合物与土壤的结合亲和力越低。图3.裂解物dsrna在用修饰的pei(聚乙二醇化的pei)制备的络合物中的稳定性。dsrna在用聚乙二醇化pei制备的络合物中是稳定的。图4.裂解物dsrna在用修饰的pei(depc处理的pei)制备的络合物中的稳定性。dsrna在用depc处理的pei制备的络合物中是稳定的。图5.与用未修饰的pei制备的络合物相比，当dsrna与聚乙二醇化的pei络合时，crw的死亡率得到改善，这显示修饰的络合物中dsrna的生物利用度得到改善。图6.与用未修饰的pei制备的络合物相比，当dsrna与depc-pei络合时，crw的死亡率得到改善，这表明修饰的络合物中dsrna的生物利用度得到改善。pei上的较高修饰水平导致改善的生物利用度。当前第1页12