从人多能干细胞生成心房心肌细胞和心室心肌细胞谱系的制作方法

文档序号:18743559发布日期:2019-09-21 02:04阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种富含心室心肌细胞的心肌细胞群体,其中所述群体基本上不含起搏细胞。

2.根据权利要求1所述的群体,其中所述群体缺乏起搏细胞。

3.一种用于治疗患者中的心力衰竭或心肌梗塞的药物组合物,所述药物组合物包含根据权利要求1或2所述的心肌细胞群体和药学可接受的载体。

4.一种产生富含心室心肌细胞的心肌细胞群体的方法,所述方法包括:

在中胚层诱导培养基中温育多能干细胞,所述中胚层诱导培养基包含BMP组分和足以生成心室中胚层的有效量的激活素组分;并且其后

在合适的培养基中培养所述温育的细胞,以生成富含心室心肌细胞的心肌细胞群体。

5.根据权利要求4所述的方法,其中所述激活素组分的浓度大于所述BMP组分的浓度。

6.根据权利要求4或5所述的方法,其中所述BMP组分与所述激活素组分的比率为约0.3-1:1、约0.5:1、或约0.8:1。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法,其中通过测量表达CD235a的中胚层细胞的水平,并且将其与表达RALDH2的中胚层细胞的水平进行比较,来确定所述激活素组分的浓度。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法,其中通过测定与表达RALDH2的中胚层细胞相比,优先导致更多的表达CD235a的中胚层细胞的浓度,来选择所述激活素组分的浓度。

9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法,其中所述激活素组分以约4ng/ml至约20ng/ml的量加入。

10.根据权利要求4至9中任一项所述的方法,其中所述激活素组分的浓度为6-20ng/ml。

11.根据权利要求4至10中任一项所述的方法,其中所述BMP组分的浓度为约3ng/ml至约20ng/ml。

12.根据权利要求4至11中任一项所述的方法,其中所述BMP组分的浓度为5ng/ml或10ng/ml。

13.根据权利要求4至12中任一项所述的方法,其中所述激活素组分的浓度为12ng/ml。

14.根据权利要求4至13中任一项所述的方法,其中所述BMP组分是BMP4。

15.根据权利要求4至14中任一项所述的方法,其中所述激活素组分是激活素A。

16.根据权利要求4至15中任一项所述的方法,其中所生成的所述心肌细胞群体的至少一部分用于治疗需要心脏修复的受试者。

17.根据权利要求16所述的方法,其中所述需要心脏修复的受试者处于心力衰竭的风险中、患有心力衰竭和/或患有心肌梗塞事件。

18.根据权利要求17所述的方法,其中所述治疗是在心肌梗塞事件之前、心肌梗塞事件期间或心肌梗塞事件之后。

19.一种产生富含心房心肌细胞的心肌细胞群体的方法,所述方法包括:

在中胚层诱导培养基中温育多能干细胞,所述中胚层诱导培养基包含BMP组分和足以生成心房中胚层的有效量的激活素组分;并且其后

向所述细胞中加入视黄酸组分,其中所述视黄酸组分的加入在中胚层诱导培养基中的温育期间或中胚层诱导培养基中的温育之后发生;以及

培养温育的细胞,使得生成富含心房心肌细胞的心肌细胞群体。

20.根据权利要求19所述的方法,其中当所述细胞是RALDH2阳性和CD235a阴性时,加入所述视黄酸组分。

21.根据权利要求19或20所述的方法,其中所述BMP组分与所述激活素组分的比率为约1.5至1或更大。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法,其中所述BMP组分与所述激活素组分的比率为3:2。

23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法,其中所述BMP组分以约3ng/ml至约100ng/ml的浓度存在。

24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法,其中所述BMP组分以约3ng/ml的量存在。

25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法,其中所述激活素组分以约0.01ng/ml至约6ng/ml的量存在。

26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法,其中所述激活素组分以约2ng/ml的量存在。

27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法,其中所述视黄酸组分是反式视黄酸或视黄醇。

28.根据权利要求19至27中任一项所述的方法,其中所述视黄酸组分以50nm至5μM的浓度添加。

29.根据权利要求19至28中任一项所述的方法,其中所述视黄酸组分以500nM的浓度添加。

30.根据权利要求19至29中任一项所述的方法,其中所述BMP组分是BMP4。

31.根据权利要求19至30中任一项所述的方法,其中所述激活素组分是激活素A。

32.根据权利要求19至31中任一项所述的方法,其中在一天后将所述BMP组分加入所述中胚层诱导培养基中。

33.根据权利要求19至31中任一项所述的方法,其中在一天后将所述激活素组分加入所述中胚层诱导培养基中。

34.根据权利要求19至33中任一项所述的方法,其中所述视黄酸组分在所述方法的约第3天至第5天添加。

35.根据权利要求19至34中任一项所述的方法,其中在所述方法的第3天时,不将另外的BMP组分加入所述中胚层诱导培养基中。

36.根据权利要求19至35中任一项所述的方法,其中在所述方法的第3天时,从所述中胚层诱导培养基中排除FGF抑制剂。

37.根据权利要求4至36中任一项所述的方法,其还包括:

在将所述多能干细胞在所述中胚层诱导培养基中温育之前,将所述多能干细胞在适合于聚集体和/或胚状体形成的培养基中温育。

38.根据权利要求4至37中任一项所述的方法,其中通过所述方法产生的细胞用于体外测定中,以筛选潜在的治疗化合物。

39.一种富集心房心肌细胞的分离的心肌细胞群体,其包含至少或约50%的心房心肌细胞、至少或约60%的心房心肌细胞、至少或约70%的心房心肌细胞、至少或约80%心房心肌细胞、或者至少或约90%的心房心肌细胞。

40.根据权利要求39所述的心肌细胞群体,其中所述群体根据权利要求18至38中任一项所述的方法获得。

41.一种富集心室心肌细胞的分离的心肌细胞群体,其包含至少或约50%的心室心肌细胞、至少或约60%的心室心肌细胞、至少或约70%的心室心肌细胞、至少或约80%的心室心肌细胞、或者至少或约90%的心室心肌细胞。

42.根据权利要求41所述的群体,其中所述群体基本上不含起搏细胞或缺乏起搏细胞。

43.根据权利要求41或42所述的群体,其中所述群体根据权利要求4至17中任一项所述的方法获得。

44.一种治疗需要心脏修复的受试者的方法,其包括向所述受试者施用根据权利要求1、2或41至43中任一项所述的心肌细胞群体。

45.根据权利要求44所述的方法,其中所述受试者处于心力衰竭的风险中、患有心力衰竭和/或已经历心肌梗塞事件。

46.根据权利要求45所述的方法,其中所述心肌梗塞在所述患者的心室中。

47.根据权利要求1、2或40至42中任一项所述的心肌细胞群体,其用于治疗需要心脏修复的受试者。

48.根据权利要求1、2或41至43中任一项所述的心肌细胞群体在制备用于治疗需要心脏修复的受试者的药剂中的用途。

49.一种用于检测中胚层细胞群体中的心房中胚层的方法,其包括检测RALDH2,其中RALDH2的存在指示心房中胚层。

50.一种用于检测中胚层细胞群体中的心室中胚层的方法,其包括检测CD235a,其中CD235a的存在指示心室中胚层。

51.一种用于产生富含窦房节起搏细胞或心外膜细胞的心肌细胞群体的方法,所述方法包括:

在中胚层诱导培养基中温育多能干细胞,所述中胚层诱导培养基还包含BMP组分和其量足以生成ALDH+/CD235-中胚层的激活素组分;并且其后

在具有WNT、FGFi和BMP中的一种或多种的合适培养基中培养所述温育的细胞,以生成富含窦房节起搏细胞或心外膜细胞的心肌细胞群体。

52.一种心肌细胞群体,其通过根据权利要求51所述的方法产生。

53.一种筛选或评估测试化合物或试剂的潜在心脏毒性的方法,其包括以下步骤:使根据前述细胞群体权利要求中任一项所述的心肌细胞群体暴露于所述测试化合物,并且评估所述细胞的活力、收缩性、电位中的变化和/或其它功能性。

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