用于促进多能干细胞的增殖的组合物、和促进多能干细胞的增殖的方法与流程

本公开涉及用于促进多能干细胞的增殖的组合物、和促进多能干细胞的增殖的方法。

背景技术：

包括再生医疗在内的干细胞产业中，需要将多能干细胞维持其未分化状态进行大量培养。

专利文献1为了在维持ips细胞等多能干细胞的未分化状态的同时使其增殖，公开了在激活素的存在下培养多能干细胞。

另一方面，专利文献2和3公开了使用血凝素和其变体而去除在多样性干细胞的培养中产生的脱离未分化状态的细胞的方法。此外，专利文献3公开了使用血凝素而将多样性干细胞的悬浮培养中的细胞团块分割为小块的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2012-143229号公报

专利文献2：wo2014/104207

专利文献3：wo2015/199243

技术实现要素：

发明所要解决的技术问题

本公开提供用于促进多能干细胞的增殖的组合物、和促进多能干细胞的增殖的方法。

用于解决问题的技术方案

本公开在一个实施方式中，涉及一种促进增殖组合物，其用于促进多能干细胞的增殖，包含血凝素或其变体作为有效成分。

本公开在另一个实施方式中，涉及一种促进多能干细胞的增殖的方法，其包括在添加了本公开所涉及的促进增殖组合物的培养基中培养多能干细胞。

本公开在另一个实施方式中，涉及一种多能干细胞的培养方法，其包括进行本公开所涉及的促进增殖的方法。

发明效果

根据本公开，在一个或多个实施方式中，能够实现可以在维持其未分化状态的情况下促进多能干细胞的增殖的效果。

附图说明

图1是确认源自人ips细胞的单一细胞的克隆细胞培养中的血凝素(ha)的促进增殖效果的结果图。

图2是实施例中的实验方案的概略图。

图3是将人ips细胞的细胞团块的悬浮培养中的培养时间与细胞密度描点而得到的图。

图4是确认人ips细胞的细胞团块的悬浮培养中的血凝素(ha)的影响的显微镜观察照片的结果图。

图5是确认ha添加对细胞团块中的细胞数的影响的图的一例。〇：未添加ha、△：添加5mmha、□：添加10mmha。

图6是细胞团块内部的可分裂细胞的不均匀性的荧光染色显微镜观察的结果的一例。

具体实施方式

本申请发明人等参与开发去除在多能干细胞的培养中产生的“脱离未分化状态的细胞”的技术。“脱离未分化状态的细胞”具有在培养中的多能干细胞的集落中央部或集落周边部产生的倾向。并且表明，通过向培养中的集落添加血凝素，能够去除在集落中央部已产生/将产生的“脱离未分化状态的细胞”等(wo2014/104207和wo2015/199243)。此外表明，如果向将多能干细胞悬浮培养而形成的细胞团块添加血凝素，则能够将该细胞团块容易地分割为小块(wo2015/199243)。据推测，这些结果所依据的机理是，血凝素特异性地结合于作为细胞粘附分子的e-钙粘素(cadherin)而抑制细胞间粘附。

本公开的基础是，本申请发明人进一步反复深入研究，结果发现血凝素具有有助于促进多能干细胞的增殖的效果。具体而言，据推测血凝素发挥缓和细胞间粘附那样的功能，使所培养的多能干细胞的集落或细胞团块内的细胞环境容易增殖，从而促进增殖。并且，据推测通过缓和细胞间粘附，所培养的多能干细胞的集落的细胞间粘附力均匀化，能够抑制“脱离未分化状态的细胞”的产生。但是，本公开可以不限定于这些机理而进行解释。

[多能干细胞]

本公开中，多能(pluripotent)干细胞在非限定的一个或多个实施方式中，是人多能干细胞。本公开中，人多能干细胞在非限定的一个或多个实施方式中，是人ips细胞或人es细胞。

[脱离未分化状态的细胞]

本公开中，脱离未分化状态的细胞(脱离未分化的细胞)在非限定的一个或多个实施方式中，是指细胞形态与未分化状态的细胞的形态不同，能够辨别。进一步，成为脱离未分化的细胞在非限定的一个或多个实施方式中，能够通过未分化标志物的消失而确认。未分化标志物在非限定的一个或多个实施方式中，是oct3/4、nanog、ssea-4、tra-1-60。

[血凝素(ha)]

本公开中，血凝素在非限定的一个或多个实施方式中，是肉毒梭状芽胞杆菌(clostridiumbotulinum)的血凝素。本公开中，血凝素在没有特别提及的情况中，是指神经毒素复合体(也称为血凝素复合体)。从促进具有多能性的细胞的增殖的观点出发，血凝素可以举出包含由选自肉毒梭状芽胞杆菌(clostridiumbotulinum)的神经毒素复合体中的3种血凝素亚单位ha1(ha33)、ha2(ha17)和ha3(ha70)中的2种或3种成分构成的复合体或其复合体的血凝素。血凝素包含由ha2(ha17)和ha3(ha70)构成的复合体或由3种成分构成的复合体或其复合体。

上述亚单位ha3(ha70)在一个或多个实施方式中，从促进具有多能性的细胞的增殖的观点出发，优选为a型或b型的肉毒梭状芽胞杆菌的亚单位。此外，亚单位ha1(ha33)和ha2(ha17)在非限定的一个或多个实施方式中，可以为a型、b型、和c型中任一肉毒梭状芽胞杆菌的亚单位。血凝素在非限定的一个或多个实施方式中，各亚单位各自可以为重组体，也可以为天然型。

[血凝素的变体]

本公开中，血凝素在具有有助于促进多能干细胞的增殖的效果的范围内，可以为血凝素的变体。作为该变体的一个或多个实施方式，可以举出亚单位中的1个、2个或3个氨基酸序列具有至少1个氨基酸突变。作为该变体，可以使用wo2015/199243所举出的物质。

本公开中，在没有特别说明的情况下，“血凝素”包含“血凝素变体”。此外，本公开中，在没有特别说明的情况下，“血凝素变体”具有有助于促进多能干细胞的增殖的效果。

[促进多能干细胞的增殖的组合物]

本公开作为一个实施方式，涉及用于促进多能干细胞的增殖的组合物，其包含血凝素或其变体。

从增殖具有多能性的细胞的促进的观点出发，本公开所涉及的促进增殖组合物优选包含有效量的血凝素或其变体。

根据本公开所涉及的促进增殖组合物，能够促进多能干细胞的增殖。根据本公开所涉及的促进增殖组合物，在一个或多个实施方式中，进一步能够进行均匀性高的培养。在此，均匀性高是指可以包括例如所培养的细胞的细胞间粘附的均匀性高、细胞间粘附力的均匀性高、或者细胞团块的大小一致。均匀性高的培养能够有助于提高增殖后得到的多能干细胞的品质。本公开所涉及的促进增殖组合物在一个或多个实施方式中，与以往的培养方法不同，使细胞块或集落中的各细胞间的均匀性高的培养成为可能。其结果是，在以往的培养方法中增殖能力低的细胞变多的位置、例如在细胞块内部或集落的周边部以外的位置，维持细胞增殖能力的细胞的存在数也增加，其结果是也能够以高效率使细胞增殖。

本公开所涉及的促进增殖组合物能够添加于多能干细胞的培养基中而使用。作为培养基中的添加浓度，在一个或多个实施方式中，从促进具有多能性的细胞的增殖的观点出发，可以举出使添加后的培养基中的血凝素或其变体的浓度达到5nm以上、10nm以上、或15nm以上的浓度。此外，从相同的观点出发，可以举出使其达到200nm以下、150nm以下、或100nm以下的浓度。

作为本公开所涉及的促进增殖组合物的使用方法，可以举出后述的促进多能干细胞的增殖的方法、和多能干细胞的培养方法。

[促进多能干细胞的增殖的方法]

本公开作为一个实施方式中，涉及一种促进多能干细胞的增殖的方法，其包括在添加了本公开所涉及的促进增殖组合物的培养基中培养多能干细胞。作为添加本公开所涉及的促进增殖组合物的培养基，没有特别限制，可以为能够在多能干细胞的培养中使用的培养基。本公开所涉及的促进增殖化合物的添加浓度如上所述，可以举出有效量。一个或多个实施方式中，可以举出使添加后的培养基中的血凝素或其变体的浓度达到5nm以上、10nm以上、或15nm以上的浓度。此外，从相同的观点出发，可以举出使其达到200nm以下、150nm以下、或100nm以下的浓度。

[第一实施方式：由单一细胞或分散细胞培养]

作为本公开所涉及的促进增殖方法的一个或多个实施方式，涉及一种促进多能干细胞的增殖的方法，其包括接种单一细胞状态或分散状态的多能干细胞、和在添加了血凝素或其变体的培养基中培养多能干细胞。通过使单一细胞状态或分散状态的多能干细胞集团与血凝素或其变体接触，在一个或多个实施方式中，在培养时，即使是集落的中心，维持细胞增殖能力的细胞的存在数也增加，能够进行均匀性提高的培养。其结果是，高效促进细胞的增殖，最终与以往的方法相比，能够以高增殖率进行培养。

本公开中，单一细胞状态的细胞是指通过细胞分散处理而使细胞块分散直至单一细胞而得到的1个或多个细胞。接种的细胞数没有特别限制，可以为1个细胞，也可以为多个细胞。细胞分散处理的方法没有特别限制，可以举出例如胰蛋白酶或链霉蛋白酶等酶处理、例如吸移等物理处理、或它们的组合等。

本公开中，接种分散状态的细胞是指接种将细胞块进行细胞分散处理而得到的并非所有细胞形成单一细胞的状态的细胞集团。上述细胞集团中可以包含单一细胞。

血凝素或其变体在培养基中的添加和多能干细胞的接种可以是任一者在先进行，也可以同时进行。

第一实施方式的促进增殖方法可以是平板培养(粘附培养)，也可以是悬浮培养。平板培养的情况中，血凝素或其变体优选在形成多能干细胞的集落前，添加至培养基中。

[第二实施方式：悬浮培养]

作为本公开所涉及的促进增殖方法的一个或多个实施方式，可以举出一种促进增殖方法，其是促进多能干细胞的增殖的方法，其包括：向多能干细胞的细胞团块的悬浮培养的培养基添加血凝素或其变体，且在未将上述细胞团块分割为小块的情况下进行培养。本公开中，细胞团块是指在一个或多个实施方式中，将多能干细胞进行悬浮培养时形成的球状的细胞块。本公开中，“未将细胞团块分割为小块”是指在一个或多个实施方式中，在添加血凝素或其变体后，至部分或全部的培养结束为止，不进行产生与添加前的细胞团块的大小相比更小的细胞团块、分散细胞、和单一细胞等的作业或处理。

本实施方式中，能够进行均匀性高的培养，因此能够在对细胞造成的损伤或应激小的情况下促进增殖，其结果是能够高效地使细胞增殖而不分割细胞块。

本公开中，“将细胞团块分割为小块”在没有特别说明的情况下，是指利用血凝素分割多能干细胞的细胞团块(参照wo2015/199243)。wo2015/199243公开了如果向具有培养中的ips细胞的细胞团块的培养液添加血凝素，则即使是ips细胞那样的易损的细胞的细胞团块，也能够通过吸移等平稳地分割为小块。该文献此外还公开了，通过将细胞团块分割为小块，能够提高所培养的活细胞浓度。

另一方面，本实施方式(第二实施方式)所涉及的促进增殖方法是在使血凝素对细胞团块发挥作用后，进行培养而不将细胞团块进行分割的方法。本实施方式的促进增殖方法的机理推定如下。如果使血凝素对细胞团块发挥作用，则形成细胞团块的细胞间的相互作用缓和的状态，即使在细胞团块的内部，维持细胞增殖能力的细胞的存在数也增加，能够进行均匀性提高的培养。其结果是，能够形成更大的细胞团块，其结果是促进了高效率的增殖。但是，本公开可以不限定于该机理而进行解释。

根据本实施方式(第二实施方式)所涉及的促进增殖方法，即使是ips细胞那样的易损的细胞，也能够在抑制与细胞团块的分割所伴随的损伤的同时，促进细胞的增殖。

本公开中，多能干细胞的悬浮培养可以例如使用生物反应器而进行。

[多能干细胞的培养方法]

本公开在另一个实施方式中，涉及一种多能干细胞的培养方法，其包括进行本公开的促进增殖方法。针对本公开的促进增殖方法，可以参照上文。

根据本公开所涉及的培养方法，能够促进多能干细胞的增殖。根据本公开所涉及的培养方法，在一个或多个实施方式中，还能够进行均匀性高的培养。

本公开还可以涉及以下的实施方式。

[1]一种促进增殖组合物，其用于促进多能干细胞的增殖，包含血凝素或其变体。

[2]一种促进多能干细胞的增殖的方法，其包括在添加了[1]所述的促进增殖组合物的培养基中培养多能干细胞。

[3]一种促进多能干细胞的增殖的方法，其包括接种单一细胞状态或分散状态的多能干细胞、和在添加了血凝素或其变体的培养基中培养上述多能干细胞。

[4]根据[3]所述的促进增殖方法，其包括将血凝素或其变体在形成多能干细胞的集落前添加至培养基中。

[5]一种促进多能干细胞的增殖的方法，其包括：向多能干细胞的细胞团块的悬浮培养的培养基添加血凝素或其变体，且在未将上述细胞团块分割为小块的情况下进行培养。

[6]一种多能干细胞的培养方法，其包括进行[2]至[5]中任一项所述的促进增殖方法。

实施例

以下，通过实施例进一步详细说明本公开，但这些是例示性的，本公开不限于这些实施例。

[粘附培养：克隆细胞培养]

确认源自人ips细胞的单一细胞的克隆细胞培养中的血凝素(ha)的效果。在imatrix涂布培养面上接种ips细胞(单一细胞)，在下述条件下培养，确认ha的有无所导致的影响。

〔细胞〕

人ips细胞：tic株的单一细胞

〔培养基〕

stemfit(商标)ak03培养基(味之素公司制)

〔容器〕

imatrix涂布培养面

〔ha制备·添加方法〕

ha：b型

添加浓度：50nm

添加频率(培养第1天起每日)

〔培养条件〕

37℃、5％co2气氛下

培养开始时(t＝0)起使用添加了ha复合体的培养基。

〔观察〕

在t＝24小时、t＝216小时时，用incellanalyzer2000(商品名，geヘルスケアバイオサイエンス公司制)观察培养细胞并获取图像。所得显微镜观察照片示于图1。

〔结果〕

如图1所示那样，使用添加了ha的培养基的培养中，与使用未添加ha的培养基的培养相比，发现增殖的速度高。此外，使用添加了ha的培养基的培养中，与使用未添加ha的培养基的培养相比，抑制了脱离未分化的细胞的出现频率。

[悬浮培养：细胞团块培养]

确认ips细胞的悬浮培养中的血凝素(ha)的效果。

〔细胞〕

人ips细胞：tic株

〔培养基〕

mtesr1培养基(stemcelltechnologies)

〔容器〕

30ml生物反应器(ableco.ltd.)

〔接种密度〕

1x10⁵细胞/ml

〔ha制备·添加方法〕

ha：typeb

添加浓度：10nm

〔培养条件〕

37℃、5％co2气氛下

培养开始时(t＝0)的72小时后起，在3天内每隔24小时以血凝素浓度达到10nm的方式添加(图2)。

〔观察〕

t＝0起，每隔24小时用incellanalyzer2000(商品名，geヘルスケアバイオサイエンス公司制)观察培养细胞并获取图像，同时测定培养基的每单位体积的细胞密度(图3和4)。

〔结果〕

将t＝0至t＝72h记作第1相，将t＝72h至t＝168h记作第2相，将培养时间分为2段，算出各相中的细胞存活率(α)与表观比增殖速度(μ)(表1)。如下述表1所示那样，添加了ha的第2相中，与第1相和未添加ha的第2相相比，增殖的速度优异。此外，添加了ha的第2相中，与第1相和未添加ha的第2相相比，细胞团块的大小均匀，此外，抑制了脱离未分化的细胞的出现频率。

α值和μ值的算出方法

α＝x24/x0

x0＝接种时(0小时)的细胞密度

x24＝接种后24小时时的细胞密度

μ＝ln(x2/x1)/(t2-t1)

t1＝24小时(第1相)或96小时(第2相)

t2＝72小时(第1相)或168小时(第2相)

[表1]

表1细胞存活率(α)与表观比增殖速度(μ)的对比

[悬浮培养：细胞团块培养2]

作为ha的添加对人ips细胞团块的增殖的效果，针对细胞增殖特性和团块内的细胞分裂的不均匀性这2点进行评价。

〔细胞〕

人ips细胞：tic株

〔培养基〕

stemfit(商标)ak02培养基(味之素公司制)

培养基交换频率：每24小时

〔容器〕

96孔板v型底(住友ベークライト公司制，primesurface(商标))

〔ha制备·添加方法〕

ha：b型

添加浓度(培养24小时以后)：0,5,10nm

〔培养条件〕

37℃、5％co2气氛下

接种细胞数：3.0x10³细胞/孔

培养时间240小时

〔测定项目〕

细胞增殖特性：测定团块细胞数、和培养24小时至168小时的表观比增殖速度(μ)。

团块内特性：对冻结切片利用荧光染色法进行观察(核＝dapi，可分裂细胞＝抗ki-67抗体)，由此观察细胞分裂的不均匀性。

测定频率：培养24小时以后每48小时

〔细胞增殖特性的结果〕

对tic株，使用包含ha的添加浓度为0,5,10nm的培养基，在上述的培养条件下进行培养。作为增殖特性，测定团块细胞数和比增殖速度(μ)。

团块细胞数的结果示于图5。如该图所示，ha添加条件(添加浓度：△＝5nm、□＝10nm)与未添加条件(〇＝0nm)相比，确认到团块细胞数增加。比增殖速度(μ)基于下述式，作为培养24小时至168小时的表观比增殖速度而算出。其结果示于下述表2。如该表所述，比增殖速度(μ)的值在添加ha时与未添加时相比变高，确认到促进增殖。

μ＝ln(x2/x1)/(t2-t1)

x1＝t1＝24小时

x2＝t2＝168小时

[表2]

〔团块内特性的结果〕

作为团块内特性，进行利用荧光染色法的显微镜观察。将核用dapi染色(红)，将可分裂细胞用抗ki-67抗体染色(绿)，确认团块内的可分裂细胞的不均匀性。其结果的一例示于图6。

未添加ha的条件下，在培养24小时时，可分裂细胞(ki-67阳性细胞)在团块内大致均匀存在(黄色部分)。其后，在团块内部，未观察到可分裂细胞，示出仅周边部的不均匀性。即，由于仅在团块周边部进行分裂，从而确认到细胞团块的细胞数增加。

在添加ha的条件(5,10nm)下，培养24小时时观察到与未添加ha下的培养相同的倾向，但其后的培养中，在团块周边部的可分裂细胞的频率与未添加ha相比变高。添加10nmha的培养中，即使在团块内部也确认到可分裂细胞存在。根据上述，通过添加ha，示出团块内的细胞分裂频率提高，增殖速度上升。此外，确认到因ha而导致的增殖速度上升示出ha浓度依赖性。

工业实用性

本公开所涉及的方法和组合物在例如再生医疗的领域中是有用的。