与水稻苗期根长相关的SNP分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及生物分子标记领域，具体地说，涉及与水稻苗期根长相关的snp分子标记及其应用。
背景技术：
：水稻是世界上最重要的三大粮食作物之一，是世界2/3人口的主要食物来源。随着人口与经济的快速增长，粮食生产面临着巨大的发展压力，而水稻安全生产对于中国的可持续发展至关重要。近年来，我国气候变化异常，极端天气频发，其中干旱胁迫已成为威胁水稻生产的重要障碍因素之一，对我国水稻生产带来了严重威胁。其中根部性状与抗旱性密切相关，包括根长、根粗、根重、根数、根冠比和深体积等。如何有效解决水稻生产用水需求与干旱缺水之间日益尖锐的矛盾是我国粮食安全面临的最严峻挑战。生产实践证明，培育和种植节水抗旱水稻品种是减少干旱损失最经济有效的措施。发达的根系是水稻抗旱的重要保证。发掘水稻根系性状相关基因，开发与根系性状紧密相关的分子标记，通过分子标记辅助选择利用新基因或与已知优良基因进行聚合对于培育抗旱水稻品种具有重要意义。根系是植物吸收养分、水分以及感知土壤状况的重要器官，强壮发达的根系(特别是深根系)有利于提高水稻吸水能力，降低干旱对生长及最终产量的不利影响。利用dna分子标记对水稻根部性状的分子定位研究发现，水稻根部性状是受数量性状位点(quantitativetraitloci，qtl)控制的复杂性状。水稻根部性状(根长、根粗、根重等)相关qtls的分子定位已相继报道，其中根长相关的qtlqrl7精细定位到在7号染色体的657.35kb区间范围内。但在水稻根部性状相关qtls/基因的克隆方面，到目前为止，只有少数几个水稻根部性状相关的qtls被克隆。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,snp)主要是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的dna序列多态性，包括单碱基的转换、颠换、缺失和插入等形式。snp在水稻基因组中的分布相当广泛，随着高通量测序技术的进步，snp已经成为了新一代的分子标记。根据snp在基因组中分布的位置可以分为基因编码区snp(csnp)、基因间snp(isnp)和基因周边snp(psnp)，其中csnp(功能标记)是根据功能基因内部引起表型性状变异的多态性基序开发出来的一种新型分子标记。由于来自基因内的功能性基序，此类标记不需要进一步验证就可以在不同的遗传背景下或者不同的水稻种质资源中确定目标等位基因的有无。loc_os08g31580编码一个drebs类转录因子，该类转录因子在植物的冷、干旱、高盐、过氧化物等胁迫应答途径以及生长发育过程中具有重要的作用，参与不依赖于aba的胁迫应答反应。drebs转录因子通过结合下游基因启动子区的干旱及生长发育应答顺式作用元件而调控下游基因的表达。通过超量表达loc_os08g31580基因可以来提高水稻的抗旱性。以上研究结果表明loc_os08g31580基因在植物生长发育及抵御外界非生物胁迫方面起着重要的作用。因此loc_os08g31580基因的功能标记的开发和应用对分子标记辅助选择和水稻品种鉴定具有重要的理论和现实意义。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与水稻苗期根长相关的snp分子标记及其应用。为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：第一方面，本发明提供一种与水稻苗期根长相关的snp分子标记，所述分子标记来自loc_os08g31580基因，位于水稻第8染色体19,547,859bp位置，碱基为c或t。研究发现，当此处碱基为t的水稻品种苗期的根长显著长于碱基为c的水稻品种的根长。进一步地，所述snp分子标记及其两端的侧翼序列组成的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述snp分子标记在seqidno.1所示核苷酸序列的第456bp处存在c/t突变。进一步地，本发明提供用于检测所述snp分子标记的特异性引物，其特征在于，包括：正向引物：5’-aagccctaatcacccagac-3’；反向引物：5’-tgtagtggaacccgtggact-3’。需要说明的是，含有所述特异性引物的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。第二方面，本发明提供了所述snp分子标记在鉴定水稻苗期根长水平中的应用，包括以下步骤：1)提取待测水稻样品的基因组dna；2)以待测水稻样品的基因组dna为模板，利用前述特异性引物进行pcr扩增反应，获得扩增产物片段；3)检测pcr扩增产物片段的第456bp处的碱基种类，判断样品的苗期根长，位点基因型为t/t的水稻品种的苗期根长显著长于位点基因型为c/c的水稻品种。进一步地，步骤2)中pcr反应使用的扩增体系以20μl计为：pcr反应的条件为：①95℃预变性2分钟；②98℃变性10秒，53℃退火15秒，68℃延伸30秒，共33个循环；③68℃保温5分钟。进一步地，本发明还提供了所述snp分子标记在水稻苗期根长状改良及分子育种中的应用。本发明的有益效果在于：利用本发明所提供的snp分子标记能够对水稻苗期的根长进行鉴定，该snp位点与水稻的根长显著相关。该snp位点可以作为功能性分子标记，筛选根系性状优良的水稻资源和品种，在水稻根系相关育种中发挥重要作用。附图说明图1为七月籼(a)和白壳旱禾(b)品种的苗期根系图。图2为本发明的snp分子标记引物对在部分种质资源中基因组dna的扩增结果。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1与根长相关snp位点的鉴定和loc_os08g31580基因功能标记的开发从ricegenomeannotationproject下载水稻loc_os08g31580基因序列，依据此序设计引物用于扩增loc_os08g31580的编码区，cds编码区全长为843bp。用设计好的引物克隆陆稻材料白壳旱禾(根长14cm-图1b)和水稻材料七月籼(根长11.8cm-图1a)的cds区，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，然后对pcr产物进行测序分析。把测序所得到的序列在dnaman中进行比对，鉴定具有白壳旱禾(较长根系)和七月籼(较短根系)之间的snp位点。检测第8号染色体上的19,547,859bp位置snp位点的基因型存在差异，白壳旱禾此位点基因型为t/t，七月籼此位点的基因型为c/c。针对此snp位点设计了引物，如表1所示。表1引物序列引物名称引物序列(5’-3’)正向引物5’-aagccctaatcacccagac-3’反向引物5’-tgtagtggaacccgtggact-3’检测水稻根长相关snp位点(第8号染色体上的19,547,859bp位置)基因型的方法：提取水稻基因组dna，以基因组dna为模板，采用正向引物和反向引物进行pcr扩展，将pcr扩展产物进行测序，检测水稻根长相关snp位点(第8号染色体上的19,547,859bp位置)基因型为t/t还是c/c。其中，pcr反应体系为：pcr反应程序为：①95℃预变性2分钟；②98℃变性10秒，53℃退火15秒，68℃延伸30秒，共33个循环；③68℃保温5分钟。实施例2水稻种质资源苗期根长的测定本实施例选取30份水稻种质资源为材料，将水稻种子在50℃烘箱中烘3天打破休眠，用0.5％次氯酸钠(naclo)溶液浸泡30分钟进行表面消毒，在37℃培育箱下浸种、催芽至露白。选发芽一致的种子播于底部带有尼龙网的泡沫板孔中，置于盛有20l水的塑料盆中，每个材料播种约20个单株，三次生物学重复。用ph为5.5的蒸馏水培养三天，之后用yoshida营养液继续培养，期间每天调ph至5.5左右，每周换一次营养液、播种21天之后，测量根基部到根尖端的长度(根长)。结果见表2，30份材料中20份材料的根长小于12cm，根系较短；10份材料的根长大于13.5cm，根系较长。表230份水稻种质资源株高数据及snp基因型统计实施例3水稻根长相关snp分子标记在鉴定水稻根系长度中的应用待测样本为：实施例2表2中的水稻材料。提取待测水稻的基因组dna，以基因组dna为模板，采用正向引物和反向引物进行pcr扩展，pcr反应产物用1％的琼脂糖凝胶进行检测(图2)。按照实施例1中所述的方法检测待测水稻基因组dna中与水稻苗期根长相关的snp分子标记，即第8染色体19,547,859bp位置的基因型。测序结果表明，30个水稻材料中有20个材料在该snp位点的基因型为c/c，10个材料在该snp位点的基因型为t/t，同时发现该snp位点基因型为c/c的材料的平均根长为11.65cm，基因型为t/t的材料的平均根长为14.76cm，该snp位点基因型为t/t的水稻材料的根长显著的大于基因型为c/c的水稻品种。通过该snp标记对30份具有不同根长的水稻品种进行检测，发现该标记能够明确的鉴定出哪些种质资源具有较长的根系，该snp位点可以作为功能性分子标记，筛选根系性状优良的水稻资源和品种，在水稻根系相关育种中发挥重要作用。应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>中国农业科学院作物科学研究所中国农业科学院深圳生物育种创新研究院<120>与水稻苗期根长相关的snp分子标记及其应用<141>2018-01-15<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>572<212>dna<213>水稻(oryzasativa)<400>1aagccctaatcacccagactccatctctgtgaggtttgagagaggtaggtgagccgtaga60tctgagcgagttcttgggtcttccagcaggtagatcacttcatctgaggatcaatctttt120tttttttcctttgtttttgagcttctgttggtgtacaggacagagagttccagagccttt180tagtttctggtgttctgatctgttcttggtgtaagattattggtctgatttggtagccaa240gagggttaattttttccacacctccttgtgctagttagcttagcttataccccccttgta300aagtgattagtagatctagaacttctcttttcgtctgccagttcttggattttggaaaga360acaggtggtttgttattcagatttttaggttagaaaaaatccacaaaaaaaaagatattc420gatggcagctgctatagaaggaaatctgatgcgggcgctgggagaggctccgtcgccgca480gatgcagaagatcgcgccgccgccgtttcatcccggcttgccgccggcgccggcgaactt540ctcctcggccggagtccacgggttccactaca572<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2aagccctaatcacccagac19<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tgtagtggaacccgtggact20当前第1页12