基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法与流程

本发明涉及种质鉴定方法，尤其是涉及一种基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法。

背景技术：

近年来，由于过度捕捞和环境污染，我国近海岸生态系统受到严重破坏，导致渔业资源逐渐枯竭。渔业资源增殖放流是指通过向渔业资源出现衰退的天然水域投放鱼、虾、蟹、贝等苗种，使其自然种群数量和资源总量得以恢复的一种有效方法(陈睿毅,楼宝,詹炜,等.人工增殖放流技术的探讨[J].河北渔业,2014(5):50-54)。增殖放流不仅有利于恢复渔业种群资源、保护濒危物种、改善水域生态环境，并且能够促进渔业增效、提高渔民的经济收入，同时也是我国社会主义生态文明建设的需要。

近年来，各级政府部门增加对渔业生物资源的投入，逐年扩大人工增殖放流范围的和放流物种种类、数量，已经取得了一定的经济效益(梁君.海洋渔业资源增殖放流效果的主要影响因素及对策研究[J].中国渔业经济,2013,31(5):122-134)。但许多增殖放流项目的效果并不显著，存在许多不规范的问题，比如放流苗种不纯正甚至掺假；放流操作不规范；放流苗种缺乏疾病检测等。所有这些环节都会影响到渔业增殖放流的效果，甚至影响野生种群的遗传多样性。其中放流苗种的来源是首要问题。目前，对虾的增殖放流一般规格为10mm(仔虾)，不同种对虾虾苗在形态上难以区分，不乏一些唯利是图的商人以假乱真，以次充好。目前还没有一种有效快捷的方法用于鉴定放流虾苗是否存在掺杂。

DNA条形码(DNA Barcoding)是指通过分析一段标准的DNA序列对物种进行鉴定(Waugh J.DNA barcoding in animal species:progress,potential and pitfalls.[J].Bioessays News&Reviews in Molecular Cellular&Developmental Biology,2007,29(2):188)。在动物种级水平的物种鉴定中，常用线粒体基因如细胞色素C氧化酶I基因(COI)和16S rRNA等。长毛明对虾(Fenneropenaeuspenicillatus)作为我国重要的海洋经济虾类，近年来受环境变化的影响，资源量急剧下降，在《中国物种红色名录》(2005版)中被列为濒危物种。福建省近十多年来一直开展增殖放流活动，其中对虾品种主要是长毛明对虾，增殖放流成效初显。保证长毛明对虾虾苗的纯正是科学有目的地进行增殖放流的前提，也是改善长毛明对虾野生资源所必需。利用DNA条形码技术可以准确、快速鉴定放流长毛明对虾虾苗中是否掺杂凡纳滨对虾。

技术实现要素：

本发明目的是提供可准确、高效地完成放流长毛明对虾虾苗快速鉴定的基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法。

本发明首先利用细胞色素C氧化酶I(COI)基因通用引物(F:GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，R:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)分别扩增10尾凡纳滨对虾和长毛明对虾，利用MEGA7.0比对获得的序列，同时利用DNAMAN(Version9.0)预测各种对虾代表序列的酶切位点。

所述基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法，包括以下步骤：

1)根据长毛明对虾(NC_026885.1)和凡纳滨对虾(NC_009626.1)线粒体基因组全序列，设计扩增细胞色素C氧化酶I(COI)基因片段的引物COIF和COIR；

2)提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA，利用引物COIF和COIR进行PCR反应；

3)将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并测序验证；

4)利用MEGA7.0比对获得的序列，同时利用DNAMAN(Version9.0)预测各种对虾代表序列的酶切位点；

5)取待放流的长毛明对虾F1代仔虾和亲虾，分别提取基因组DNA；

6)利用COIF和COIR，对DNA模板F1～F4，P1～P4，V1，V2，Y1，Y2，V1+Y1(1︰1)，V2+Y2(1︰1)进行PCR扩增，再将所述的PCR扩增产物进行酶切，酶切产物进行电泳鉴定。

在步骤1)中，所述引物可为：

COIF：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；

COIR：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。

在步骤2)中，所述提取长毛明对虾和凡纳滨对虾的基因组DNA，可提取10尾长毛明对虾和10尾凡纳滨对虾的基因组DNA；所述长毛明对虾为Y1～Y10，所述凡纳滨对虾为V1～V10；所述提取的长毛明对虾和凡纳滨对虾的DNA，可采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒DP324，天根产；所述PCR反应体系为：12.5μl2×EasyTaq PCR SuperMix(-dye)，1μl COIF，1μl COIR，1μl DNA，ddH2O补充至25μl。所述PCR反应程序为：①94℃3min；②40个循环：94℃1min，41℃1min15s，72℃1min30s；③72℃10min；

所述长毛明对虾的PCR扩增产物序列为：

所述凡纳滨对虾的PCR扩增产物序列为：

其中，A/AGCTT为酶切位点；所述酶切位点可使用HindIII内切酶；所述电泳可采用琼脂糖凝胶电泳；

长毛明对虾和凡纳滨对虾经PCR扩增的产物片段长度为663bp。凡纳滨对虾存在酶切位点AAGCTT，经酶切产生379bp和284bp酶切片段；在长毛明对虾中不存在该酶切位点，故仍存在663bp的条带，若长毛明对虾虾苗中掺杂凡纳滨对虾，则会出现663bp，379bp和284bp3条片段。

在步骤3)中，所述将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，可将步骤2)中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳1％检测。

在步骤5)中，所述取待放流的长毛明对虾F1代仔虾和亲虾，可取厦门翔安欣星海水产养殖专业合作社待放流的4口水泥池的长毛明对虾F1代仔虾和4尾亲虾；所述4口水泥池的长毛明对虾F1代仔虾为F1，F2，F3，F4；所述4尾亲虾为P1，P2，P3，P4。

本发明利用存在于凡纳滨对虾和长毛明对虾之间的单核苷酸突变位点AA(G/A)CT(T/C)，构建出能正确区分2种对虾的酶切图谱，从而建立了准确、快速地鉴定长毛明对虾虾苗中是否掺杂凡纳滨对虾的PCR-RFLP方法。

附图说明

图1是采样仔虾(F1-F4)和采样亲虾(P1-P4)，凡纳滨对虾(V1,V2)，长毛明对虾(Y1,Y2)，及其混合模板(V1+Y1)和(V2+Y2)PCR扩增COI序列后的电泳图谱。DNA Marker DL2000(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)。

图2是图1中相应的PCR产物HindIII酶切后的电泳图谱。

具体实施方式

以下实施例将结合附图进一步说明本发明。

1)根据已知的长毛明对虾线粒体基因组全序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_026885.1)和凡纳滨对虾线粒体基因组全序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_009626.1)，设计1对扩增细胞色素C氧化酶I(COI)基因片段的引物COIF和COIR如下：

COIF：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；

COIR：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’；

2)从厦门翔安欣星海水产养殖专业合作社(厦门，翔安区)待放流的4口水泥池中随机取长毛明对虾F1代仔虾(编号F1，F2，F3，F4)和4尾亲虾(编号P1，P2，P3，P4)，采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(DP324，天根)分别提取基因组DNA。提取的DNA经紫外分光光度仪测得浓度40～60ng/μL，OD260/OD280均在1.8～2.0。

3)以步骤2)所得的DNA作为模板，进行PCR反应。

反应体系为：12.5μl 2×EasyTaq PCR SuperMix(-dye)，1μl COIF，1μl COIR，1μl DNA，ddH2O补充至25μl。

PCR反应程序为：①94℃3min；②40个循环：94℃1min，41℃1min15s，72℃1min30s；③72℃10min。

PCR反应结束后将获得长毛明对虾和凡纳滨对虾的PCR扩增产物。

所述长毛明对虾的PCR扩增产物序列为：

所述凡纳滨对虾的PCR扩增产物序列为：

其中，A/AGCTT为酶切位点，在长毛明对虾相应的位置，其碱基序列为AAACTC，而HindIII内切酶的酶切位点是AAGCTT，所以HindIII只能对凡纳滨对虾扩增片段进行酶切。

4)根据Marker(3μl)的条带宽度与亮度，大致评估PCR产物的浓度。最终将PCR反应产物分别稀释10倍，进行快速酶切反应。

反应体系：1μl 10×M Buffer(Takara)，0.5μlHindIII(Takara)，7.5μl无菌水，1μl上述PCR产物。37℃水浴，酶切反应2h，之后加1.5μl 10×Loading Buffer终止反应。

取酶切产物9μl，用2％琼脂糖TBE凝胶电泳检测酶切产物，选择F1(PCR)作为对照。结果显示：V1和V2样品(凡纳滨对虾)，均被切成379bp和284bp两条带。Y1和Y2样品(长毛明对虾)，均只存在663bp条带，样品V1+Y1和V2+Y2均存在663bp，379bp和284bp三条带。待增殖放流仔虾F1-F4和亲本P1-P4均只存在663bp条带，说明长毛明对虾虾苗中未掺杂凡纳滨对虾个体，即待放流的长毛明对虾虾苗纯正，可用于本次增殖放流。

图1给出采样仔虾(F1-F4)和采样亲虾(P1-P4)，凡纳滨对虾(V1,V2)，长毛明对虾(Y1,Y2)，及其混合模板(V1+Y1)和(V2+Y2)PCR扩增COI序列后的电泳图谱。图1中相应的PCR产物HindIII酶切后的电泳图谱参见图2。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 基于DNA条形码的长毛明对虾和凡纳滨对虾的鉴定方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 663

<212> DNA

<213> 长毛明对虾(Fenneropenaeus penicillatus)

<400> 1

ggatctcctc ctcctgccgg gtcaaagaac gaagtattta gatttcggtc tgttagaagt 60

atcgtaatag ctcctgctaa aactggtagt gatagtaaaa gtagtagggc agtaataaat 120

accgctcaga cgaaaagagg tattcggtct atagttatcc ctgttgatcg tatattgata 180

acggtagtta taaaatttac agcacctaga attgaagaaa cccctgctaa gtgtaatgag 240

aaaattccta gatctacaga tgctcctgca tgggcgatgc tagcagataa gggagggtaa 300

acagttcacc ctgttcctac tcctctttca actatacctc tagaaagaag tagggttagc 360

gagggaggta aaagtcagaa actcatatta ttcattcggg ggaaagctat atcgggagca 420

cctaatatta agggaactag tcaatttcca aatcctccaa ttataatagg tattaccatg 480

aagaaaatta taacgaaagc gtgggctgta acaaccacat tataaatttg gtcatctcca 540

ataagacttc ctggttgacc taattcagca cgaataataa gtctaagggc agtccctact 600

atcccagctc aggctccgaa gataaagtat aaggttccaa tatctttatg atttgttgac 660

ccc 663

<210> 2

<211> 663

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 2

gggtctcctc ctcctgctgg gtcgaagaat gatgtgttaa gattacggtc tgttaaaagt 60

atagtaatag ctcctgctaa gactggtaat gataaaagta gtaataaagc agtgataaat 120

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attccagctc aagccccgaa gataaagtat aatgttccaa tatctttatg atttgttgac 660

caa 663

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26