本发明涉及一种提高aa-2g产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术：
：维生素c(vc)是一种人体自身不能合成的水溶性维生素，参与体内很多的生理活动，如促进胆固醇转变为胆汁酸，促进肾上腺皮质激素的合成，参与芳香氨基酸的代谢，促进铁的吸收及参与体内多种氧化还原反应，在维持和促进人体健康中扮演着重要的角色。另外，维生素c还能促进胶原蛋白的合成，还原已形成的黑色素，对保持皮肤弹性、美白、除皱有一定的作用。广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。但是vc二位碳的羟基极不稳定，非常容易氧化降解而限制了其应用。2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(aa-2g)是一种维生素c的糖类衍生物，是最稳定、性能最佳的vc替代品，近些年主要作为一种美白添加剂应用于多种品牌的高端化妆品中。目前，aa-2g主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶是最常用的催化酶。现有技术针对环糊精葡萄糖基转移酶的基因改造和高效表达研究较多，但是实现环糊精葡萄糖基转移酶在工业化生产中仍存在很大的问题，例如酶产量较低，酶催化制备aa-2g的转化率低等。cgtase具有以分子间转糖基反应制备特定产物的优良应用性能，其受体分子具有广谱性，但针对不同受体，获得的转化率差异很大，通常以糖类分子作为天然受体分子，其转化率明显高于非糖类分子，如本研究中的vc，并且以非糖分子做受体的产量难以提高。此外，cgtase催化合成aa-2g的过程中,α-和β-环糊精具有相对较高的转化率，常被用作糖基供体。然而，α-环糊精价格昂贵，β-环糊精很难溶于水，所以从生产成本考虑，两者均不适合大规模生产aa-2g。因此，以价廉易得的淀粉或麦芽糊精为糖基供体，通过分子改造cgtase技术提高vc作为受体的底物特异性，将推动l-aa糖基衍生物相关行业的快速发展。技术实现要素：发明所要解决的一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述突变体是将氨基酸序列为seqidno.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的一个或多个氨基酸位点进行突变。在本发明的一种实施方式中，所述突变体的产量有所提高。在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第228位的赖氨酸(lys)、230位的甲硫氨酸(met)、262位的天冬氨酸(asp)中的一个或者多个位点进行突变。在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqno.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第230位的甲硫氨酸(m)突变为亮氨酸，命名为m230l。在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqno.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第262位的天冬氨酸(d)突变为精氨酸，命名为d262r。在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqno.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第230位的甲硫氨酸(m)突变为亮氨酸，同时将第262位的天冬氨酸(d)突变为精氨酸，命名为m230l/d262r。在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如seqno.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶中第228位的赖氨酸(k)突变为精氨酸(r)，同时将第230位的甲硫氨酸(m)突变为亮氨酸，第262位的天冬氨酸(d)突变为精氨酸，命名为k228r/m230l/d262r。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体的制备方法，包括如下步骤：(1)在bacillusstearothermophilusno2环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带环糊精葡萄糖基转移酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化环糊精葡萄糖基转移酶突变体m230l。在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为puc系列，pet系列，或pgex中的任意一种。在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌和真菌细胞，其也为本发明的保护范围。在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌。在本发明的一种实施方式中，所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。本发明的有益效果：(1)得到了一种产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，突变体m230l、d262r、m230l/d262r，k228r/m230l/d262r的aa-2g产量分别为33g/l、33g/l、37g/l、39g/l，是野生酶产量的1.1、1.1、1.2、1.3倍。(2)本发明得到的环糊精葡萄糖基转移酶突变体产量高，纯化简单，适于工业化生产。本发明得到的环糊精葡萄糖基转移酶突变体应用于aa-2g的生产，最适ph为5.0，最适温度30℃。附图说明图1蛋白电泳检测图具体实施方式lb培养基(g·l-1)：胰蛋白胨10g·l-1，酵母粉5g·l-1，氯化钠10g·l-1tb培养基(g·l-1)：胰蛋白胨12g·l-1，酵母粉24g·l-1，甘油5g·l-1，kh2po42.31g·l-1，k2hpo4·3h2o16.43g·l-1，甘氨酸7.5g·l-1酶活定义：利用α-cd包埋甲基橙的性质采用比色法测定α-环化活力。一个酶活单位(u)定义为在该条件下1min内生成1μmolα-cd所需要的酶量。活力测定步骤：(1)预热：取2ml预先配置好的1％的麦芽糊精de9-13(50mm，ph5.5的磷酸缓冲液配制)，50℃保温10min。(2)反应：加入0.1ml适当稀释的酶液，反应10min，加入0.2ml3mhcl终止反应，加入0.2ml0.44mmol·l-1甲基橙溶液。(3)测量：将上述反应液16℃下保温15min，在505nm处测定吸光值并计算酶活力。实施例1：环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备(1)环糊精葡萄糖基转移酶单突变根据氨基酸序列位seqidno.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列，设计并合成引入m230l、d262r突变的引物，对环糊精葡萄糖基转移酶基因进行定点突变，测定dna编码序列，鉴别出第230位的met密码子变成leu密码子,第262位的asp密码子变成arg密码子。将突变体基因置于适当的表达载体并导入枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌中进行表达，得到单突变环糊精葡萄糖基转移酶。单突变m230l的定点突变；利用快速pcr技术，以表达载体cgt/pet20b(+)位模板。引入m230l突变的定点突变引物为：正向引物：atgctgttcgccacttgccgtttggttggcag反向引物：ctgccaaccaaacggcaagtggcgaacagcat引入d262r突变的定点突变引物为：正向引物：ctgaaaacgaagttcgcgcgaacaaccactatttcgc反向引物：gcgaaatagtggttgttcgcgcgaacttcgttttcagpcr反应体系均为：5×psbuffer10μl,dntpsmix(2.5mm)4μl,正向引物(10μm)1μl,反向引物(10μm)1μl，模板dna1μl，primerstarhs(5u/μl)0.5μl，加入双蒸水至50μl。pcr扩增条件为：94℃预变性4min；随后30个循环(98℃10s，55℃5s，72℃8min)；72℃继续延伸10min。pcr产物经dpnⅰ消化，转化大肠杆菌jm109感受态，感受态细胞在lb固体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)培养过夜后，挑克隆于lb液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确，得到的重组菌命名为bl21(de3)/pet20b(+)-m230l。(2)环糊精葡萄糖基转移酶双突变根据氨基酸序列位seqidno.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列，将单突变体酶d262r基因中第230位的甲硫氨酸(met)突变成亮氨酸(leu),命名为m230l/d262r。双突变体酶的制备方法，以单突变体d262r编码基因为模板，设计并合成引入m230l突变的引物，对环糊精葡萄糖基转移酶基因进行定点突变，测定dna编码序列，鉴别出第230位的met密码子变成leu密码子。将突变体基因置于适当的表达载体并导入枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌中进行表达，得到单突变环糊精葡萄糖基转移酶。双突变m230l/d262r的定点突变；利用快速pcr技术，以表达载体cgt/pet20b(+)位模板，引入m230l突变的定点突变引物为：正向引物：atgctgttcgccacttgccgtttggttggcag反向引物：ctgccaaccaaacggcaagtggcgaacagcatpcr反应体系、反应条件及突变基因的测定方法同单突变的方法，得到重组菌bl21(de3)/pet20b(+)-m230l/d262r。(3)环糊精葡萄糖基转移酶三突变根据氨基酸序列位seqidno.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列，将双突变体酶m230l/d262r基因中第228位的赖氨酸(lys)突变成精氨酸(arg),命名为k228r/m230l/d262r。三突变体酶的制备方法，以双突变体m230l/d262r编码基因为模板，设计并合成引入k228r突变的引物，对环糊精葡萄糖基转移酶基因进行定点突变，测定dna编码序列，鉴别出第228位的lys密码子变成arg密码子。将突变体基因置于适当的表达载体并导入枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌中进行表达，得到单突变环糊精葡萄糖基转移酶。三突变k228r/m230l/d262r的定点突变；利用快速pcr技术，以表达载体cgt/pet20b(+)位模板。引入k228r突变的定点突变引物为：正向引物:atgctgttcgccacttgccgtttggttggcag反向引物：ctgccaaccaaacggcaagtggcgaacagcatpcr反应体系、反应条件及突变基因的测定方法同单突变的方法，得到重组菌bl21(de3)/pet20b(+)-k228r/m230l/d262r。(4)突变菌株的制备pcr产物经dpnⅰ消化，转化大肠杆菌jm109感受态，感受态细胞在lb固体培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于lb液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确。(5)突变体的发酵挑取重组菌株于lb液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)生长8-10h，按5％接种量将种子发酵液接到tb培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中，在25℃摇床中培养60h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心上清液得到粗酶液。(6)突变体酶活测定测定突变体m230l、d262r、m230l/d262r、k228r/m230l/d262r酶活，环糊精葡萄糖基转移酶单突变和双突变体酶的摇瓶培养60h酶活力列于表中，其中突变体m230l的酶活略有降低，其他突变体酶活略有增加。表1环糊精葡萄糖转移酶突变体的酶活酶野生菌m230ld262rm230l/d262rk228r/m230l/d262r酶活/u·ml-15048545255实施例2：突变体纯化将实施例1中获得的酶液边搅拌边缓慢加入浓度为相对于酶液质量分数26％的硫酸铵，搅拌至硫酸铵溶解，在4℃条件下静置8-10h沉淀蛋白。混合物经离心(8000rpm,10min)收集沉淀，再用最小体积的20mmkh2po4-na2hpo4缓冲液(溶液aph7.0)复溶，复溶后经过再次离心除去固形物，收集上清，4℃下将复溶液置于缓冲液a中透析24h，透析后在12000r·min-1，4℃离心5min，收集上清酶液。将上清液经过0.22μm有机膜过滤制成上样样品。用deae-sepharoseff柱对cgtase进行纯化。首先用缓冲液a对deae-sepharoseff柱进行冲洗预平衡，将样品上样后，用缓冲液a洗脱两个柱体积，然后用含缓冲液a和缓冲液b(含1mol·l-1氯化钠的缓冲液a)的混合液以1ml·min-1的流速进行线性梯度洗脱。在波长为280nm紫外监测条件下，收集紫外吸收峰大于200mau的洗脱液，测定酶活并进行蛋白电泳检测，检测结果如图1所示。实施例3：hplc检测2-氧-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的产量在反应器中加入50g/l的l-抗坏血酸、50g/l的液化马铃薯淀粉(de值5左右)作为底物，用20％的氢氧化钠水溶液将ph调节到5.0，加入一定量酶活一样的实例3中获得的野生酶和突变体的浓缩酶液，在30℃，150rpm的水浴摇床中反应24小时，反应结束后加入60u葡萄糖淀粉酶，在60℃，150rpm的水浴摇床中反应24小时取样并加入同体积的三氯乙酸(10％，v/v)终止反应并沉淀蛋白，沉淀4小时后将样品12000rpm离心10min，取上清液适度稀释后用0.45μm超滤膜过滤，并进行hplc分析。色谱条件如下：agilent1200hplc色谱仪，agilent自动进样器，lc-9a紫外检测器；流动相为20mm的稀磷酸，流速0.8mlmin-1；柱温35℃。表2野生酶以及突变体生产aa-2g的产量酶aa-2g的产量(g/l)野生酶30m230l33d262r33d262r/m230l37k228r/d262r/m230l39结果见表2，突变体表达获得的突变酶与野生酶相比，可以发现，突变体实现了aa-2g产量的提高，其中m230l、d262r、d262r/m230l产量与野生酶相比分别提高了3g/l、3g/l、7g/l，k228r/d262r/m230l合成aa-2g的产量与野生酶相比提高了9g/l。实施例4酶学性质测定(1)最适温度及温度稳定性以de9-13麦芽糊精为底物(ph5.5)，在30-80℃范围内，每隔10℃测定cgtase酶活，定义最高酶活力为100％，计算各个温度下的相对酶活，以确定酶的最适温度；测定酶的热稳定性，将酶在50℃，定期取样测定酶的残留酶活(定义初始酶活力为100％)。(2)最适ph及ph稳定性不同ph的用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制不同ph的底物de9-13麦芽糊精，在50℃条件下，ph4.0-8.0范围内每间隔0.5个单位测定酶活，定义最高酶活力为100％，计算其它各ph条件下突变酶的相对酶活，以确定突变酶的最适ph；将突变酶在上述ph缓冲液中于4℃放置，定时取样，测定残留酶活(初始酶活为100％)，考察酶的ph稳定性。与野生酶最适温度70℃相比，突变体的最适温度降低到60℃，野生酶60℃半衰期为1.5h，突变体的半衰期为20min。酶的最适ph及ph稳定性不变。实施例5麦芽糊精制备aa-2g在反应器中加入不同浓度的抗坏血酸以及麦芽糊精(de值5-7左右)作为底物，用20％的氢氧化钠水溶液将ph调节到5.0，加入一定量实例2中野生型和突变体k228r/d262r/m230l的浓缩酶液，在30℃，150rpm的水浴摇床中反应24小时，反应结束后加入60u葡萄糖淀粉酶，在60℃，150rpm的水浴摇床中反应24小时后取样并加入同体积的三氯乙酸溶液(10％，v/v)终止反应并沉淀蛋白，沉淀4小时后将样品12000rpm离心10min,取上清液适度稀释后用0.45μm超滤膜过滤，并进行hplc分析。色谱条件如下：agilent1200hplc色谱仪，agilent自动进样器，agilentsb-aq5μm(4.6mm×250mm)，lc-9a紫外检测器；流动相为20mm的稀磷酸，流速0.8mlmin-1；柱温35℃表2野生酶和突变体以不同底物浓度和加酶量合成aa-2g产量虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。氨基酸序列表<110>一种提高aa-2g产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体<120>江南大学<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>680<212>prt<213>人工合成<400>1alaglyasnleuasnlysvalasnphethrseraspvalvaltyrgln151015ilevalvalaspargphevalaspglyasnthrserasnasnproser202530glyalaleupheserserglycysthrasnleuarglystyrcysgly354045glyasptrpglnglyileileasnlysileasnaspglytyrleuthr505560aspmetglyvalthralailetrpileserglnprovalgluasnval65707580pheservalmetasnaspalaserglyseralasertyrhisglytyr859095trpalaargaspphelyslysproasnprophepheglythrleuser100105110asppheglnargleuvalaspalaalahisalalysglyilelysval115120125ileileaspphealaproasnhisthrserproalasergluthrasn130135140prosertyrmetgluasnglyargleutyraspasnglythrleuleu145150155160glyglytyrthrasnaspalaasnmettyrphehishisasnglygly165170175thrthrpheserserleugluaspglyiletyrargasnleupheasp180185190leualaaspleuasnhisglnasnprovalileaspargtyrleulys195200205aspalavallysmettrpileaspmetglyileaspglyileargmet210215220aspalavallyshismetpropheglytrpglnlysserleumetasp225230235240gluileaspasntyrargprovalphethrpheglyglutrppheleu245250255sergluasngluvalaspalaasnasnhistyrphealaasngluser260265270glymetserleuleuasppheargpheglyglnlysleuargglnval275280285leuargasnasnseraspasntrptyrglypheasnglnmetilegln290295300aspthralaseralatyraspgluvalleuaspglnvalthrpheile305310315320aspasnhisaspmetaspargphemetileaspglyglyaspproarg325330335lysvalaspmetalaleualavalleuleuthrserargglyvalpro340345350asniletyrtyrglythrgluglntyrmetthrglyasnglyasppro355360365asnasnarglysmetmetserserpheasnlysasnthrargalatyr370375380glnvalileglnlysleuserserleuargargasnasnproalaleu385390395400alatyrglyaspthrgluglnargtrpileasnglyaspvaltyrval405410415tyrgluargglnpheglylysaspvalvalleuvalalavalasnarg420425430serserserserasntyrserilethrglyleuphethralaleupro435440445alaglythrtyrthraspglnleuglyglyleuleuaspglyasnthr450455460ileglnvalglyserasnglyservalasnalapheaspleuglypro465470475480glygluvalglyvaltrpalatyrseralathrgluserthrproile485490495ileglyhisvalglyprometmetglyglnvalglyhisglnvalthr500505510ileaspglygluglypheglythrasnthrglythrvallysphegly515520525thrthralaalaasnvalvalsertrpserasnasnglnilevalval530535540alavalproasnvalserproglylystyrasnilethrvalglnser545550555560serserglyglnthrseralaalatyraspasnphegluvalleuthr565570575asnaspglnvalservalargphevalvalasnasnalathrthrasn580585590leuglyglnasniletyrilevalglyasnvaltyrgluleuglyasn595600605trpaspthrserlysalaileglyprometpheasnglnvalvaltyr610615620sertyrprothrtrptyrileaspvalservalprogluglylysthr625630635640ilegluphelyspheilelyslysaspserglnglyasnvalthrtrp645650655gluserglyserasnhisvaltyrthrthrprothrasnthrthrgly660665670lysileilevalasptrpglnasn675680<210>2<211>32<212>dna<213>人工合成<400>2atgctgttcgccacttgccgtttggttggcag32<210>3<211>32<212>dna<213>人工合成<400>3ctgccaaccaaacggcaagtggcgaacagcat32<210>4<211>37<212>dna<213>人工合成<400>4ctgaaaacgaagttcgcgcgaacaaccactatttcgc37<210>5<211>37<212>dna<213>人工合成<400>5gcgaaatagtggttgttcgcgcgaacttcgttttcag37<210>6<211>32<212>dna<213>人工合成<400>6atgctgttcgccacttgccgtttggttggcag32<210>7<211>32<212>dna<213>人工合成<400>7ctgccaaccaaacggcaagtggcgaacagcat32<210>8<211>32<212>dna<213>人工合成<400>8atgctgttcgccacttgccgtttggttggcag32<210>9<211>32<212>dna<213>人工合成<400>9ctgccaaccaaacggcaagtggcgaacagcat32当前第1页12