本发明涉及药物中间体制备领域，特别是涉及一种甾体药物中间体的制备方法。
背景技术：
甾体化合物具有各种生物活性，它们的应用非常广泛，有些被采用治疗疾病或发展生产，如治疗过敏性疾病的氢化可的松、避孕药黄体酮、利尿剂安体舒通、合成甾体激素的薯蓣皂甙元、强心作用的狄戈辛、蟾毒甙等都是甾体化合物。甾体药物中间体可以通过进一步的合成，从而得到在临床中有广泛应用的3tr、氟轻松、曲安奈德等系列药物。
甾体药物中间体的合成路线中，通常选用其合适的上游中间体，通过生物转化的方法进行，但一般的生物转化方法转化的目标产物收率低，副产物较多。
技术实现要素：
基于此，有必要提供一种目标产物收率高、副产物较少的甾体药物中间体的制备方法。
一种甾体药物中间体的制备方法，包括以下步骤：用简单诺卡氏菌对第一化合物进行微生物转化得到所述甾体药物中间体，所述第一化合物如通式i所示，所述甾体药物中间体如通式ii所示，
通式i和通式ii中r为h、卤原子、烷基、烷氧基、羟基或苯基。
在其中一个实施例中，所述微生物转化具体包括以下步骤：
将简单诺卡氏菌接种于发酵培养基中；
在所述发酵培养基中加入所述第一化合物，经发酵得到发酵液；
将所述发酵液分离提取即得所述甾体药物中间体。
在其中一个实施例中，在所述发酵前还包括以下步骤：在所述发酵培养基中加入聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚，聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚与所述发酵培养基的质量体积比为0.01g～0.2g:100ml。
在其中一个实施例中，所述第一化合物的粒径大小为100～300目。
在其中一个实施例中，所述发酵时的温度为26℃～32℃，搅拌转速为120rpm～200rpm，空气流量为0.3vvm～0.7vvm，罐压为0.02mpa～0.06mpa。
在其中一个实施例中，每100ml所述发酵培养基中包含以下质量的组分：葡萄糖0.2g～2.0g、玉米浆0.5g～1.5g、蛋白胨0.3g～1.0g、磷酸二氢钾0.1g～0.3g和消泡剂0.01g～0.2g。
在其中一个实施例中，所述第一化合物与所述发酵培养基的质量体积比为1g～8g:100ml。
在其中一个实施例中，在将简单诺卡氏菌接种于所述发酵培养基之前还包括以下步骤：将简单诺卡氏菌进行斜面培养和种子培养。
在其中一个实施例中，所述分离提取包括以下步骤：将所述发酵液过滤得到滤饼，干燥后用二氯甲烷溶解，然后过滤得到滤液，于35～50℃减压浓缩干燥。
在其中一个实施例中，在所述减压浓缩干燥后还包括以下步骤：将所述减压浓缩干燥得到的固体溶于甲醇与二氯甲烷的混合溶剂中，于40～45℃回流1～3小时，然后降温至10～30℃，过滤得到滤饼，烘干即得所述甾体药物中间体。
本发明选用上述通式i所示的第一化合物为底物，并仅使用简单诺卡氏菌(nocardioidessimplex)进行生物转化，对底物同时进行1,2位脱氢及21位醋酸酯水解，得到甾体药物中间体，21位醋酸酯水解能够有效地促进1,2位脱氢，使转化形成的产物中绝大部分都是上述通式ii所示的甾体药物中间体，副产物的比例很低。提纯后的产品为白色或类白色晶体，相对底物重量收率为75％～85％，目标产物甾体药物中间体收率较高，经过hplc分析，其纯度≥99％，外标含量>98％。得到该甾体药物中间体后即可方便地通过进一步的合成反应，轻松获得高纯度的甾体药物如1,4,9(11)-孕甾-17-羟基-3,20-二酮-21-醋酸酯等，十分适合工业化发酵生产，能够提高生产效率，降低生产成本。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施方式的甾体药物中间体的制备方法，包括以下步骤：用简单诺卡氏菌对第一化合物进行微生物转化得到甾体药物中间体，第一化合物如通式i所示，甾体药物中间体如通式ii所示，
通式i和通式ii中r为h、卤原子、烷基、烷氧基、羟基或苯基。
本实施方式选用上述通式i所示的第一化合物为底物，并仅使用简单诺卡氏菌(nocardioidessimplex)进行生物转化，对底物同时进行1,2位脱氢及21位醋酸酯水解，得到甾体药物中间体，21位醋酸酯水解能够有效地促进1,2位脱氢，使转化形成的产物中绝大部分都是上述通式ii所示的甾体药物中间体，副产物(如通式iii所示的第二化合物和通式iv所示的第三化合物)的比例很低。提纯后的产品为白色或类白色晶体，相对底物重量收率为75％～85％，目标产物甾体药物中间体收率较高，经过hplc分析，其纯度≥99％，外标含量>98％。得到该甾体药物中间体后即可方便地通过进一步的合成反应，轻松获得高纯度的甾体药物如1,4,9(11)-孕甾-17-羟基-3,20-二酮-21-醋酸酯等，十分适合工业化发酵生产，能够提高生产效率，降低生产成本。
在一个实施例中，r为h，即第一化合物为如结构式v所示的4,9(11)-孕甾-17-羟基-3,20-二酮-21-醋酸酯，甾体药物中间体为如结构式vi所示的1,4,9(11)-孕甾-17,21-二醇-3,20-二酮。此时副产物中第二化合物为如结构式vii所示的1,4,9(11)-孕甾-17-羟基-3,20-二酮-21-醋酸酯，第三化合物为如结构式viii所示的4,9(11)-孕甾-17,21-二醇-3,20-二酮。
具体地，微生物转化具体包括以下步骤s1～s3：
s1、将简单诺卡氏菌接种于发酵培养基中；
s2、在发酵培养基中加入第一化合物，经发酵得到发酵液；
s3、将发酵液分离提取即得甾体药物中间体。
在一个实施例中，在发酵前还包括以下步骤：在发酵培养基中加入聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚，聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚与发酵培养基的质量体积比为0.01g～0.2g:100ml，加入一定量的聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚(ppe)有利于获得较高的目标产物转化率。
优选地，第一化合物的粒径大小为100～300目。如此，将底物磨成细粉状可以促进底物的溶解，增加与菌体的接触面积，提高转化得到目标产物的效率。
在一个实施例中，发酵时的温度为26℃～32℃，搅拌转速为120rpm～200rpm，空气流量为0.3vvm～0.7vvm，罐压为0.02mpa～0.06mpa。
在一个实施例中，每100ml发酵培养基中包含以下质量的组分：葡萄糖0.2g～2.0g、玉米浆0.5g～1.5g、蛋白胨0.3g～1.0g、磷酸二氢钾0.1g～0.3g和消泡剂0.01g～0.2g。优选地，发酵培养基的ph为6.5～7.5。
优选地，第一化合物与发酵培养基的质量体积比为1g～8g:100ml。
在一个实施例中，在将简单诺卡氏菌接种于发酵培养基之前还包括以下步骤：将简单诺卡氏菌进行斜面培养和种子培养。
具体地，斜面培养包括以下步骤：挑取简单诺卡氏菌菌种接种于斜面培养基上，于26～33℃倒置培养2～4天，培养结束后可置于4℃下保存备用。可选地，每100ml斜面培养基中包括以下质量的组分：牛肉膏0.1g～0.5g、蛋白胨0.1g～0.8g和琼脂1g～3g，ph为6.0～8.0。
具体地，种子培养包括以下步骤：将上述斜面培养后的诺卡氏菌于无菌条件下用接种环刮下，接种入液体培养基中，一支斜面(约1×109～1×1010菌体数量)接种于100ml液体培养基，接种后在恒温摇床上培养，培养条件为温度26～33℃，转速为120～180rpm，培养时间为24～48小时。可选地，每100ml种子培养的液体培养基中包括以下质量的组分：葡萄糖0.2g～2.0g、玉米浆0.5g～1.5g、蛋白胨0.3g～1.0g、磷酸二氢钾0.1g～0.3g和消泡剂0.01g～0.2g，ph为6.5～8.0，培养基于121℃灭菌30分钟。
在一个实施例中，将简单诺卡氏菌接种于发酵培养基具体包括以下步骤：于无菌条件下，每100ml发酵培养基中加入5～20ml经上述种子培养得到的培养液，培养条件为温度26～33℃，转速为120～180rpm，培养时间为24～48小时。优选地，每100ml发酵培养基中加入1×109～2×1010菌体数量。
优选地，在将简单诺卡氏菌接种于发酵培养基后，取发酵培养基稀释30倍，用分光光度计于580nm下检测，od值大于0.5时向发酵培养基中加入第一化合物。
在一个实施例中，分离提取包括以下步骤：将发酵液过滤得到滤饼，干燥后用二氯甲烷溶解，然后过滤得到滤液，于35～50℃减压浓缩干燥。
进一步地，在减压浓缩干燥后还包括以下步骤：将减压浓缩干燥得到的固体溶于甲醇与二氯甲烷的混合溶剂中，于40～45℃回流1～3小时，然后降温至10～30℃，过滤得到滤饼，烘干即得甾体药物中间体。优选地，甲醇与二氯甲烷的混合溶剂中甲醇与二氯甲烷的体积比为2～4:1。
以下为具体实施例。
实施例1
于20升发酵罐内装入12升发酵培养基，接种600ml经过种子培养所得的简单诺卡氏菌种子液(菌体浓度：2.4×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速160rpm，培养时间24小时。
取样稀释30倍，用分光光度计与580nm下检测，od值为0.62。将240g的4,9(11)-孕甾-17-羟基-3,20-二酮-21-醋酸酯和9.6g的ppe加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速180rpm，空气流量0.2～0.3vvm，转化72小时后取样送hplc分析，结果如表1所示：
表1
转化完成后将发酵液灭火过滤，得滤饼湿重390g，烘干得干重220g，溶于1700ml二氯甲烷，过滤除去菌渣得到滤液，菌渣用少量甲醇冲淋并收集冲淋液与滤液合并，于35℃浓缩至糊状，甩干，再用少量甲醇冲淋后烘干得到粗品。将粗品溶于1600ml甲醇与二氯甲烷的混合溶剂中，于40℃回流2小时，梯度降温至10～30℃，保温过滤后将滤饼烘干得到183g白色固体，用hplc分析，结果如表2所示：
表2
对比例1
于20升发酵罐内装入12升发酵培养基，接种600ml经过种子培养所得的简单节杆菌(arthrobactersimplex)种子液(菌体浓度：2.5×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速160rpm，培养时间24小时。
取样稀释30倍，用分光光度计与580nm下检测，od值为0.65。将240g的4,9(11)-孕甾-17-羟基-3,20-二酮-21-醋酸酯和9.6g的ppe加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速180rpm，空气流量0.2～0.3vvm，转化72小时后取样送hplc分析，结果如表3所示：
表3
对比例2
于20升发酵罐内装入12升发酵培养基，接种600ml经过种子培养所得的简单诺卡氏菌(nocardioidessimplex)种子液(菌体浓度：2.5×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速160rpm，培养时间24小时。
取样稀释30倍，用分光光度计与580nm下检测，od值为0.60。将240g的4,9(11)-孕甾-17,21-二醇-3,20-二酮和9.6g的ppe加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速180rpm，空气流量0.2～0.3vvm，转化72小时后取样送hplc分析，结果如表4所示：
表4
实施例2
于20升发酵罐内装入12升发酵培养基，接种600ml经过种子培养所得的简单诺卡氏菌种子液(菌体浓度：3.2×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速160rpm，培养时间24小时。
取样稀释30倍，用分光光度计与580nm下检测，od值为0.56。将240g的4,9(11)-孕甾-17-羟基-3,20-二酮-21-醋酸酯和9.6g的ppe加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速180rpm，空气流量0.2～0.3vvm，转化72小时后取样送hplc分析，结果如表5所示：
表5
转化完成后将发酵液灭火过滤，得滤饼湿重373g，烘干得干重215g，溶于1700ml二氯甲烷，过滤除去菌渣得到滤液，菌渣用少量甲醇冲淋并收集冲淋液与滤液合并，于45℃浓缩至糊状，甩干，再用少量甲醇冲淋后烘干得到粗品。将粗品溶于2000ml甲醇与二氯甲烷的混合溶剂中，于45℃回流3小时，梯度降温至10～30℃，保温过滤后将滤饼烘干得到181g白色固体，用hplc分析，结果如表6所示：
表6
实施例3
于1000升发酵罐内装入600升发酵培养基，接种2000ml经过种子培养所得的简单诺卡氏菌种子液(菌体浓度：2.6×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速150rpm，培养时间24小时。
取样稀释30倍，用分光光度计与580nm下检测，od值为0.53。将12kg的4,9(11)-孕甾-17-羟基-3,20-二酮-21-醋酸酯和0.48kg的ppe加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速180rpm，空气流量0.2～0.3vvm，转化72小时后取样送hplc分析，结果如表7所示：
表7
转化完成后将发酵液灭火过滤，得滤饼湿重26kg，烘干得干重10.8kg，溶于120l二氯甲烷，过滤除去菌渣得到滤液，菌渣用少量甲醇冲淋并收集冲淋液与滤液合并，于40℃浓缩至糊状，甩干，再用少量甲醇冲淋后烘干得到粗品。将粗品溶于100l甲醇与二氯甲烷的混合溶剂中，于42℃回流2小时，梯度降温至10～30℃，保温过滤后将滤饼烘干得到9.16kg白色固体，用hplc分析，结果如表8所示：
表8
实施例4
于20升发酵罐内装入12升发酵培养基，接种600ml经过种子培养所得的简单诺卡氏菌种子液(菌体浓度：3.3×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速160rpm，培养时间24小时。
取样稀释30倍，用分光光度计与580nm下检测，od值为0.55。将240g的4,9(11)-孕甾-16α-甲基-17-羟基-3,20-二酮-21-醋酸酯和9.6g的ppe加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速180rpm，空气流量0.2～0.3vvm，转化72小时后取样送hplc分析，结果如表9所示：
表9
转化完成后将发酵液灭火过滤，得滤饼湿重370g，烘干得干重214g，溶于3.22l二氯甲烷，过滤除去菌渣得到滤液，菌渣用少量甲醇冲淋并收集冲淋液与滤液合并，于40℃浓缩至糊状，甩干，再用少量甲醇冲淋后烘干得到粗品。将粗品溶于1500ml甲醇与二氯甲烷的混合溶剂中，于45℃回流3小时，梯度降温至10～30℃，保温过滤后将滤饼烘干得到188g白色固体，用hplc分析，结果如表10所示：
表10
实施例5
于20升发酵罐内装入12升发酵培养基，接种600ml经过种子培养所得的简单诺卡氏菌种子液(菌体浓度：2.1×109个/ml)，开始培养，培养条件为温度31℃，转速160rpm，培养时间24小时。
取样稀释30倍，用分光光度计与580nm下检测，od值为0.58。将240g的4,9(11)-孕甾-17-羟基-3,20-二酮-21-醋酸酯加入发酵罐中，开始发酵转化。发酵转化时的培养条件为温度31±1℃，转速180rpm，空气流量0.2～0.3vvm，转化72小时后取样送hplc分析，结果如表11所示：
表11
转化完成后将发酵液灭火过滤，得滤饼湿重378g，烘干得干重221g，溶于1700ml二氯甲烷，过滤除去菌渣得到滤液，菌渣用少量甲醇冲淋并收集冲淋液与滤液合并，于40℃浓缩至糊状，甩干，再用少量甲醇冲淋后烘干得到粗品。将粗品溶于2000ml甲醇与二氯甲烷的混合溶剂中，于45℃回流3小时，梯度降温至10～30℃，保温过滤后将滤饼烘干得到167g白色固体，用hplc分析，结果如表12所示：
表12
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。