一种结直肠癌生物标志物及其应用的制作方法

本发明涉及涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种结直肠癌生物标志物及其对结直肠癌诊断和抑制结直肠癌肿瘤血管新生中的应用。

背景技术：

结直肠癌(colorectalcancer，crc)是人类常见的消化系统恶性肿瘤，发病率居恶性肿瘤的第3位，起病隐匿，预后较差川。近年研究发现，micrornas(mirnas)是一类独特的非编码小rna，在肿瘤细胞中高表达或低表达起到癌基因或抑癌基因的作用，使细胞增殖和分化失去控制，导致肿瘤的发生发展。研究证实，mir-92a在结直肠癌等多种肿瘤组织中异常高表达，并与结肠癌的淋巴结转移和预后相关，因此，mir-92a被认为是一种癌基因，可能在crc发生发展中起着关键调控作用。具有非可控的血管新生能力是恶性肿瘤的基本生物学特征之一，肿瘤的生长、侵袭和转移均与血管新生密切相关。研究发现，mir-92a与血管内皮细胞形成、肿瘤血管新生有关。然而，目前有关mir-92a对结直肠癌血管新生功能的影响及其调控机制尚不清楚。

本发明通过检测mir-92a在结直肠癌组织中的表达水平，分析其与肿瘤血管新生的相关性；通过转染mir-92a-mimic、inhibitor上调或抑制结直肠癌细胞hct116、sw620中mir-92a的表达水平，观察mir-92a对huvec血管内皮细胞新生功能的影响及对其下游潜在靶点pten表达的调控作用，探讨mir-92a影响结直肠癌血管新生的作用及机制，为结直肠癌的分子靶向治疗提供实验依据。

技术实现要素：

鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种结直肠癌生物标志物及其对结直肠癌诊断和抑制结直肠癌肿瘤血管新生中的应用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种结直肠癌生物标志物，所述生物标志物为mir-92a。

本发明采用qrt-pcr方法检测了广东医学院附属深圳南山医院2014年6月至2015年12月经手术切除的25例结直肠癌组织和对应癌旁组织及4种结直肠癌细胞(hct116、sw620、sw480、ht29)中mir-92a的表达；免疫组织化学法检测结直肠癌和癌旁组织中cd31阳性表达的微血管密度(microvesseldensity，mvd)，pearson相关性分析探讨mir-92a表达与肿瘤血管新生mvd的相关性。通过转染mir-92a-mimic，inhihitor上调或抑制结直肠癌细胞hct116、sw620中mir-92a的表达水平，采用小管形成实验检测mir-92a不同表达对huvec小管形成的影响，免疫印迹法检测对其下游潜在靶点pten的蛋白表达的影响。结果表明：结直肠癌组织mir-92a的表达水平显著高于对应癌旁组织(p<0.01)；4种人结肠癌细胞系mir-92a的表达水平均显著高于正常肠上皮组织(p<0.05)；结直肠癌组织cd31阳性微血管密度显著高于癌旁组织(p<0.01)，mir-92a表达水平与结直肠癌血管新生mvd呈显著正相关(r＝0.580，p＝0.01)；上调mir-92a表达的hct116细胞培养上清液可以显著促进hljvec小管形成(p<0.05)；上调mir-92a表达可以显著抑制hct116细胞中pten蛋白表达水平(p<0.01)。因此得出：mir-92a在结直肠癌细胞和组织中高表达，与肿瘤血管新生增加密切相关；mir-92a可通过抑制pten的表达发挥促进结直肠癌血管新生的生物学功能。

根据本发明，所述结直肠癌生物标志物mir-92a，其可以反映出在结直肠癌患者及健康者中的差异表达，体现了对结直肠癌诊断的高敏感度和高特异性。

第二方面，本发明还提供了一种用于诊断结直肠癌的试剂盒，该试剂盒包含与结直肠癌相关的mirna标志物；所述标志物为mir-16、mir-21和mir-92a的组合。

本发明提供的用于诊断结直肠癌的试剂盒中，除了包含上述结直肠癌生物标志物外，其还包括pcr反应常用的酶和试剂。

具体地，试剂盒中还含有pcr酶、裂解液、te缓冲液、超纯水以及marker等，其中裂解液例如可以是由50mmtris-base，edta2mm，ph为8.0以及裂解液总体积5％的tritonx-100组成的混合溶液；pcr酶例如可以含有10mm的tris-base，50mm的kcl，3mm的mgcl2、25mm的dntpmixture以及0.5u的taqdnapolymerase/μl。

本发明对于试剂盒中除了结直肠癌生物标志物以外的其它试剂不做特殊限定，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择。

第三方面，本发明还提供了根据第一方面所述的结直肠癌生物标志物在制备用于结直肠癌诊断药物中的应用。

第四方面，本发明还提供了根据第一方面所述的结直肠癌生物标志物在制备用于抑制结直肠癌肿瘤血管新生药物中的应用。

根据本发明，所述结直肠癌生物标志物mir-92a在结直肠癌组织和细胞中的表达水平显著高于对应癌旁组织(p<0.01)和正常肠上皮组织(p<0.05)；结直肠癌组织cd31阳性微血管密度显著高于癌旁组织(p<0.01)，mir-92a表达水平与结直肠癌血管新生mvd呈显著正相关(r＝0.580，p＝0.01)；因此mir-92a在结直肠癌细胞和组织中均可高表达，并与肿瘤血管新生增加密切相关，可将其作为结直肠癌新的分子标志物及治疗靶点。

与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明提供的结直肠癌生物标志物mir-92a不仅在结直肠癌组织和细胞中都有高表达，而且与肿瘤血管新生增加密切相关，因此可以成为结直肠癌的分子标志物及治疗靶点从而实现对结直肠癌的诊断和治疗。

附图说明

图1是mir-92a在结直肠癌组织及细胞中的表达水平，其中图1-a是mir-92a在结直肠癌组织与癌旁组织中的表达对比，图1-b是mir-92a在结直肠癌细胞和正常肠上皮组织中的表达对比；

图2是结直肠癌组织mir-92a表达与肿瘤血管新生的相关性，其中图2-a是crc和邻近组织中的微血管(左：crc组织；右：肿瘤的邻近组织；箭头：微血管与标记的cd31阳性表达，ihc×400)；图2-b是crc中cd31阳性微血管密度(mvd)与邻近组织中的对比；**p<0.01；图2-c是mir-92a表达和mvd在crc组织中的表达相关性；

图3是转染mir-92amimic、inhibitor上调或抑制结直肠癌细胞mir-92a表达水平；

图4是结直肠癌细胞mir-92a高表达或抑制表达对huvec小管形成能力的影响，其中图4-a是人类脐静脉内皮细胞(huvec)在来自具有mir-92a过表达的hct116细胞的条件培养基中的管形成；图4-b是人类脐静脉内皮细胞(huvec)在来自具有mir-92a过表达的sw620细胞的条件培养基中的管形成；图4-c是图4-a中的封闭血管数目；图4-d是图4-c中的封闭血管数目；*p<0.05；

图5是mir-92a高表达或抑制表达对结直肠癌细胞pten蛋白表达的影响，其中，图5-a是通过targetscan软件预测的mir-92a与磷酸酶和张力蛋白同源物(pten)3'utr的结合位点；图5-b是用mir-92a模拟物转染的crc细胞中的相对mir-92a表达和通过定量实时聚合酶链反应测定的抑制剂；图5-c是通过western印迹测定pten蛋白表达；图5-d是用mir-92a模拟物和抑制剂转染的crc细胞中pten蛋白的相对表达；*p<0.05，**p<0.01。

下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：

实施例1

1材料与方法

1.1材料

1.1.1组织标本收集广东医学院附属深圳南山医院2014年6月至2015年12月经手术切除的结直肠癌及对应癌旁组织(距肿瘤边缘>4cm)标本25例。其中男性12例，女性13例；年龄32-84岁，平均年龄(59.2士13.1)岁。入选患者均知情同意并且经过本院伦理审查委员会审查批准，术前未经放化疗治疗，切除标本分别于液氮或中性甲醛中保存。

1.1.2细胞株人结直肠癌细胞hct116、sw620、ht29、sw480由香港中文大学赠与，人脐静脉内皮细胞huvec由中山大学赠与。

1.1.3主要试剂trizoireagent、lipofectamine2000，rna逆转录及扩增试剂盒均购自美国lifetechnologies公司；逆转录引物、mir-92a上游引物和下游引物、mir-92a-3pmimic和mir-92a-3pinhibi-for及相应阴性对照均由广州市锐博生物科技有限公司合成；高糖dmem培养基购自美国hyclone公司，人脐静脉内皮细胞humanendothelialsfm培养基及添加因子购自美国lifetechnologies公司，matrigel基质胶购自美国bd公司；兔抗人pten单克隆抗体(ab154814，克隆号：epr7495)购自英国abcam公司；羊抗兔二抗(111-035-003)购自美国jackson公司；兔抗人gapdh单抗(10494-1-ap)购自美国proteintech公司；鼠抗人cd31单抗(zm-0044，克隆号：1a10)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；abc免疫组织化学试剂盒(pie-6102)购自美国vector公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养结直肠癌细胞hct116、sw620、ht29和sw480培养于高糖dmem完全培养基，人脐静脉内皮细胞huvec采用endothelialsfm基础培养基添加生长因子构成的完全培养基培养，37℃，5％co2培养、稳定传代2～3代，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2qrt-pcr方法检测mir-92a表达按trizoi试剂说明书提取结直肠癌组织和细胞中总rna，按照rna逆转录试剂盒说明书设置反转录条件。每个样本取1μg总rna进行逆转录反应，反应条件为42℃60min，70℃10min。取1μlcdna进行pcr扩增，反应条件为50℃2min，95℃10min，95℃变性15s，60℃退火延伸1min，40个循环。组织中mir-92a表达采用绝对定量方法，根据标准品建立标准曲线和回归方程，计算mir-92a的浓度。mirnas定量进行标准化，结果以总rna/μg中的mirna、含量表示(fmol/μg总rna)。细胞中提取的rna以u6作为内参，计算各组mir-92a的相对表达量，实验重复3次，计算平均值。

1.2.3免疫组织化学法检测结直肠癌组织血管新生情况组织标本常规脱水、石蜡包埋，制作4μm切片。采用柠檬酸盐缓冲液进行高压热修复，一抗为鼠抗人cd31单抗(1:100)，以pbs代替一抗作为阴性对照，以已知阳性片作为阳性对照，按照abc法检测内皮细胞cd31表达。血管新生情况以微血管密度(mierovesseldensity，mvd)表示，以cd31阳性表达的棕黄色血管内皮细胞或细胞簇代表1条单独的微血管，先在低倍镜(×100)下选择血管高密度区，再于高倍镜(×400)下随机选取5个视野，计算其微血管数目平均值。

1.2.4细胞转染取对数生长期人结直肠癌细胞hct116和sw620细胞进行瞬时转染。细胞接种于6孔板中，培养细胞至融合度达60％左右。实验组分别加入50nmmir-92amimic和100nm的mir-92ainhibitor及5μl转染试剂；对照组分别加入相应阴性对照(negativecontrol，nc)。l×opti-mem培养基调整终体积至2ml培养6h，更换培养基继续培养。细胞转染48h后收集各组细胞用于提取rna，转染72h后收集细胞蛋白和无血清培养上清液(条件培养基)用于后续实验。

1.2.5小管形成实验96孔板每孔铺50μlmatrigel基质胶、接种1×10⁴个huvec，培养24h，实验组、对照组分别加入对应已收集的转染mir-92amimic、inhibitor的hct116和sw620细胞条件培养基100μl，37℃、5％co2环境中培养，6h后于显微镜下观察，huvec生长形成闭合环状小管样结构的作为1个新生小管进行计数。每组设3个复孔，每孔取3个视野计算平均值。

1.2.6免疫印迹法检测pten表达制备10％sds-page凝胶，每孔加入30μg蛋白样品，经sds电泳1h分离蛋白，湿法电转pvdf膜3h，5％脱脂牛奶封闭1h，加入兔抗人pten一抗(1:2000)，于4℃孵育过夜，tbst漂洗3次，10min/次。加入羊抗兔二抗(1:4000)，常温孵育1h，tbst漂洗6次，5min/次。滴加ecl显影液，采用化学发光成像仪成像，测定目的条带灰度值、分析蛋白表达，以gapdh为内参计算pten蛋白相对表达量。

1.3统计学方法

采用spss19.0软件进行统计学分析，计量资料结果用x士s表示，采用kolmogorov-smirnov检验法进行数据正态性检验，对于符合正态分布数据，两组间均值差异比较采用t检验，结直肠癌组织mir-92a表达与血管新生mvd的相关性采用pearson相关性分析，以p<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1mir-92a在结直肠癌组织及细胞中的表达

结直肠癌患者的癌组织(t)及与其相对应的癌旁组织(tat)mir-92a的表达水平(图1a)所示。25例crc组织的mir-92a表达水平为(1.102士0.735)(fmol/μg总rna)，显著高于癌旁组织的((0.037士0.031)(fmol/μg总rna)，差异具有统计学意义(t＝7.405，p<0.01)。以正常结直肠上皮赫膜组织(normaltissue，nt)为对照，4种crc细胞系中mir-92a的表达水平均显著高于正常对照，差异均具有统计学意义(p<0.05)。其中hct116细胞mir-92a表达最低，sw620细胞mir-92a表达最高(图1b)。

2.2mir-92a表达与结直肠癌血管新生mvd的相关性

免疫组织化学法染色检测25例结直肠癌组织和对应癌旁组织血管新生情况(图2-a、图2-b和图2-c)。结果显示，crc癌组织cd31阳性表达的mvd为(27.400士7.560)，显著高于对应癌旁组织mvd数量(10.760士3.140)，差异具有统计学意义(t＝9.829，p<0.01)。pearson相关性分析显示，结直肠癌组织中mir-92a的表达与cd31阳性的微血管密度呈显著正相关(r＝0.580，p＝0.01)。

2.3mir-92a高表达和抑制表达的细胞模型建立

分别选择mir-92a表达相对最低、最高的hct116、sw620细胞，通过瞬时转染mir-92a-mimic、inhibitor上调或抑制其mir-92a的表达水平，结果所示(图3)与阴性对照组比较，hct116细胞转染mir-92amimic48h后，其mir-92a的水平显著升高(t＝7.439，p<0.05)，sw620细胞转染mir-92ainhibitor48h后，其mir-92a的水平显著降低(t＝-45.916，p<0.01)。

2.4结直肠癌细胞mir-92a高表达或抑制表达对huvec小管形成能力的影响

小管形成实验结果显示，应用转染mir-92amimic上调hct116细胞，nir-92a表达的条件培养基作用6h，huvec形成完整闭合小管的数量明显高于对照组(t＝5.563，p<0.05)；相反，应用转染mir-92ainhibitor抑制sw620细胞，mir-92a表达的条件培养基作用6h，huvec形成闭合小管的数量明显低于对照组(t＝-6.107，p<0.05，图4-a、图4-b、图4-c和图4-d)。

2.5mir-92a高表达或抑制表达对结直肠癌细胞pten蛋白表达的影响

经targetsean软件对mir-92a的靶向基因进行预测，结果显示mir-92a的种子序列与pten基因3'utr之间存在靶向结合位点(图5-a)，提示pten可能是mir-92a的调控靶基因。转染mir-92amimic使hct116细胞mir-92a显著升高，其pten蛋白条带灰度值下降26.40％(t＝-15.176，p<0.01)；转染mir-92ainhibitor使sw620细胞中mir-92a表达水平显著降低，其pten蛋白条带灰度值升高21.98％(t＝10.911，p<0.01，图5-b，5-c，5-d)。结果提示mir-92a的表达水平与pten蛋白表达呈负相关。

由此可以看出，本发明进一步通过生物信息分析预测发现pten可能是mir-92a的下游调控靶基因。已知pten是pi3k/akt信号通路上重要的抑制分子，可以通过介导vegf的表达参与血管新生的调节过程，pten的缺失或者表达下调能促进肿瘤的血管生成；本发明得出，结直肠癌细胞mir-92a的表达水平与pten蛋白表达呈负相关，提示mir-92a可能通过抑制pten的表达发挥调控作用，促进结直肠癌的血管新生。

综上所述，mir-92a在结直肠癌组织中高表达，与癌组织血管新生增加密切相关。mir-92a可通过抑制pten的表达发挥促进结直肠癌血管新生的生物学功能。因此，mir-92a可成为结直肠癌新的分子标志物及治疗靶点，从而实现对结直肠癌的诊断和治疗。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。