一种同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的试剂盒的制作方法

本发明属于植物病原检测技术领域。更具体地，涉及一种同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的试剂盒。

背景技术：

拟毛刺线虫是植物根际重要的植物寄生线虫，不仅寄生植物的根部，影响根系生长，甚至造成根部生长停滞，导致植物根系粗短，而且能够传播植物病毒，造成更大的危害。在已知的拟毛刺线虫种类中，有9种为烟草碎裂病毒组Tobavirus中烟草脆裂病毒（TRV）、豌豆早褐病毒（PEBV）和辣椒环斑病毒（PRV）的传播媒介，这9种拟毛刺线虫为较小拟毛刺线虫（Paratrichodorus minor）、葱拟毛刺线虫（P.allius）、银莲花拟毛刺线虫（P.anemones）、多变拟毛刺线虫（P.divergens）、西班牙拟毛刺线虫（P.hispanus）、短小拟毛刺线虫（P.nanus）、厚皮拟毛刺线虫（P.pachydermus）、光滑拟毛刺线虫（P.teres）、突尼斯拟毛刺线虫（P.tunisiensis）。因此，我国于2007年将拟毛刺属线虫传毒种列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，在口岸实施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。

其中，较小拟毛刺线虫[Praratrichodorus minor (Colbran, 1965) Siddiqi, 1974]与肾状拟毛刺线虫(Paratrichodorus renifer Siddiqi, 1974)形态难区分，两者的区别主要在雌虫骨化结构（较小拟毛刺杆状、与体轴平行，肾状拟毛刺肾形、倾斜）；咽腺覆盖肠情况（较小拟毛刺咽腺腹面或亚腹面覆盖肠或者不覆盖肠，肾状拟毛刺线虫咽腺不覆盖肠）；较小拟毛刺线虫的雄虫少见，肾状拟毛刺线虫的雄虫未见。传统的形态鉴定较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫需要大量的虫源，鉴定者需要具备丰富的经验，且容易漏检、错检。

随着分子生物学的发展，线虫检测鉴定技术取得了重大突破，线虫的系统分类不再仅仅依靠形态学特征等传统的方法，已探索出许多线虫种群分类鉴定的分子诊断方法。分子鉴定方法具有准确性更高、更灵敏特异等优势。但分子检测鉴定方法对于检测试剂、体系构建的要求较高，尤其是对于两种对象的同时检测而言，很难实现，且容易产生假阳性高等问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和技术不足，提供一种能够同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的分子检测鉴定方法，特异性高、灵敏性好，无假阳性，首次实现了两种线虫的同时检测鉴定，具有重要的现实意义和应用价值。

本发明的目的是提供一种同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的引物组。

本发明另一目的是提供一种同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一组可同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的引物组，所述引物组包括上游引物PmF、上游引物PrF和下游引物PR，序列依次如SEQ ID NO.1～3所示。

该引物组的配合使用，能够从混合线虫样品中特异性的检测到较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫，实现两种线虫的同时检测；而且，灵敏性可达到1/100条线虫的检测灵敏度（可检测出1/100条较小拟毛刺线虫DNA，可检测出1/10条肾状拟毛刺线虫DNA）。

因此，上述可同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的引物组在检测较小拟毛刺线虫和/或肾状拟毛刺线虫方面的应用也在本发明的保护范围之内。

基于该引物组，本发明还提供了一种可同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的PCR方法，该PCR反应所用的引物组为上述引物组PmF、PrF和PR。

优选地，所述PCR的反应体系为：PCR反应缓冲液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物PmF、上游引物PrF和下游引物PR各0.5μL，模板DNA 2μL，ddH2O 补齐25μL。

优选地，所述PCR的反应程序为：98℃ 2min； 98℃ 10s， 50℃ 15s，68℃ 1.5min，40个循环；16℃保温。

另外，利用上述引物组构建的同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的试剂盒也在本发明的保护范围之内。所述试剂盒包含有上述引物组PmF、PrF和PR。

作为一种可实施方案，该试剂盒的反应体系和反应程序同上文所述。

另外，上述试剂盒在同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫方面的应用也在本发明的保护范围之内。

在实际应用工作中，利用本发明所设计的引物组及试剂盒在检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫时，大致工作流程如下：首先提取待测样品的DNA，再利用本发明设计的引物组及其PCR方法进行检测。对于待测样品DNA没有特殊的要求，按照本领域常规方法提取得到的样品DNA均可用于检测。

一直以来，由于植物病原线虫DNA序列的独特性，开发一种能够同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的分子检测方法会面临多重困难，例如，多对引物之间的相互抑制、不同引物扩增产物的相互抑制或者多对引物引起的非特异性扩增等等问题。为了实现较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的同时检测，且保证检测的特异性和灵敏性，本发明做了大量的研究和探索，综合考虑影响检测的各方面因素，最终得出了上述的引物组，并构建了PCR检测方法和试剂盒。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一组可同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的引物组，利用该引物组可以从混合线虫样品中特异性的检测出较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫，不仅能够实现较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的同时检测，有效克服了检测工作量大和检测成本高的缺点，而且对较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫有非常好的特异性，对实际应用工作，如检验检疫工作，有着重要的推进意义。

而且，利用该引物组从混合线虫样品中同时检测到较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的灵敏性可达到1/100条线虫的检测灵敏度（可检测出1/100条较小拟毛刺线虫DNA，可检测出1/10条肾状拟毛刺线虫DNA）。

附图说明

图1为同时检测两种线虫的PCR特异性检测结果。

图2为同时检测两种线虫的PCR灵敏度检测结果；第1-5泳道分别是较小拟毛刺模板稀释0倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍；第6-11泳道是肾状拟毛刺线虫模板稀释0倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍和阴性对照。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1 引物设计

1、经过大量的筛选和研究，得到了同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的引物组，引物如下：

针对较小拟毛刺线虫的特异上游引物PmF，在ITS2片段的672-693位置；针对肾状拟毛刺线虫的特异上游引物PrF，在ITS2片段的392-410位置；两者共用同一条下游引物PR。

SEQ ID NO.1（上游引物PmF）：5'-ATGACTCTGGCGGCAACTTACA-3'

SEQ ID NO.2（上游引物PrF）：5'-GCCTCCTCCTGACTGTGCG-3'

SEQ ID NO.3（下游引物PR）：5'- tttcactcgccgttactaagg -3'

2、经过初步的特异性验证，引物对PmF/PR可以特异性地扩增较小拟毛刺线虫的DNA；引物对PrF/PR可以特异性地扩增肾状拟毛刺线虫的DNA。

该引物组进一步的检测特异性和灵敏性检测结果如下文实施例所示。

实施例2 引物特异性检测

1、实验材料如表1

表1

2、抽提DNA

在200μL Eppendorf管中加入8μL预冷的PCR Buffer。在平玻片上滴20μL ddH2O，挑入一条线虫，用手术刀将线虫切成2至多段，然后迅速吸取含尽量多的这些线虫片段的悬浮液10μl，加入含有8μ L PCR Buffer液的Eppendorf管中，再向管中加入2μL预冷的1mg/mL蛋白酶K，使总体积为20μL。迅速将管放入-70℃冰箱至少10min，而后将Eppendorf管置于PCR仪中65℃恒温60min，以降解DNase，接着95℃恒温10min，以变性蛋白酶K，此时即可取此DNA悬浮液2μL直接做PCR或-20℃保存。

3、PCR检测的反应体系

特异检测较小拟毛刺线虫：PCR反应缓冲液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物PmF和下游引物PR各0.5μL，模板DNA 2μL，ddH2O 补齐，总体积25μL。

特异检测肾状拟毛刺线虫：PCR反应缓冲液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物PrF和下游引物PR各0.5μL，模板DNA 2μL，ddH2O 补齐，总体积25μL。

4、PCR的反应程序：

98℃ 2min； 98℃ 10s， 50℃ 15s，68℃ 1.5min，40个循环；16℃保温。

5、检测结果显示，引物对PmF/PR可以特异性地从多种毛刺线虫中特异性的检测出较小拟毛刺线虫；引物对PrF/PR可以特异性地从多种毛刺线虫中特异性的检测出肾状拟毛刺线虫。

实施例3 同时检测较小拟毛刺和肾状拟毛刺线虫

实验材料及其抽提DNA方法同实施例2。

1、检测体系

PCR反应缓冲液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物PmF、上游引物PrF和下游引物PR各0.5μL，模板DNA 2μL，ddH2O 补齐，总体积25μL。

2、反应程序

98℃ 2min； 98℃ 10s， 50℃ 15s，68℃ 1.5min，40个循环；16℃保温。

3、结果如图1所示

该引物组及检测体系方法能够从多种特异性地从多种毛刺线虫中检测并鉴定出较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫。

实施例4 同时检测的灵敏性

1、方法同实施例3，另外将较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫模板稀释0倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍作为检测模板。

2、检测结果如图2所示

该引物组及检测体系方法同时检测两种线虫时，可实现的灵敏度如下：可检测出1/100条较小拟毛刺线虫DNA，可检测出1/10条肾状拟毛刺线虫DNA。

实施例5 同时检测较小拟毛刺和肾状拟毛刺线虫的试剂盒

1、基于上述研究，本发明提供一种同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的试剂盒，包括如下组分：上游引物PmF、上游引物PrF和下游引物PR，序列依次如SEQ ID NO.1～3所示；以及PCR扩增所需的DNA 聚合酶、PCR反应缓冲液等试剂。

2、该试剂盒的使用方法如下：

以待测样品DNA为模板，利用引物PmF、PrF和PR进行PCR扩增；

所述PCR的反应体系为：PCR反应缓冲液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物PmF、上游引物PrF和下游引物PR各0.5μL，模板DNA 2μL，ddH2O 补齐25μL；

所述PCR的反应程序为：98℃ 2min； 98℃ 10s， 50℃ 15s，68℃ 1.5min，40个循环；16℃保温；

PCR扩增结束后，反应产物进行凝胶电泳，根据电泳结果判断样品中是否含有较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫（参考如图1和图2）。

序列表

<110> 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种同时检测较小拟毛刺线虫和肾状拟毛刺线虫的试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 上游引物PmF(forward primer PmF)

<400> 1

atgactctgg cggcaactta ca 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 上游引物PrF(forward primer PrF)

<400> 2

gcctcctcct gactgtgcg 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 下游引物PR(reverse primer PR)

<400> 3

tttcactcgc cgttactaag g 21