本发明涉及一种聚合扬稻4号两个纹枯病抗性基因的方法，该方法可利用两个分子标记快速选育出在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上聚合了两个纹枯病抗性基因的抗纹枯病的水稻新株系。
背景技术：
水稻是关乎我国粮食安全的重要粮食作物。我国水稻育种界选育纹枯病抗病水稻的传统方法都是通过表型选择进行的，即用纹枯病致病菌在不同的水稻发育时期对水稻单株进行接种鉴定。由于传统的接种鉴定大部分是在田间种植条件下进行的，接种鉴定的结果误差大，准确性差，而且不同年份的接种结果存在差异，导致接种鉴定结果的准确率低。通过分子标记对水稻纹枯病抗性相关基因进行选择可以在水稻苗期即对纹枯病抗性进行选择，选择的准确率高，可以大大提高育种效率。水稻的纹枯病抗性是一个数量性状，受多个数量性状基因座位(QTL)控制。水稻科研界目前已经定位出许多与水稻纹枯病抗性相关的QTL，但是哪些QTL是共同调控水稻纹枯病抗性的？哪些QTL可以同时应用在一个育种过程中？我们对这些问题的了解并不多。根据目前已经报道的与水稻纹枯病抗性基因连锁的分子标记随意将两个不同的抗性基因聚合在一起，希望获得抗性加强的水稻材料这样一个美好的想法在实际操作过程中往往不可行，因为随意选出的两个抗性基因很有可能存在基因之间的上位性互作效应，导致聚合了2个抗性基因的材料的纹枯病抗性反而降低了。为了有效的提高育种效率，加快育种进程，本发明提出一种利用RM5813和D948两个分子标记快速选育聚合了qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A两个纹枯病抗性基因的水稻新株系的方法。本发明相比传统的利用纹枯病致病菌进行接种鉴定的表型选择方法更简便快速，无需进行传统的纹枯病菌接种鉴定，而且相比接种鉴定方法的准确度更高，因此大大提高了育种效率。
技术实现要素：
本发明包括以下步骤：
(1)将水稻品种Lemont作为母本与水稻品种扬稻4号作为父本进行杂交，并构建重组自交系分离群体Fn，所述Fn中的n≥5；
(2)用分子标记RM5813与D948分别PCR扩增步骤(1)获得的重组自交系分离群体内的不同株系的叶片DNA，根据RM5813标记与水稻第3染色体上的纹枯病抗性基因qSBRLEYD3A连锁的特点，根据D948标记与水稻第9染色体上的纹枯病抗性基因qSBRLEYD9A连锁的特点，将RM5813与D948标记的PCR扩增产物分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，选出RM5813标记扩增的带型与扬稻4号带型相同的株系，且D948标记扩增的带型与扬稻4号带型相同的株系，即是在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带两个纹枯病抗病等位基因的双抗纹枯病的稳定的水稻株系；选出RM5813标记扩增的带型与Lemont带型相同的株系，且D948标记扩增的带型与Lemont带型相同的株系，即是在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带两个纹枯病感病等位基因的双感纹枯病的稳定的水稻株系。
进一步地，所述步骤(2)中，RM5813标记扩增的带型与扬稻4号带型相同的株系，代表的是在qSBRLEYD3A基因座位上携带纹枯病抗病等位基因的株系；RM5813标记扩增的带型与Lemont带型相同的株系，代表的是在qSBRLEYD3A基因座位上携带纹枯病感病等位基因的株系；D948标记扩增的带型与扬稻4号带型相同的株系，代表的是在qSBRLEYD9A基因座位上携带纹枯病抗病等位基因的株系；D948标记扩增的带型与Lemont带型相同的株系，代表的是在qSBRLEYD9A基因座位上携带纹枯病感病等位基因的株系。
进一步地，所述步骤(2)中，在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带两个纹枯病抗病等位基因的双抗株系，其纹枯病抗性比在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带两个纹枯病感病等位基因的双感株系的纹枯病抗性要强，这一规律仅适用于对种植在同一个环境条件下的同一个Fn分离群体内的株系进行比较，Fn中的n为固定数值。
具体实施方式
实施例1：在水稻品种Lemont和水稻品种扬稻4号杂交组配的F6代分离群体中，RM5813和D948标记的应用。
1.将水稻品种Lemont作母本，与水稻品种扬稻4号作父本进行杂交并构建F6代分离群体(Lemont为来自美国的粳稻品种，扬稻4号为来自江苏的籼稻品种，Lemont和扬稻4号由中国水稻研究所国家水稻种质资源中期库提供)，这个包括219个株系在内的F6分离群体于2013年5月播种在杭州市富阳区中国水稻研究所试验场。
2.利用标记RM5813和D948分别对这个219个株系的重组自交系分离群体内的每一株系进行PCR检测。利用标记RM5813与基因qSBRLEYD3A连锁的特点，可检测出哪个株系在qSBRLEYD3A座位携带扬稻4号的抗病等位基因(用RM5813标记扩增扬稻4号的带型来追踪qSBRLEYD3A座位的扬稻4号抗病等位基因)；哪个株系在qSBRLEYD3A座位携带Lemont的感病等位基因(用RM5813标记扩增Lemont的带型来追踪qSBRLEYD3A座位的Lemont感病等位基因)。利用标记D948与基因qSBRLEYD9A连锁的特点，可检测出哪个株系在qSBRLEYD9A座位携带扬稻4号的抗病等位基因(用D948标记扩增扬稻4号的带型来追踪qSBRLEYD9A座位的扬稻4号抗病等位基因)；哪个株系在qSBRLEYD9A座位携带Lemont的感病等位基因(用D948标记扩增Lemont的带型来追踪qSBRLEYD9A座位的Lemont感病等位基因)。
3.选出RM5813标记扩增的带型与扬稻4号带型相同的株系，且D948标记扩增的带型与扬稻4号带型相同的株系，即是在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带两个纹枯病抗性等位基因的双抗纹枯病的水稻株系(表1)。
表1.在F6世代利用RM5813和D948标记进行选择得到的携带不同基因型的株系的平均病斑长度、平均病级，该F6群体于2013年5月播种于杭州
从表1可以看出，219个检测的株系中，在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带两个纹枯病抗性等位基因的株系数目是43个，携带两个纹枯病感病等位基因的株系数目是42个，携带两个抗病等位基因的株系的平均病斑长度为19.13，比携带两个感病等位基因的株系的平均病斑长度26.34更短；携带两个抗病等位基因的株系的平均病级为2.31，比携带两个感病等位基因的株系的平均病级3.33更小。表1的结果说明了利用RM5813和D948两个标记同时对qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上的两个纹枯病抗性等位基因进行选择的效果是有效的。
实施例2：在水稻品种Lemont和水稻品种扬稻4号杂交组配的F9代分离群体中，RM5813和D948标记的应用。
1.将水稻品种Lemont作母本，与水稻品种扬稻4号作父本进行杂交并构建F9代分离群体(Lemont为来自美国的粳稻品种，扬稻4号为来自江苏的籼稻品种，Lemont和扬稻4号由中国水稻研究所国家水稻种质资源中期库提供)，这个包括219个株系在内的F9分离群体于2015年5月播种在杭州市富阳区中国水稻研究所试验农场。
2.利用标记RM5813和D948分别对这个219个株系的重组自交系分离群体内的每一株系进行PCR检测。利用标记RM5813与基因qSBRLEYD3A连锁的特点，可检测出哪个株系在qSBRLEYD3A座位携带扬稻4号的抗病等位基因(用RM5813标记扩增扬稻4号的带型来追踪qSBRLEYD3A座位的扬稻4号抗病等位基因)；哪个株系在qSBRLEYD3A座位携带Lemont的感病等位基因(用RM5813标记扩增Lemont的带型来追踪qSBRLEYD3A座位的Lemont感病等位基因)。利用标记D948与基因qSBRLEYD9A连锁的特点，可检测出哪个株系在qSBRLEYD9A座位携带扬稻4号的抗病等位基因(用D948标记扩增扬稻4号的带型来追踪qSBRLEYD9A座位的扬稻4号抗病等位基因)；哪个株系在qSBRLEYD9A座位携带Lemont的感病等位基因(用D948标记扩增Lemont的带型来追踪qSBRLEYD9A座位的Lemont感病等位基因)。
3.选出RM5813标记扩增的带型与扬稻4号带型相同的株系，且D948标记扩增的带型与扬稻4号带型相同的株系，即是在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带两个纹枯病抗性等位基因的双抗纹枯病的水稻株系(表2)。
表2.在F9世代利用RM5813和D948标记进行选择得到的携带不同等位基因的株系的平均病斑长度、平均病级，该F9群体于2015年5月播种于杭州
从表2可以看出，219个检测的株系中，在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带两个纹枯病抗性等位基因的株系数目是53个，携带两个纹枯病感病等位基因的株系数目是51个，携带两个抗病等位基因的株系的平均病斑长度为18.20，比携带两个感病等位基因的株系的平均病斑长度24.56更短；携带两个抗病等位基因的株系的平均病级为2.43，比携带两个感病等位基因的株系的平均病级3.23更小。表2的结果说明了利用RM5813和D948两个标记同时对qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上的两个纹枯病抗性等位基因进行选择的效果是有效的。
实施例3：在水稻品种Lemont和水稻品种扬稻4号杂交组配的F11代分离群体中，RM5813和D948标记的应用。
1.将水稻品种Lemont作母本，与水稻品种扬稻4号作父本进行杂交并构建F11代分离群体(Lemont为来自美国的粳稻品种，扬稻4号为来自江苏的籼稻品种，Lemont和扬稻4号由中国水稻研究所国家水稻种质资源中期库提供)，这个包括219个株系在内的F11分离群体于2016年5月播种在杭州市富阳区中国水稻研究所试验农场。
2.利用标记RM5813和D948分别对这个219个株系的重组自交系分离群体内的每一株系进行PCR检测。利用标记RM5813与基因qSBRLEYD3A连锁的特点，可检测出哪个株系在qSBRLEYD3A座位携带扬稻4号的抗病等位基因(用RM5813标记扩增扬稻4号的带型来追踪qSBRLEYD3A座位的扬稻4号抗病等位基因)；哪个株系在qSBRLEYD3A座位携带Lemont的感病等位基因(用RM5813标记扩增Lemont的带型来追踪qSBRLEYD3A座位的Lemont感病等位基因)。利用标记D948与基因qSBRLEYD9A连锁的特点，可检测出哪个株系在qSBRLEYD9A座位携带扬稻4号的抗病等位基因(用D948标记扩增扬稻4号的带型来追踪qSBRLEYD9A座位的扬稻4号抗病等位基因)；哪个株系在qSBRLEYD9A座位携带Lemont的感病等位基因(用D948标记扩增Lemont的带型来追踪qSBRLEYD9A座位的Lemont感病等位基因)。
3.选出RM5813标记扩增的带型与扬稻4号带型相同的株系，且D948标记扩增的带型与扬稻4号带型相同的株系，即是在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带两个纹枯病抗性等位基因的双抗纹枯病的水稻株系(表3)。
表3.在F11世代利用RM5813和D948标记进行选择得到的携带不同等位基因的株系的平均病斑长度、平均病级，该F11群体于2016年5月播种于杭州
从表3可以看出，219个检测的株系中，在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带两个纹枯病抗性等位基因的株系数目是53个，携带两个纹枯病感病等位基因的株系数目是50个，携带两个抗病等位基因的株系的平均病斑长度为23.47，比携带两个感病等位基因的株系的平均病斑长度33.97更短；携带两个抗病等位基因的株系的平均病级为2.17，比携带两个感病等位基因的株系的平均病级3.53更小。表3的结果说明了利用RM5813和D948两个标记同时对qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上的两个纹枯病抗性等位基因进行选择的效果是有效的。
实施例4：在水稻品种Lemont和水稻品种扬稻4号杂交组配的F13代分离群体中，RM5813和D948标记的应用。
1.将水稻品种Lemont作母本，与水稻品种扬稻4号作父本进行杂交并构建F13代分离群体(Lemont为来自美国的粳稻品种，扬稻4号为来自江苏的籼稻品种，Lemont和扬稻4号由中国水稻研究所国家水稻种质资源中期库提供)，这个包括219个株系在内的F13分离群体于2017年5月播种在杭州市富阳区中国水稻研究所试验农场。
2.利用标记RM5813和D948分别对这个219个株系的重组自交系分离群体内的每一株系进行PCR检测。利用标记RM5813与基因qSBRLEYD3A连锁的特点，可检测出哪个株系在qSBRLEYD3A座位携带扬稻4号的抗病等位基因(用RM5813标记扩增扬稻4号的带型来追踪qSBRLEYD3A座位的扬稻4号抗病等位基因)；哪个株系在qSBRLEYD3A座位携带Lemont的感病等位基因(用RM5813标记扩增Lemont的带型来追踪qSBRLEYD3A座位的Lemont感病等位基因)。利用标记D948与基因qSBRLEYD9A连锁的特点，可检测出哪个株系在qSBRLEYD9A座位携带扬稻4号的抗病等位基因(用D948标记扩增扬稻4号的带型来追踪qSBRLEYD9A座位的扬稻4号抗病等位基因)；哪个株系在qSBRLEYD9A座位携带Lemont的感病等位基因(用D948标记扩增Lemont的带型来追踪qSBRLEYD9A座位的Lemont感病等位基因)。
3.选出RM5813标记扩增的带型与扬稻4号带型相同的株系，且D948标记扩增的带型与扬稻4号带型相同的株系，即是在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带两个纹枯病抗性等位基因的双抗纹枯病的水稻株系(表4)。
表4.在F13世代利用RM5813和D948标记进行选择得到的携带不同等位基因的株系的平均病斑长度、平均病级，该F13群体于2017年5月播种于杭州
从表4可以看出，219个检测的株系中，在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带两个纹枯病抗性等位基因的株系数目是53个，携带两个纹枯病感病等位基因的株系数目是51个，携带两个抗病等位基因的株系的平均病斑长度为46.32，比携带两个感病等位基因的株系的平均病斑长度50.62更短；携带两个抗病等位基因的株系的平均病级为4.69，比携带两个感病等位基因的株系的平均病级5.38更小。表4的结果说明了利用RM5813和D948两个标记同时对qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上的两个纹枯病抗性等位基因进行选择的效果是有效的。
从以上4个实施例子可以看出，利用RM5813和D948两个分子标记在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上选择携带两个抗性等位基因(均来自扬稻4号)的株系的平均病斑长度和平均病级均比携带两个感病等位基因(均来自Lemont)的株系小，RM5813和D948标记有效实现了同时选择两个抗性基因的目的。需要指出的是，上述例子所述的在qSBRLEYD3A与qSBRLEYD9A基因座位上携带双抗等位基因的株系的抗性比携带双感等位基因的株系要强，这一规律仅仅适用于种植在同一年份的同一个Fn群体内，例如将F11群体内的株系与F9群体内的株系进行比较是没有意义的，因为不同年份的环境效应是不同的.
在实际应用过程中，无需对重组自交系分离群体的株系进行田间接种鉴定，只需要利用RM5813和D948标记进行检测就行了，而上述实施例1至例4的接种鉴定结果只是为了证明RM5813和D948标记确实是有效的，实际操作过程中不需要接种鉴定。以上4个实施例子纹枯病田间接种鉴定方法采用带菌牙签接种方法，该接种方法见Zou等，Mapping quantitative trait loci controlling sheath blight resistance in two rice cultivars(Oryza sativa L.)，Thero.Appl.Genet.，2000年101卷，569-573。接种采用的纹枯病致病菌编号为ZJ03，由中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室提供。每个重组自交系分离群体内的株系接种3个单株，每个单株接种2个分蘖，在始穗期接种，接种后30天调查发病情况。平均病斑长度是每个接种的株系内6个分蘖的平均病斑长度，平均病级是每个接种株系内3个单株的平均值。病级评分的方法采用国际上通用的0-9级评分方法，0级代表植株不发病，9级代表植株发病死亡。
以上4个实施例子PCR扩增所用到的叶片DNA的提取方法采用通用的CTAB方法；RM5813分子标记的PCR扩增程序为94℃5分钟，35个循环的94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟，及最后的72℃7分钟；D948分子标记的PCR扩增程序为94℃5分钟，35个循环的94℃30秒、50℃30秒、72℃1分钟，及最后的72℃7分钟。PCR扩增产物采用通用的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法和硝酸银染色法进行检测。D948标记序列见Zeng等，Development of 1047 insertion-deletion markers for rice genetic studies and breeding，Genet.Mol.Res.2013年12卷第4期，5226-5235。RM5813的标记序列见Gramene网站(www.gramene.org)。由于上述方法都是通用的常规实验方法，因此在这里不再赘述。
最后，需要指出的是，本发明不仅仅限于以上的实施例子，本领域技术人员从本发明公开内容直接推导或联想到的所有变通情况，均认为是本发明的保护范围。例如，本方法不仅仅局限于应用在Lemont和扬稻4号组配的Fn(n≥2)分离群体，也可应用于Lemont和扬稻4号组配的BCkFm(k≥1，m≥1)群体、双单倍体DH群体及用Lemont和扬稻4号组配的其他分离群体等。