本发明涉及分子生物学和疾病诊断试剂制备领域。具体的，本发明涉及上皮性卵巢癌的mirna和mrna组群的生物标记物和其用于研究上皮性卵巢癌的方法，以及所述标记物在制备用于诊断或检测上皮性卵巢癌的试剂盒的应用。
背景技术：
上皮性卵巢癌(eoc)是女性最常见的妇科恶性肿瘤，占卵巢恶性肿瘤的近90％[1，2]。诊断时，大多数患者(75％)出现疾病的晚期，几乎所有的人都经历了肿瘤复发[3，4]。
卵巢癌病例中约10％是由于家族性/遗传倾向，主要是由于在brca1和brca2中的错配修复基因的突变，但其遗传机制仍需进一步研究。几个全基因组关联研究(gwas)已在卵巢癌中进行，已经发现了一些风险因子，如9p22.2上的rs3814113，2q31上的rs2072590对，3q25上的rs2665390，在8q24上的rs10088218，rs1516982，rs10098821，和在19p13上的rs2363956[6,7]。然而，这些风险变量的功能意义在很大程度上是未知的。
微小rna是通过与信使rna(mrna)靶杂交并引发对它的翻译抑制或较不常见地引起其降解来控制基因表达的一类小的非编码rna。mirna的发现和研究已揭示在生物发育和各种细胞过程例如细胞分化、细胞生长和细胞死亡中发挥重要作用的mirna介导的基因调控机制。近年来的研究表明，特定mirna的异常表达可参与人的疾病，例如神经障碍和癌症。microrna(mirna)的表达变化影响mirna靶基因的表达，进而导致表型的差异，包括癌症的易感性[7]。对患者的mirna和基因表达差异的分析的整合可以提高卵巢癌的风险等位基因的功能意义的理解，以及创新的分析方法来识别这些mirna中代替传统的标准方差和回归分析中的应用将有可能提高分析的准确性。
本领域已有发现hsa-mir-34b(mir-34b)是具有p53依赖性调节功能的肿瘤抑制因子[24,25]。以前的报道显示p53介导的mir-34b的上调和ing2的下调通过人成纤维细胞中的p53激活介导了由nutlin-3a诱导的细胞衰老(senescence)[25]。此外，mir-34b/34c的簇(cluster)是tp53的直接的转录靶因子，其在上皮癌起始中发生突变[26]。在卵巢癌中，mir-34b在lynch综合征相关肿瘤中经常失活。与在偶发性细胞肿瘤中的情况相反，lynch综合征相关肿瘤中缺乏异常p53，这支持mir-34b失活和异常p53表达在癌变中的作用[27]。
本领域已有发现hsa-mir-335(mir-335)是卵巢癌中具有影响的mirna[7]。在卵巢癌病人中，缺乏mir-335的表达诱导bcl-w的异常积累和随后的失控的细胞浸润[35]。此外，mir-335与eoc患者的预后相关[36]。
另外，本领域已有发现hsa-mir-136(mir-136)也可能是卵巢癌中具有影响的mirna。mir-136靶向tgf-b/smad信号的引发的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition)的启动子smad2和smad3，并抑制肺腺癌细胞转移相关性状[38]。在人非小细胞肺癌(nsclc)细胞中发现mir-136的上调，其通过靶向ppp2r2a促进erk1/2激活[39]。mir-136也可能靶向肿瘤抑制基因pten并抑制乳腺癌中的pten翻译[40]。
本领域已经采用分子生物学的方法来诊断或检测各种如癌症等各种疾病，包括采用分析基因表达的高通量芯片或用于较少量分子目标的pcr或非pcr方法的试剂盒，例如taqman探针法试剂盒等。然而，上皮性卵巢癌相关特异性mirna表达谱的筛选、检测方法及检测程序还存在很多需要解决的问题。因此本领域还需要一种更快速和有效的诊断或检测上皮性卵巢癌的方法和试剂盒或芯片。
技术实现要素：
本发明研究和发现了mirna，特别是hsa-mir-34b、hsa-mir-335、hsa-mir-136在上皮性卵巢癌的分子调控途径中的作用，以及这些mirna在生化调控过程的上下游影响因子和作用关系。由此，本发明提供了一种用于研究上皮性卵巢癌的更快速和有效的方法。具体的，本发明提供了一种mirna的组合在研究或诊断上皮性卵巢癌中的用途，在所述研究或诊断中还可包括mrna的组合。本发明还提供了所述mirna的组合和mrna的组合用于制备研究或诊断上皮性卵巢癌中的试剂盒或装置的用途。本发明还提供了用于研究或诊断上皮性卵巢癌中的试剂盒或装置，例如用于在外周血淋巴细胞样品中研究或诊断上皮性卵巢癌的基因芯片。
具体的，本发明提供了下述mirna的组合用于研究或诊断上皮性卵巢癌的方法，所述mirna组合为hsa-mir-34b、hsa-mir-335、hsa-mir-136、hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b。
在本发明的其中又一个方面，前述研究或诊断上皮性卵巢癌的方法中还包括下述基因的mrna的组合：taok1、mgea5、zbed5、mmp3、dnaja1、klhl28、pdcd7、lsm12、slc9a6、atg7、c1orf63。
在本发明的其中又一个方面，在前述研究或诊断上皮性卵巢癌的方法中，所述mirna分为以下两组：
组(a)：hsa-mir-34b、hsa-mir-335和hsa-mir-136；和
组(b)：hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b。
在本发明的研究或诊断上皮性卵巢癌的方法中，先在待测样品中检查作为核心mirna的组(a)的mirna，即hsa-mir-34b、hsa-mir-335和hsa-mir-136，然后再在待测样品中检查组(b)的mirna，包括hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b。
在本发明其中又一个方面，还包括在待测样品中检测下述基因的mrna的表达：taok1、mgea5、zbed5、mmp3、dnaja1、klhl28、pdcd7、lsm12、slc9a6、atg7、c1orf63。
在本发明的研究或诊断上皮性卵巢癌的方法中，先检查作为核心mirna的组(a)的mirna，即hsa-mir-34b、hsa-mir-335和hsa-mir-136的表达，然后再检查组(b)的mirna，包括hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b的表达。在本发明的方法中，如果发现组(a)的mirna的表达不符合预定的检测结果，例如hsa-mir-335的表达上升以及hsa-mir-34b和hsa-mir-136的表达下降，可以选择不继续接下来的步骤(2)，即检查组(b)的mirna的表达。由此可以增加检测的效率。
在本发明的研究或诊断上皮性卵巢癌的方法中，除了在待测样品中检测组(a)和组(b)的mirna的表达，还可包括：
(3)在待测样品中检测下述基因的mrna的表达：taok1、mgea5、zbed5、mmp3、dnaja1、klhl28、pdcd7、lsm12、slc9a6、atg7、c1orf63。
类似的，如果发现组(a)和/或组(b)的mirna的表达不符合预定的检测结果(例如预定的检测结果为hsa-mir-335的表达上升以及hsa-mir-34b、hsa-mir-136、hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b的表达下降)，可以选择不继续接下来的步骤(3)，即检查下述基因的mrna的表达：taok1、mgea5、zbed5、mmp3、dnaja1、klhl28、pdcd7、lsm12、slc9a6、atg7、c1orf63。由此可以增加检测的效率。
在本发明的其中一个方面，所述待测样品为外周血淋巴细胞。
本发明还提供了用于本发明前述研究或诊断上皮性卵巢癌的方法的试剂盒或装置。本发明的所述试剂盒或装置中包括用于检测mirna和mrna的试剂。其中所述mirna为hsa-mir-34b、hsa-mir-335、hsa-mir-136、hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b的组合。其中所述mrna为taok1、mgea5、zbed5、mmp3、dnaja1、klhl28、pdcd7、lsm12、slc9a6、atg7、c1orf63的mrna的组合。在本发明的其中一个方面，其中所述mirna分为以下两组：
组(a)：hsa-mir-34b、hsa-mir-335和hsa-mir-136；
组(b)：hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b。
在本发明的其中一个方面，所述试剂盒或装置被制备成可实施研究或诊断上皮性卵巢癌的方法，其中包括以下步骤：
(1)在待测样品中检测组(a)的mirna的表达；
(2)在待测样品中检测组(b)的mirna的表达。
(3)在待测样品中检测下述mrna的表达：taok1、mgea5、zbed5、mmp3、dnaja1、klhl28、pdcd7、lsm12、slc9a6、atg7、c1orf63。
本发明还提供了mirna的组合在用于制备研究或诊断上皮性卵巢癌中的试剂盒或装置的用途，所述mirna组合为hsa-mir-34b、hsa-mir-335、hsa-mir-136、hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b。在本发明的其中一个方面，在所述研究或诊断中还包括下述基因的mrna的组合：taok1、mgea5、zbed5、mmp3、dnaja1、klhl28、pdcd7、lsm12、slc9a6、atg7、c1orf63。在本发明的其中又一个方面，所述mirna分为以下两组：组(a)：hsa-mir-34b、hsa-mir-335和hsa-mir-136；组(b)：hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b。
在本文中，术语“微小rna”、“microrna”、“mir基因产物”、“mir”和“mirna”互换使用，是指来自mir基因的未加工的或加工过的rna转录物。由于mir基因产物不翻译成蛋白，术语“mir基因产物”不包括蛋白。未加工的mir基因转录物也称作“mir前体”，通常包含长度为约70-100个核苷酸的rna转录物。mir前体可以消化加工成有活性的19-25个核苷酸的rna分子。该有活性的19-25个核苷酸的rna分子也称作“加工过的mir基因转录物”或“成熟的mirna”。本发明的mirna主要是指哺乳动物的mirna，特别是指人的mirna。
本发明的mirna主要是指人的mirna。例如，在本文中，“mir-141”也代表“hsa-mir-141”。在本发明中涉及的mirna包括其mirna家族，其家族成员和序列在例如http://www.mirbase.org/等网站公开，其由对应的accessionnumber确定。
本发明涉及的mirna包括：
hsa-mir-34b(mi0000742)、hsa-mir-335(mi0000816)、hsa-mir-136(mi0000475)、hsa-let-7e(mi0000066)、hsa-mir-1297(mi0006358)、hsa-mir-374b(mi0005566)和hsa-mir-891b(mi0005534)。
本发明的基因主要是指人的基因。在本文中，蛋白符号不用斜体，并全部大写；基因符号使用斜体。例如tao激酶1写为taok1，编码该蛋白的基因写为taok1。但有时在本文中基因符号也不使用斜体。例如有时本文中“taok1”也表示编码该蛋白的基因taok1。基因的定义和序列在例如https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/等网站公开，其由对应的geneid确定。在本发明中，基因的mrna是指从该基因转录的mrna。获得和检查基因的mrna的方法或试剂盒是本领域公知和常用的。
本发明涉及的基因包括：
taok1(geneid57551)、mgea5(geneid10724)、zbed5(geneid58486)、mmp3(geneid4314)、dnaja1(geneid3301)、klhl28(geneid66689)、pdcd7(geneid10081)、lsm12(geneid124801)、slc9a6(geneid10479)、atg7(geneid74244)、c1orf63(geneid57035)。
在本发明中，可以使用适用于检测生物样品中的rna表达水平的任意技术，来测量样品中基因产物，包括mir基因产物的水平。用于测定生物样品(例如，细胞，组织)中rna表达水平的合适技术(例如，rna印迹分析，rt-pcr，原位杂交)是本领域技术人员已知的。
在本发明中，对基因，包括mirna基因的表达水平的测量可以通过检测转录的多核苷酸或其部分的存在来进行，其中转录的多核苷酸包含该基因或该mirna的编码区。
附图说明
图1为本发明的上皮性卵巢癌的micrornas与mrnas生物标记物的调控途径关系网络图。圆圈为micrornas。三角形为mrnas。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例1病人和样品
受试者来自74个具有家族上皮卵巢癌的病人和47个非上皮卵巢癌病人(对照)。从受试者的外周血的淋巴细胞中获得mirna和mrna。这74个具有家族上皮卵巢癌的病人之间没有家族关系。在这些病人的家族中，至少两个一级或二级亲人在其某一年龄阶段被检测出患有遗传学卵巢癌。这些病人都不具有brca1/2或mlh1/msh2突变。
实施例2本发明研究的上皮卵巢癌相关micrornas与mrnas的靶基因关系和作用途径分析
采用如表1所示的算法，即miranda(microrna.org),microcode(http://www.mircode.org/mircode/),mirtarget2[21],targetscan(http://www.targetscan.org/)，对本发明的方法涉及的micrornas，尤其是核心micrornas(hsa-mir-34b、hsa-mir-335、hsa-mir-136)的影响因子(microrna和mrna)和作用关系进行分析。
结果如表1所示，在上皮卵巢癌病人的样品中，发现16个相互作用的microrna和mrna对；涉及的microrna包括：hsa-mir-34b、hsa-mir-335、hsa-mir-136、hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b；涉及的基因包括taok1、mgea5、zbed5、mmp3、dnaja1、klhl28、pdcd7、lsm12、slc9a6、atg7、c1orf63。在上皮卵巢癌病人的样品中，涉及的microrna和mrna与对照组比较，其表达出现明显差异。
表1
同时，利用cytoscape(v2.8.3,http://www.cytoscape.org/)对本发明提供的micrornas与mrnas的相互调控作用关系构建调控途径关系网络图。用于作图的基因-基因相互作用信息(gene-geneinteractioninformation)是从biomolecularinteractionnetworkdatabases(binds)得到的。结果如图1所示。
图1所示的结果与表1一致。hsa-mir-34b是这个作用网络的轴心因子之一。hsa-mir-34b表达下降，而其靶基因slc9a6,taok1,atg7,和mgea5的表达上升。hsa-mir-34b的表达量通过其目标基因taok1andmgea5的作用而与hsa-mir-1297,hsa-mir-374b,hsa-mir-891b,andhsa-let-7e的表达量相关。hsa-mir-374b的目标基因c11orf48的表达也上升。
hsa-mir-136是这个作用网络的另一个轴心因子之一。hsa-mir-136的表达下降，而其目标基因zbed5和mmp3的表达都上升。
hsa-mir-335是这个作用网络的另一个轴心因子之一。hsa-mir-335的表达上升，而其目标基因dnaja1,pdcd7,klhl28和lsm12的表达下降。
taok1是mir-34b最重要的靶基因。taok1是mark的上游激活剂，mark磷酸化微管相关蛋白，导致其从微管分离并导致在细胞间期的微管拆解[28]。taok1作为tao激酶的成员，通过调节纺锤体检测点信号来保护人类细胞的基因组稳定性[30-32]。另一个重要的靶基因是atg7，先前报道与卵巢癌有关。人卵巢癌caov-3细胞中atg7或becn1的沉默显着抑制单pt诱导的细胞死亡[33]。此外，as2o3在卵巢癌细胞中诱导不依赖beclin-1的自体吞噬途径；atg7的sirna靶向与atg5和hvps34一起显着降低as2o3诱导的自体吞噬[34]。
dnaja1是mir-335的靶基因。证据表明，hdj2(也称为dnaja1)，在人卵巢癌中增强了法尼基转移酶(farnesyltransferase)抑制剂lonafarnib和紫杉醇诱导的生长抑制作用[37]。
mmp3是本研究中揭示的mir-136的靶基因之一。mmp3与mmp2起着关键作用，作为e2诱导的eoc迁移/浸润中tc0101441活性的下游介质[41]。也已知mmp3可增加化疗对卵巢癌的敏感性[42，43]。
实施例3基因芯片分析mirna表达和mrna表达
采用通过illumina表达检测芯片(illuminahumanv2micrornaexpressionbeadchip)获得的mirna表达数据(数据编号gse31801，在美国国家生物技术信息中心(nationalcenterofbiotechnologyinformation，ncbi)网站的基因表达综合数据库(geneexpressionomnibus,geo)中公开：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/queryacc.cgi？acc＝gse31801)进行分析。该芯片的mirna板块包括1146个人类mirna(>97％mirbaserelease12公开的mirna)对前述受试者的mirna的表达进行分析。将芯片的mirna分析区域分为3个区域。其中第一区域检测的包括hsa-mir-34b、hsa-mir-335、hsa-mir-136；第二区域包括hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b；第三区域包括其余mirna。
另外采用通过illumina表达检测芯片(lluminahumanht-12v3.0expressionbeadchip)获得的mrna表达数据(数据编号gse37582：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝gse37582)对前述受试者的mrna表达进行分析。将该芯片的mrna板块的分析区域分为2个区域。其中第一区域检测的包括taok1、mgea5、zbed5、mmp3、dnaja1、klhl28、pdcd7、lsm12、slc9a6、atg7、c1orf63的mrna；第二区域包括其余mrna。
实施例4本发明研究的上皮卵巢癌相关mirna和mrna表达的上调和下调趋势分析
一.通过偏最小二乘法(partialleastsquares，pls)对实施例2的样品的mirna表达和mrna表达数据进行分析
采用pls分析方法[11]分析出现表达差异的基因[15-19]。
本发明的研究中，pls分析方法步骤包括：
1.采用nipals算法【18】求解下述多元回归模型：
计算步骤：
(1)随机初始化(randomlyinitialize)u0＝y
(2)w＝xtu0,w＝w/||w||
(3)t＝xw
(4)c＝ytt,c＝c/||c||
(5)u＝yc
(6)假如u-u0<10-8,则进行步骤(7)；
否则u0＝u,重复步骤(2)–(5)。
(7)x＝x-tttx,y＝y-ttty。返回步骤(2)，计算下一潜变量(latentvariable)此处，y为疾病分类变量矩阵，x为表达矩阵(nxp),n为样本数目，p为mrna及microrna变量总数。
2.差异表达基因的鉴定
差异表达基因的鉴定，计算每个mrna、microrna的变量投影。变量投影重要性(variableimportanceontheprojection，vip)，定义参见gosselinetal.,2010[20]。
采用置换检验，分别计算每个mrna和microrna的显著水平：
当计算mrna显著水平时，p＝芯片检测的mrna总数；当计算microrna显著水平时，p＝芯片检测的microrna总数，h为引入的潜变量数目(即将原始p维数据降维至h)。
采用排列程序(permutationprocedure)(进行1000次)来降低假发现率(falsediscoveryrate，fdr)。具有vip的fdr低于0.05(p<0.05)的表达才为具有表达差异。
二.采用montecarlo分析方法进一步分析mirna表达和mrna表达数据
采用montecarlo分析方法[12，13]进一步分析差异表达的mirna和mrna。
本发明中montecarlo分析方法及步骤包括：
根据前述步骤2的计算模型，以差异表达的micrornas和mrnas作为自变量，建立多元回归预测模型。计算回归系数θ包括(模型中的α与β)，自变量的选择直接依赖于回归系数的稳定性统计量sj:
sj＝mean(θj)/std(θj)
其中θ是线性模型中的回归系数。通过montecarlo抽样，计算第j个变量的各子模型回归系数的均值和标准差。基于交叉验证的最高准确性，确定回归系数可靠性的阈值。具有绝对可靠性大于阈值和vip的fdr小于0.05的mirna/mrna为具有差异表达的mirna/基因组。
三结果
1.根据pls分析的本发明研究的上皮卵巢癌相关mirna表达的上调和下调趋势。结果如表2所示。
表2
如表2的结果所示，hsa-mir-34b、hsa-mir-335、hsa-mir-136、hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b在卵巢癌病人中，相对对照组都有明显的表达差异(withfdrofvip，p<0.05)。其中，hsa-mir-335的表达上升，hsa-mir-34b、hsa-mir-136、hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b的表达下降。
2.根据pls分析的本发明研究的上皮卵巢癌相关mrna表达的上调和下调趋势。结果如表3所示。
表3
如表3的结果所示，taok1、mgea5、zbed5、mmp3、dnaja1、klhl28、pdcd7、lsm12、slc9a6、atg7、c1orf63在卵巢癌病人中，相对对照组都有明显的表达差异(withfdrofvip，p<0.05)。其中，slc9a6，c1orf63，taok1,atg7,和mgea5，以及zbed5和mmp3的表达上升，dnaja1,pdcd7,klhl28和lsm12的表达下降。
结果与实施例2的基因关系一致。
3.根据montecarlo分析的本发明研究的上皮卵巢癌相关mrna表达的上调和下调趋势。结果如表4所示。
表4
如表4的结果所示，hsa-mir-34b、hsa-mir-335、hsa-mir-136、hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b在卵巢癌病人中，相对对照组都有明显的表达差异。其中，hsa-mir-335的表达上升，hsa-mir-34b、hsa-mir-136、hsa-let-7e、hsa-mir-1297、hsa-mir-374b和hsa-mir-891b的表达下降。
4.根据montecarlo分析的本发明研究的上皮卵巢癌相关mrna表达的上调和下调趋势。结果如表5所示。
表5
如表5的结果所示，taok1、mgea5、zbed5、mmp3、dnaja1、klhl28、pdcd7、lsm12、slc9a6、atg7、c1orf63在卵巢癌病人中，相对对照组都有明显的表达差异。其中，slc9a6，c1orf63，taok1,atg7,和mgea5，以及zbed5和mmp3的表达上升，dnaja1,pdcd7,klhl28和lsm12的表达下降。
结果与实施例2以及pls分析观察到的基因作用关系一致。
本申请的发明人第一次研究和提出了新的上皮性卵巢癌的分子调控途径网络，并且发现了由mirna，特别是hsa-mir-34b、hsa-mir-335、hsa-mir-136作为这个分子调控途径网络中的轴心(pivot)作用。本发明还首次发现了与这些mirna相关的16个mirna和mrna对和它们的调控关系。本发明由此提供了用于研究和检测上皮性卵巢癌，特别是在外周血淋巴细胞样品中检测上皮性卵巢癌的分子标记物。本发明提供的研究和检测上皮性卵巢癌的方法具有高特异性，以及能够更快进行和获得检测结果的优点。
上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。
如无特别表示，本文中出现的温度的单位“度”是指摄氏度，即℃。
以下文献以全文引入的方式在本申请进行公开。
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