本发明属于放射性化学合成领域，具体涉及到一种放射性同位素碳-14标记的杀虫剂毒死蜱及其合成方法。
背景技术：
毒死蜱(chlorpyrifos；o,o-二乙基-o-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯)属于乙酰胆碱酯酶抑制剂，是当前有机磷类杀虫剂中市场前景最广阔、最具潜力的农药品种。它由陶氏化学公司在1962年首次发现的高效低毒杀虫剂，具有胃毒、触杀、熏蒸作用，对多种作物上多种咀嚼式和刺吸式口器害虫均具有较好防效。当前，毒死蜱被认为是取代甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷这五种高毒有机磷农药的最佳选择。自毒死蜱发现以来的50多年里，作为一个广谱性杀虫剂、杀螨剂，已有大量商业化产品投入使用。它是世界卫生组织唯一许可的有机磷品种，现已经在中国、美国、澳大利亚、日本等14个国家登记和注册。
随着毒死蜱在我国和国际上产销量逐年增加和使用范围不断扩大，该农药品种可能引发的环境和生态安全问题逐步受到我国和国际社会的关注。欧盟、美国、oecd等国家和组织在进行农药环境安全性评价时，明确要求必须提供相关的代谢降解产物信息，并就此专门制定了相应的标准作业程序，这些标准作业程序中，均指出：农药代谢降解研究需首先考虑同位素示踪法，而放射性同位素碳-14标记毒死蜱是示踪研究中所必需的示踪剂。
目前，国内外有关毒死蜱的吡啶环碳-14标记合成仅见1篇报道(journalofagriculturalandfoodchemistry,1967,15(3),508-511)，该文献中放射性同位素碳-14标记毒死蜱(9)合成技术路线如下所述：
1、以1,4-丁内酯(10)为起始原料，将其与[14c]氰化钠/氰化钾进行亲核取代反应，获得4-[14c]氰基丁酸(11)，水解获得[1,5-14c2]戊二酸(12)；也可以1,3-二溴丙烷(13)为起始原料，将其与[14c]氰化钠/氰化钾进行亲核取代反应，获得[1,5-14c2]戊二腈(14)，水解获得(12)。中间体(12)在高温高压下与氨气反应关环获得戊二酰亚胺(5)；再与五氯化磷和三氯化磷混合物反应获得中间体多氯[2,6-14c2]吡啶(15)。合成路线如图1所示。
2、中间体15经水解获得中间体16，采用氯气氯化获得3,5,6-三氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(8)；或者采用氯气将中间体15直接氯化得到五氯[2,6-14c2]吡啶(17)，经金属镁还原得到2,3,5,6-四氯[2,6-14c2]吡啶(18)，最后水解得到中间体8。合成路线如图2所示。
3、以碳酸钠为缚酸剂，3,5,6-四氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(9)在n,n-二甲基甲酰胺与二乙基硫代磷酰氯反应获得毒死蜱。
文献中碳-14标记毒死蜱的合成方法存在的主要技术缺陷和不足如下所述：反应中使用剧毒品氰化钾/钠和氯气；在将中间体12转化为[1,5-14c2]戊二腈(5)时需要高温高压反应条件(280℃)；以剧毒[14c]氰化物为合成的放射性同位素原料；因而该方法的合成原料难以获得，合成危险性大，合成成本高。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷和不足，提供放射性同位素碳-14标记的杀虫剂毒死蜱及其合成方法，无需使用剧毒的氯气和氰化钾/钠，避免了高温高压反应，因而生产安全，合成成本较低。吡啶环是毒死蜱中具有芳香性的基本母体结构，吡啶环化学性质稳定且在毒死蜱代谢和降解中稳定性好，因而选择对吡啶环2,6位进行定位碳-14标记。本发明制备的放射性同位素碳-14标记毒死蜱能够用以溯源追踪毒死蜱在环境和生命体中的迁移转化、代谢降解和吸收富集等污染演变规律研究，为全面评价毒死蜱的生态安全提供技术支持。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种放射性同位素碳-14标记的杀虫剂毒死蜱，所述毒死蜱为(o,o-二乙基-o-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14c2]吡啶基)硫代磷酸；结构式为：
其中，星号代表碳-14标记位置。
一种放射性同位素碳-14标记的杀虫剂毒死蜱的合成方法，包括以下步骤：
a、在氩气保护下，利用4-卤丁基苄基醚转化的金属有机试剂(19)与放射性同位素原料[14c]碳酸钡(1)中释放的[14c]二氧化碳反应，制备5-苄氧基[羰基-14c]戊酸(2)。
b、5-苄氧基[羰基-14c]戊酸(2)与氯化试剂以制备酰氯，将反应产物重新溶于无水二氯甲烷或四氢呋喃中，通入干燥氨气后获得5-苄氧基[羰基-14c]戊酰胺(3)，或者将反应产物与氨气的无水二氯甲烷或四氢呋喃溶液反应制备5-苄氧基[羰基-14c]戊酰胺(3)。
c、在氩气保护下，5-苄氧基[羰基-14c]戊酰胺(3)在钯碳催化下于常温常压下氢化，脱去保护基而制得5-羟基[羰基-14c]戊酰胺(4)。
d、在氩气保护下，以氯铬酸吡啶为氧化剂，将5-羟基[羰基-14c]戊酰胺(4)在常压下氧化关环而制得[羰基-14c2]戊二酰亚胺(5)。
e、在氩气保护下，[羰基-14c2]戊二酰亚胺(5)与氯化试剂反应，获得2,6-二氯[2,6-14c2]吡啶(6)。
f、在氩气保护下，2,6-二氯[2,6-14c2]吡啶(6)在碱性溶液中发生水解而得到6-氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(7)。
g、在氩气保护下，采用氯化试剂将6-氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(7)在温和条件下氯化而制得3,5,6-三氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(8)。
h、在氩气保护下，3,5,6-三氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(8)与二乙基硫代磷酰氯反应而获得吡啶环碳-14标记毒死蜱(o,o-二乙基-o-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14c2]吡啶基)硫代磷酸)，9)。
进一步地，所述步骤a中的金属有机试剂(19)选自格氏试剂、有机锂试剂、有机锌试剂、有机铜试剂。
进一步地，所述步骤b中的氯化试剂选自二氯亚砜、草酰氯。
进一步地，所述步骤c中，氢化反应的溶剂优选甲醇、乙醇等醇类溶剂；反应时间为30min～5h。
进一步地，所述步骤d中，氧化关环反应的溶剂优选二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环等，反应温度为-30～50℃，反应时间为1h～12h。
进一步地，所述步骤e中，氯化试剂优选氯化砜、次氯酸叔丁酯，反应温度为-20～50℃，反应时间为30min～12h。反应结束后，将反应液倒入冰水中，搅拌30min，二氯甲烷萃取,合并有机相，依次用水、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，得2,6-二氯[2,6-14c2]吡啶(6)。
进一步地，所述步骤f中，碱性溶液的溶剂优选甲醇-水混合物、叔丁醇，溶质优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂，水解反应温度为-10～90℃，时间为30min～12h。反应结束后，去溶剂，加入水，用甲基叔丁基醚萃取除杂；水相ph调至5，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，得6-氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(7)。
进一步地，所述步骤g中，氯化试剂优选三氯化磷、五氯化磷、氯化砜，反应溶剂优选二氧六环、四氢呋喃、二氯甲烷，反应温度为-10～50℃，反应时间为30min～5h。反应结束后，向反应混合物中加入水，搅拌，二氯甲烷萃取，依次用水、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，得3,5,6-三氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(8)
进一步地，所述步骤h中，反应溶剂优选乙腈、二氧六环，缚酸剂优选碳酸钾、三乙胺、二异丙基乙基胺。反应结束后，将反应混合物过滤，得粗产物，将粗产物快速层析获得目标物吡啶环碳-14标记毒死蜱(o,o-二乙基-o-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14c2]吡啶基)硫代磷酸(9)。
本发明具有如下优点：
(1)本发明所合成的碳-14标记毒死蜱标记位点确定，放化纯度、化学纯度>98％，比活度高达120mci/mmol，核素碳-14在毒死蜱稳定分子中骨架上，不易丢失，能够用以溯源追踪毒死蜱在环境和生命体中的迁移转化、代谢降解和吸收富集等污染演变规律研究。
(2)与文献方法相比，本发明以[14c]碳酸钡为放射性同位素原料，合成技术路线简便易行；在标记合成过程中避免使用剧毒化学品氰化物和氯气，涉及反应条件温和，无高温高压反应，因而无需耐压合成仪器设备，实验操作便利、安全，合成条件简单。
附图说明
图1为文献中多氯[2,6-14c2]吡啶(15)的合成路线；
图2为文献中3,5,6-三氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(8)的合成路线；
图3为本发明中放射性同位素碳-14标记毒死蜱的合成技术路线(星号代表标记位置)。
图4为本发明中碳-14标记毒死蜱的液相色谱图。
图5为本发明中碳-14标记毒死蜱的在线放射性高效液相色谱图(放化纯度)。
图6为本发明中放射性同位素碳-14标记毒死蜱的高效液相色谱图(化学纯度)。
图7为本发明中碳-14标记毒死蜱的质谱图。
具体实施方式
本发明提供一种放射性同位素碳-14标记的杀虫剂毒死蜱，所述毒死蜱为(o,o-二乙基-o-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14c2]吡啶基)硫代磷酸；结构式为：
其中，星号代表碳-14标记位置。
如图3所示，本发明以4-卤丁基苄基醚(卤素为氯、溴、碘)为起始原料，将其转化为金属有机试剂(19)，以19吸收放射性同位素原料[14c]碳酸钡(1)中释放的[14c]二氧化碳，获得5-苄氧基[羰基-14c]戊酸(2)。中间体2经氯化试剂(三光气、二氯亚砜、草酰氯、三氯化磷、五氯化磷等)氯化转化为酰氯，再与氨反应获得5-苄氧基[羰基-14c]戊酰胺(3)，氢化脱去苄基保护基，最后在常温常压条件下通过氯铬酸吡啶氧化而关环，获得[羰基-2,6-14c2]戊二酰亚胺(5)。中间体5经氯化试剂(草酰氯、二氯亚砜、三氯化磷、五氯化磷等)氯化和碱性(水-甲醇/乙醇/异丙醇/叔丁醇-氢氧化钠/氢氧化钾/乙醇钠/甲醇钠/叔丁醇钠/叔丁醇钾等组合)水解而获得6-氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(7)。中间体7在温和条件(在-10～50℃)下经碱性条件(水-甲醇/乙醇/异丙醇/叔丁醇-氢氧化钠/氢氧化钾/乙醇钠/甲醇钠/叔丁醇钠/叔丁醇钾等组合)下用氯化试剂(次氯酸-氢氧化钠/氢氧化钾、次氯酸钠、次氯酸钾)氯化，获得了3,5,6-三氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(8)。中间体8在缚酸剂(碳酸钾、三乙胺、二异丙基乙基胺)存在下与二乙基硫代磷酰氯在溶剂(乙腈、二甲亚砜或者二氧六环)中于0～50℃反应，制备了吡啶环碳-14标记毒死蜱(9)，其比活度范围为1.0～120mci/mmol；化学纯度和放化纯度均大于98％。其中，各个步骤的具体参数为本领域的公知常识，或者是本领域普通技术人员，根据本发明中记载的合成要求，通过简单试验即可获得的。具体如下：
a、在氩气保护下，利用4-卤丁基苄基醚转化的金属有机试剂(19)；优选格氏试剂、有机锂试剂、有机锌试剂和有机铜试剂)吸收放射性同位素原料[14c]碳酸钡(1)在酸处理过程中释放的[14c]二氧化碳，具体操作方法见文献(高比活度碳-14标记毒氟磷的合成与分析，农药学学报，2017,19(6):672～678)。
b、中间体2与氯化试剂(优选二氯亚砜、草酰氯)反应以制备酰氯，反应可采用氯化试剂为溶剂，也可采用二氯甲烷、四氢呋喃等为溶剂，反应温度为-10～80℃。反应结束后将反应混合物浓缩；将浓缩物重新溶于无水二氯甲烷或四氢呋喃中，在-20～35℃通入干燥氨气后获得5-苄氧基[羰基-14c]戊酰胺(3)，或者将浓缩物与氨气的无水二氯甲烷或四氢呋喃溶液反应制备中间体3。
c、按照常规方法，在氩气保护下，中间体3在钯碳催化下于常温常压下氢化，脱去保护基而制得5-羟基[羰基-14c]戊酰胺(4)。反应溶剂优选甲醇、乙醇等醇类溶剂；反应时间为30min～5h。
d、在氩保护下，以氯铬酸吡啶为氧化剂，将中间体4在常压下氧化后关环而制得[羰基-14c2]戊二酰亚胺(5)；其中反应溶剂优选二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环等，反应温度为-30～50℃，反应时间为1h～12h。反应结束，将反应混合物过滤，滤饼干燥后得5。
e、在氩保护下，中间体(5)与氯化试剂反应获得2,6-二氯[2,6-14c2]吡啶(6)，其中氯化试剂优选氯化砜、次氯酸叔丁酯，反应温度为-20～50℃，反应时间为30min～12h。反应结束后，将反应液倒入冰水中，搅拌30min，二氯甲烷萃取,合并有机相，依次用水、饱和碳酸氢钠洗涤和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后得白色固体6。
f、在氩气保护下，中间体6在碱性条件下发生水解而得到6-氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(7)，其中溶剂优选甲醇-水混合物、叔丁醇，碱优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂，反应温度为-10～90℃，反应时间为30min～12h。反应结束后，浓缩除去大部分溶剂，加入水，用甲基叔丁基醚萃取除杂；水相ph调至5，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得产物7。
g、在氩气保护下，采用氯化试剂将中间体7在温和条件下氯化而制得3,5,6-三氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(8)，其中氯化试剂优选三氯化磷、五氯化磷、氯化砜，反应溶剂优选二氧六环、四氢呋喃、二氯甲烷，反应温度为-10～50℃，反应时间为30min～5h。反应结束后，向反应混合物中加入水，搅拌，二氯甲烷萃取，依次用水、饱和碳酸氢钠洗涤和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后得产物8。
h、在氩气保护下，中间体8在缚酸剂存在下与二乙基硫代磷酰氯反应而获得吡啶环碳-14标记毒死蜱(o,o-二乙基-o-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14c2]吡啶基)硫代磷酸，9)，其中反应溶剂优选乙腈、二氧六环，缚酸剂优选碳酸钾、三乙胺、二异丙基乙基胺，反应温度为0～50℃，反应时间为30min～8h。反应结束后，将反应混合物过滤，浓缩得粗产物，将浓缩物快速层析的目标物吡啶环碳-14标记毒死蜱(o,o-二乙基-o-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14c2]吡啶基)硫代磷酸，9)。
以下列举实施实例对本发明进行说明。实施实例只用于对本发明进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明做出的非本质的修改和调整，依然属于本发明的保护范围。
在室温和氩气保护下，将镁屑(2.1g)、一粒碘和无水四氢呋喃(5ml)加入反应瓶中，搅拌；先一次性加入4-溴丁基苄基醚(10.7g)无水四氢呋喃(70ml)溶液总量的10％，待反应引发后，缓慢滴加剩余溶液，控温低于40℃，滴加完毕，搅拌3h得格氏试剂。静置待分层。
利用自制的集成式微量放射性二氧化碳反应系统进行格氏反应制备标记物5-苄氧基[羰基-14c]戊酸(2)，具体操作方法见文献(高比活度碳-14标记毒氟磷的合成与分析，农药学学报，2017,19(6):672～678)。投料量：[14c]碳酸钡为4.338g(5mci/mmol)，浓硫酸用量为(30ml)。搅拌2h。反应降温至-10℃，加入饱和氯化铵淬灭反应，浓缩除去四氢呋喃，剩余水相用稀盐酸调ph至2～3，二氯甲烷萃取饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得油状5-苄氧基[羰基-14c]戊酸(2)。
在氩气保护下，将5-苄氧基[羰基-14c]戊酸(2,4.55g)和dmf(3滴)溶于无水二氯甲烷中，搅拌，降温至0℃，滴加入二氯亚砜(8.30g)。滴加完毕，回流搅拌1h，降温，浓缩除去溶剂和二氯亚砜，浓缩液用无水二氯甲烷(20ml)稀释。将此溶液降温至10℃，将其滴入搅拌的氨气干燥四氢呋喃(50ml)中，滴加完毕，搅拌30min；自然升至室温，搅拌12h。向反应液中加水，浓缩除去四氢呋喃，乙酸乙酯萃取(70ml)，合并有机相，饱和食盐水洗涤，过滤，浓缩得淡黄色固体5-苄氧基[羰基-14c]戊酰胺(3,3.78g)。
在氩气保护下，将中间体3(3.78g)、10％pd/c(500mg)和甲醇(75ml)混合，抽真空置换氢气5次，室温搅拌5h。tlc检测原料反应完全。过滤，以甲醇淋洗滤饼，浓缩滤液，干燥得白色固体5-羟基[羰基-14c]戊酰胺(4,2.14g)。
在氩气保护下，将氯铬酸吡啶(11.83g)与无水四氢呋喃(100ml)混匀，加入中间体15(2.14g)，搅拌。过滤，滤饼用四氢呋喃淋洗，浓缩滤液，快速硅胶层析(vmeoh:vdcm＝1:100)得粗品(1.19g),将其与无水乙醇(5ml)混合，过滤，滤饼真空干燥后得固体[羰基-14c2]戊二酰亚胺(5,1.23g)。
在氩气保护下，将5(0.98g)与氯化砜(8.0g)混合，在室温搅拌36h。反应液倒入冰水(100ml)中，搅拌30min，二氯甲烷萃取，合并有机相，依次用水、饱和碳酸氢钠洗涤和饱和食盐水洗涤，干燥，过滤，浓缩后得2,6-二氯[2,6-14c2]吡啶(6,1.05g)。
在氩气保护下，将中间体6(1.40g)、氢氧化锂(1.25g)和水(5ml)混合液，搅拌，用80℃油浴加热，搅拌过夜。浓缩除去大部分乙醇，加入水(50ml)和二氯甲烷(50ml)，搅拌，水相调ph至2，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得白色固体6-氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(7,0.93g)。
在氩气保护下，将中间体7(0.93g)，氢氧化钠(0.52g)和水(20ml)混合，搅匀，氩气置换系统空气5次；控制温度20～30℃，加入氯酸溶液(15ml)，在25℃搅拌3h。反应降温至0℃，以稀盐酸调ph至2～3，搅拌10min，过滤，真空干燥得淡黄色固体3,5,6-三氯[2,6-14c2]吡啶-2-醇(8,0.82g)。
在氩气保护下，将中间体8(0.82g)和乙腈(7.5ml)，搅拌均匀，加入二乙基硫代磷酰氯(0.93g)，在25℃搅拌5h。稀盐酸调体系ph至2～3，乙酸乙酯-石油醚(vea:vpe＝2:1,v/v)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，浓缩得粗品。粗品经制备型rp-hplc纯化得本发明的目标化合物碳-14标记毒死蜱(o,o-二乙基-o-(3,5,6-三氯-2-[2,6-14c2]吡啶基)硫代磷酸，9，1.09g)。
图4为本发明中碳-14标记毒死蜱的液相色谱图。
图5为本发明中碳-14标记毒死蜱的在线放射性高效液相色谱图(放化纯度)。
图6为本发明中放射性同位素碳-14标记毒死蜱的高效液相色谱图(化学纯度)。
图7为本发明中碳-14标记毒死蜱的质谱图。