1.基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法,其特征在于包括以下步骤:
1)根据长毛明对虾(NC_026885.1)和凡纳滨对虾(NC_009626.1)线粒体基因组全序列,设计扩增细胞色素C氧化酶I(COI)基因片段的引物COIF和COIR;
2)提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA,利用引物COIF和COIR进行PCR反应;
3)将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,并测序验证;
4)利用MEGA7.0比对获得的序列,同时利用DNAMAN(Version9.0)预测各种对虾代表序列的酶切位点;
5)取待放流的长毛明对虾F1代仔虾和亲虾,分别提取基因组DNA;
6)利用COIF和COIR,对DNA模板F1~F4,P1~P4,V1,V2,Y1,Y2,V1+Y1(1︰1),V2+Y2(1︰1)进行PCR扩增,再将所述的PCR扩增产物进行酶切,酶切产物进行电泳鉴定。
2.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法,其特征在于在步骤1)中,所述引物为:
COIF:5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’;
COIR:5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
3.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法,其特征在于在步骤2)中,所述提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA,是提取10尾长毛明对虾和10尾凡纳滨对虾的基因组DNA。
4.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法,其特征在于在步骤2)中,所述长毛明对虾为Y1~Y10,所述凡纳滨对虾为V1~V10。
5.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法,其特征在于在步骤2)中,所述提取的长毛明对虾和凡纳滨对虾的DNA,是采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒DP324,天根产。
6.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法,其特征在于在步骤2)中,所述PCR反应体系为:12.5μl2×EasyTaq PCR SuperMix(-dye),1μl COIF,1μl COIR,1μl DNA,ddH2O补充至25μl;所述PCR反应程序为:①94℃3min;②40个循环:94℃1min,41℃1min15s,72℃1min30s;③72℃10min。
7.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法,其特征在于在步骤2)中,所述长毛明对虾的PCR扩增产物序列为:
8.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法,其特征在于在步骤2)中,所述凡纳滨对虾的PCR扩增产物序列为:
其中,A/AGCTT为酶切位点;所述酶切位点可使用HindIII内切酶;所述电泳可采用琼脂糖凝胶电泳;
长毛明对虾和凡纳滨对虾经PCR扩增的产物片段长度为663bp;凡纳滨对虾存在酶切位点AAGCTT,经酶切产生379bp和284bp酶切片段;在长毛明对虾中不存在该酶切位点,故仍存在663bp的条带,若长毛明对虾虾苗中掺杂凡纳滨对虾,则会出现663bp,379bp和284bp3条片段。
9.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法,其特征在于在步骤3)中,所述将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,是将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳1%检测。
10.如权利要求1所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法,其特征在于在步骤5)中,所述取待放流的长毛明对虾F1代仔虾和亲虾,是取厦门翔安欣星海水产养殖专业合作社待放流的4口水泥池的长毛明对虾F1代仔虾和4尾亲虾;所述4口水泥池的长毛明对虾F1代仔虾为F1,F2,F3,F4;所述4尾亲虾为P1,P2,P3,P4。