本发明属于基因工程和作物分子育种技术领域，具体涉及小麦条锈菌pstg_17694基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法。
背景技术：
小麦是我国第二大粮食作物，年均播种面积约为3.6亿亩。小麦产量的稳定与提高关系国计民生。然而多年来，真菌病害对小麦生产构成严重威胁，如锈病、白粉病、赤霉病、纹枯病等病害的发生，严重影响小麦的产量和品质。其中，小麦条锈病俗称"黄疸"，是由专性寄生的条锈菌(pucciniastriiformiswestend.f.sp.tritici)引起。在我国，小麦条锈发病猖獗，常年受害面积达6,000～8,000万亩(农业部文件：农农发2006-9)；发病严重年份造成大幅减产(20～30％)，威胁粮食安全。条锈菌存在有性生殖，毒性变异快，近年来新的优势小种持续出现，导致条锈病控制难度加大。小麦主要产区黄淮海麦区的条锈病发生面积有逐渐增加的趋势，2017年5月统计河南、山东、安徽等7省市累计发生面积超过4,000万亩(中国农业科技推广，2017)。因此，有效防治条锈病对于我国粮食安全具有重要意义。
培育和种植抗病品种，是防治小麦条锈病经济、有效的重要措施。当前，我国多省的小麦品种审定已把是否具有条锈病抗性列为关键指标。提高抗性水平、培育持久抗性也已成为小麦新品种培育的重要目标。抗病品种的培育主要是通过抗条锈病基因的挖掘与利用，然而由于条锈菌生理小种毒性的快速变异，抗病基因大面积利用后可能会在短期内丧失抗病性。例如小麦育种上曾广泛使用的碧蚂一号、“洛类”、“繁6”衍生系等抗源，均已对当前流行小种失去抗性。对我国当前501份主栽和后备品种的检测表明，不足30％的品种对当前流行小种表现抗病，而且其抗源主要集中在yr26/yr24等少数基因(韩德俊等，西北-华北-长江中下游条锈病流行区系当前小麦品种(系)抗条锈病评价，中国农业科学，2010(43))。因此，拓宽小麦抗条锈病的抗源，开发新的条锈病防治策略，对于降低小麦条锈病大面积流行的风险具有重要意义。
小麦条锈菌由于其活体营养型及专性寄生特性，遗传转化困难；而且小麦本身同样难以开展遗传转化，因此小麦-条锈菌互作的遗传学研究困难很大，进展较慢。目前在小麦条锈菌中鉴定的侵染或致病关键基因数量较少，而且目前尚未有基因有效应用于小麦抗病育种。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种小麦条锈菌基因作为分子靶标在麦类作物育种或条锈病防治中的应用以及一种利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：小麦条锈菌pstg_17694基因在小麦条锈病防治中的应用，所述pstg_17694基因的序列如seqidno.1所示。
优选的，所述pstg_17694基因作为转录抑制的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述pstg_17694基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。
优选的，所述应用为将携带所述pstg_17694基因的沉默表达载体导入麦类作物中获得抗条锈菌的麦类作物。
优选的，所述应用为通过喷施所述pstg_17694基因的转录抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖。
优选的，所述pstg_17694基因的转录抑制剂为能够抑制所述pstg_17694基因转录的dsrna溶液。
优选的，所述应用为通过喷施所述pstg_17694基因的编码蛋白的活性抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖。
本发明还提供了一种抗条锈菌小麦的培育方法，包括以下步骤：1)以感染条锈菌后发病的小麦叶片cdna为模板进行pcr扩增获得pstg_17694基因片段；2)利用步骤1)所述的pstg_17694基因片段构建小麦条锈菌pstg_17694基因沉默表达载体；所述pstg_17694基因沉默表达载体的构建采用gateway克隆技术；3)采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌pstg_17694基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈菌小麦。
优选的，步骤1)中所述pcr扩增用引物为cqm17694-f2和cqm17694-r2引物；所述cqm17694-f2的序列如seqidno.3所示；所述cqm17694-r2引物的序列如seqidno.4所示。
优选的，步骤2)中所述小麦条锈菌pstg_17694基因沉默表达载体中包括潮霉素抗性基因hyg、除草剂抗性基因bar、pstg_17694基因片段的正向序列和pstg_17694基因片段的反向序列的表达盒。
优选的，所述小麦条锈菌pstg_17694基因沉默表达载体从t-dnaleftboarder到rightboarder区段的序列如序列表seqidno.6所示。
本发明的有益效果：本发明首次发现所述的pstg_17694基因能够有效的调控小麦条锈菌的生长繁殖，丰富了小麦条锈菌中侵染或致病的关键基因；将所述pstg_17694基因应用于小麦条锈病防治中通过沉默所述pstg_17694基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。本发明提供的利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法所获得的小麦具有显著的小麦条锈菌抗性。
附图说明
图1为实施例1中沉默表达pstg_17694的阳性转基因小麦除草剂筛选结果图；
图2为实施例1中抗条锈菌小麦pcr筛选检测结果；
图3为实施例2中抗条锈菌小麦温室接种条锈菌后叶片发病情况图；
图4为实施例2中抗条锈菌小麦人工气候箱接种条锈菌后叶片发病图；
图5为实施例3中抗条锈菌小麦接种条锈菌后pstg_17694基因的荧光定量表达分析结果图；
图6为实施例3中pstg_17694接种条锈菌后叶片组织染色观察图。
具体实施方式
本发明提供了小麦条锈菌pstg_17694基因在小麦条锈病防治中的应用。在本发明中所述pstg_17694基因的genbank登录号为kne88861.1，所述pstg_17694基因的序列如seqidno.1所示，基因序列长度为972bp，所述pstg_17694基因编码氨基酸序列具有ce4_mrcda_like结构域(cd10952)，具体序列如seqidno.2所示。
在本发明中，所述pstg_17694基因优选的作为转录调控的分子靶标或者作为蛋白质功能抑制的基因靶标，通过沉默所述pstg_17694基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。在本发明具体实施过程中，优选的通过以下三种方法来沉默pstg_17694基因，以实现所述pstg_17694基因在小麦条锈病防治中的应用：(一)将携带所述pstg_17694基因的沉默表达载体导入麦类作物中，获得抗条锈菌的麦类作物；(二)通过喷施所述pstg_17694基因的转录抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖；所述转录抑制剂优选的为能够抑制所述pstg_17694基因转录的dsrna溶液；(三)通过喷施所述pstg_17694基因编码蛋白的活性抑制剂至小麦叶片抑制条锈菌的生长繁殖。
本发明还提供了一种抗条锈菌小麦的培育方法，包括以下步骤：1)以感染条锈菌后发病的小麦叶片cdna为模板进行pcr扩增获得pstg_17694基因片段；2)利用步骤1)所述的pstg_17694基因片段构建小麦条锈菌pstg_17694基因沉默表达载体；所述pstg_17694基因沉默表达载体的构建采用gateway克隆技术；3)采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌pstg_17694基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈菌小麦。
本发明在扩增pstg_17694基因片段前，优选的对pcr扩增引物进行设计。在本发明中，优选的以小麦条锈菌的全基因组序列为参考，以假定功能蛋白基因pstg_17694(genbank:kne88861.1)的编码区序列为模板设计pcr引物；更优选的以小麦条锈菌生理小种pst-78全基因组序列为参考(genbank登录号ajil00000000.1或broad下载链接ftp://ftp.broadinstitute.org/pub/annotation/fungi/puccinia/genomes/puccinia_striiformis_pst-78/)。本发明中，所述pcr扩增引物设计的方法采用本领域常规方法即可，具体的可采用引物设计软件来实现。在本发明中所述pcr扩增引物优选的为cqm17694-f2和cqm17694-r2引物；所述cqm17694-f2的序列如seqidno.3所示；所述cqm17694-r2引物的序列如seqidno.4所示。
本发明在设计获得pcr扩增引物后，优选的对所述pcr扩增引物的扩增区段进行验证。所述验证具体的为用扩增区段的序列与小麦条锈菌pst-78全基因组数据和ncbi数据库中的小麦条锈菌序列进行比对，查看所述扩增区段的序列是否能够特异性靶标pstg_17694基因。在本发明中上述pcr扩增引物的扩增区段序列与小麦条锈菌pst-78全基因组数据和ncbi数据库中的小麦条锈菌序列比对后，通过序列比对后发现pstg_17694第一外显子与pstg_19439同源性较高，除此之外未发现所述扩增区段的序列与其它基因存在长度大于20bp的100％一致序列，表明利用cqm17694-f2/r2引物扩增区段的序列可以特异靶标pstg_17694基因。
本发明中，以感染条锈菌后发病的小麦叶片cdna为模板进行pcr扩增获得pstg_17694基因片段。在本发明中，优选的采用感染条锈菌生理小种cry32后发病的小麦叶片制备cdna；所述制备cdna的方法优选的采用常规trizol法制备纯化rna，并反转录获得cdna。在本发明中，所述制备纯化rna并反转录获得cdna分别采用rna纯化试剂盒和反转录试剂盒。在本发明具体实施过程中，所述制备纯化rna优选的采用天根生化科技(北京)有限公司，货号dp405的试剂盒实现；所述反转录获得cdna优选的采用北京全式金生物技术有限公司反转录试剂盒，货号at311-03。
本发明在获得感染条锈菌后发病的小麦叶片cdna后，以所述cdna为模板，进行pcr扩增获得pstg_17694基因片段。在本发明中所述pcr扩增使用的酶优选的为高保真酶，更优选的为phusion高保真酶(thermoscientific公司，货号f-530s)；所述pcr扩增的体系和程序采用本领域常规的pcr扩增体系和程序即可，具体的在本发明实施过程中，所述pcr体系为：5xphusionhfbuffer:10μl，phusiondnapolymerase:0.5μl，cqm17694-f2:1.5μl，cqm17694-r2:1.5μl，10mmdntps:1μl，templatedna:1μl，ddh2o:34.5μl；所述pcr程序为：98℃30s；98℃10s，60℃20s，72℃30s35循环；72℃10min。
本发明在获得扩增产物后优选的对扩增产物进行分离和测序，本发明中所述分离采用本领域常规的分离方法即可；所述测序委托测序公司完成；本发明中所述扩增产物测序获得的序列如seqidno.5所示，与参考基因pstg_17694的序列相似性99％，有1个snp(singlenucleotidepolymorphism)位点。
本发明在获得pstg_17694基因片段后，利用gateway克隆技术构建小麦条锈菌pstg_17694基因沉默表达载体。在本发明中，所述小麦条锈菌pstg_17694基因沉默表达载体的构建方法参见参考文献(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ics和pal的克隆与分析[d].山东农业大学,2013.)，具体的包括以下步骤：(a)将所述pstg_17694基因片段与入门载体连接后转入大肠杆菌感受态细胞获得阳性克隆质粒；(b)将所述阳性克隆的质粒dna与rnai沉默表达载体骨架pc336进行lr反应，同时将pstg_17694基因片段的正向、反向序列重组至载体pc336获得rnai沉默表达载体。
在本发明中，优选的将所述pstg_17694基因片段与入门载体连接；所述入门载体优选的为实验室改造的pc414c，与常规入门载体pentr-d-topo相比，pc414c插入了多克隆位点，可通过酶切、连接的方法实现定向克隆。具体连接pc414c与目标片段的方法参见参考文献(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ics和pal的克隆与分析[d].山东农业大学,2013.)。本发明为利用gateway克隆技术，优选的在cqm17694-f2/r2引物序列上增加保护碱基和酶切位点获得改良后引物。优选的所述保护碱基连接在引物序列5’末端；所述保护碱基的数目优选的为2～4个；在本发明具体实施过程中，所述cqm17694-f2上的保护碱基优选的为caa和cqm17694-r2上的保护碱基优选的为tca。在本发明中，所述酶切位点优选的为noti酶切位点和asci酶切位点，所述cqm17694-f2引物序列连接noti酶切位点，所述cqm17694-r2引物序列连接asci酶切位点。
在本发明具体实施过程中，所述pstg_17694基因片段与入门载体连接前，优选的将上述改良后引物扩增获得的包括pstg_17694基因片段pcr扩增产物和入门载体pc414c进行noti、asci双酶切获得酶切产物，然后利用t4-dna连接酶将纯化后的酶切产物(即pstg_17694基因片段和入门载体)进行连接获得连接产物。本发明在获得连接产物后，优选的将所述连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选纯化后获得阳性克隆质粒dna。在本发明中，筛选转化后的大肠杆菌感受态细胞获得所述阳性克隆质粒。本发明中所述筛选的方法优选的为菌落pcr；所述菌落pcr的引物优选的为cqm17694-f2/r2；所述纯化阳性克隆质粒dna优选的采用质粒dna试剂盒完成(天根生化科技(北京)有限公司，货号dp103)。本发明在获得阳性克隆的质粒dna后，利用阳性克隆的质粒dna与rnai沉默表达载体骨架pc336(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ics和pal的克隆与分析[d].山东农业大学,2013.)进行lr反应，将pstg_17694基因片段的正向、反向序列重组至载体pc336获得rnai沉默表达载体。本发明中，所述载体构建采用本领域常规的载体构建方法和程序，无其他特殊要求，能够获得rnai沉默表达载体即可。
本发明中获得的小麦条锈菌pstg_17694基因沉默表达载体编号为pc897，所述小麦条锈菌pstg_17694基因沉默表达载体上从t-dnalb(leftboarder)到rb(rightboarder)区段的序列优选的如seqidno.6所示，所述t-dnalb(leftboarder)到rb(rightboarder)区段的序列为包含顺次连接的潮霉素抗性基因hyg、除草剂抗性基因bar及pstg_17694基因片段的正向序列和pstg_17694基因片段的反向序列的表达盒。
本发明在获得小麦条锈菌pstg_17694基因沉默表达载体后，采用基因枪介导转化法将所述小麦条锈菌pstg_17694基因沉默表达载体转入小麦中获得抗条锈菌小麦。本发明中受体材料优选的为高感小麦条锈病的品系cb037。本发明中所述转化的具体技术流程如王树芸硕士论文所述(王树芸.小麦胚源再生与转化体系的建立[d].山东农业大学,2012.)。在此不再赘述。
本发明在所述转化完成后，优选的将转化后的材料在诱愈培养基上进行愈伤组织诱导，愈伤组织的分化培养获得再生幼苗，将所述再生幼苗生根培养后获得可移栽到土壤中的小麦苗。在本发明中所述转化后培养获得小麦苗的具体步骤和参数参考王树芸硕士论文所述(王树芸.小麦胚源再生与转化体系的建立[d].山东农业大学,2012.)。
下面结合实施例对本发明提供的小麦条锈菌pstg_17694基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(一)pcr扩增获得pstg_17694基因片段
以小麦条锈菌生理小种pst-78全基因组序列为参考(genbank登录号ajil00000000.1或broad下载链接ftp://ftp.broadinstitute.org/pub/annotation/fungi/puccinia/genomes/puccinia_striiformis_pst-78/)，以假定功能蛋白(hypotheticalprotein)基因pstg_17694(genbank:kne88861.1)的编码区序列为模板设计pcr引物。
正向引物序列cqm17694-f2，如seqidno.3所示：
5`-caagcggccgctcattcgaccaaagaaaggc-3`；
反向引物序列cqm17694-r2，如seqidno.4所示：
5`-tcaggcgcgccgatcacctcgtttccatgct-3`。
扩增区段长度490bp。利用扩增区段的序列比对小麦条锈菌pst-78全基因组数据(https://genome.jgi.doe.gov/pucst_pst78_1/pucst_pst78_1.home.html)及ncbi数据库小麦条锈菌序列(pucciniastriiformisf.sp.tritici，taxid:168172)，在本发明中上述pcr扩增引物的扩增区段序列，通过序列比对后发现pstg_17694第一外显子与pstg_19439同源性较高，除此之外未发现所述扩增区段的序列与其它基因存在长度大于20bp的100％一致序列，表明利用cqm17694-f2/r2引物扩增区段的序列可以特异靶标pstg_17694基因。
取材感染条锈菌生理小种cry32后发病的小麦叶片，利用常规trizol法(天根生化科技(北京)有限公司，货号dp405)纯化rna，并制备cdna(北京全式金生物技术有限公司反转录试剂盒，货号at311-03)。使用phusion高保真酶(thermoscientific公司，货号f-530s)使用引物cqm17694-f2和cqm17694-r2进行pcr扩增(pcr体系：5xphusionhfbuffer:10ul,phusiondnapolymerase:0.5ul,cqm17694-f2:1.5ul,cqm17694-r2:1.5ul,10mmdntps:1ul,templatedna:1ul,ddh2o:34.5ul；pcr程序：98℃30s；98℃10s，60℃20s，72℃30s35循环；72℃10min)，分离pstg_17694基因片段并进行测序验证。
自cry32分离得到的基因片段序列如seqidno.5所示，与参考基因pstg_17694的序列相似性99％，有1个snp(singlenucleotidepolymorphism)位点。
(二)小麦条锈菌基因pstg_17694沉默表达载体的构建
为利用gateway克隆技术构建基因沉默表达载体，cqm17694-f2/r2引物两端分别增加3个保护碱基(caa、tca)及noti酶切位点(gcggccgc)或asci酶切位点(ggcgcgcc)，以连入改造后的入门载体pc414c(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ics和pal的克隆与分析[d].山东农业大学,2013.)。pcr扩增产物及载体pc414c首先进行noti、asci双酶切，酶切产物纯化后利用t4-dna连接酶进行连接。连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，货号cd201)。利用引物cqm17694-f2/r2进行菌落pcr来筛选携带目的基因片段的阳性克隆，并纯化质粒dna(天根生化科技(北京)有限公司，货号dp103)。
利用阳性克隆的质粒dna与rnai沉默表达载体骨架pc336(韩秀丽.大麦水杨酸合成基因ics和pal的克隆与分析[d].山东农业大学,2013.)进行lr反应，同时将pstg_17694基因片段的正向、反向序列重组至载体pc336以构建rnai沉默表达载体。
lr反应体系：目的载体(150ng/μl)1μl；入门载体pc414c(50-150ng)1μl，ddh2o7μl；lrclonasetmiienzymemix(invitrogen公司，货号11791)2μl；25℃反应1h；加入1μlproteinasek，37℃灭活10min。反应液转化trans5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司，货号cd201)，挑取菌落纯化质粒dna，利用cqm17694-f2/r2引物进行菌落pcr筛选(pcr体系：2xbuffer10ul,cqm17694-f20.5ul，cqm17694-r20.5ul,ddh2o9ul,单菌落；pcr程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s35循环；72℃10min)。
小麦条锈菌基因pstg_17694沉默表达载体上从t-dnalb(leftboarder)到rb(rightboarder)区段的序列如序列表seqidno.6。其中包含潮霉素抗性基因(hyg)、除草剂抗性基因(bar)、pstg_17694基因片段的正向序列和pstg_17694基因片段的反向序列的表达盒。
(三)普通小麦的遗传转化及后代筛选
小麦遗传转化采用基因枪介导转化法，受体材料选用高感小麦条锈病的品系cb037。技术流程如王树芸硕士论文所述(王树芸.小麦胚源再生与转化体系的建立[d].山东农业大学,2012.)。小麦授粉后15天左右，挑选幼胚直径为1.5mm大小的幼胚剪取穗子剥取种子，表面消毒灭菌后剥取幼胚放置于高渗培养基上用基因枪轰击，再在诱愈培养基上23℃暗培养四周，每两周继代一次。四周后从诱愈培养基转到分化培养基，从分化培养基上愈伤开始放在光照培养(23℃，16hlight，8hdark)。两周后从分化培养基上再转到分化培养基上，直到再生出幼苗。把分化出的苗取出放在生根培养基上，大约3-4周待根长壮就可以移栽到土里。
通过叶片涂抹除草剂初步筛选阳性转基因后代。除草剂为agrevo公司产品finale，货号f30617006，使用浓度为0.3％。3-5天后根据叶片涂抹部位的敏感程度筛选阳性转基因后代。
如图1所示，其中cb037为转基因受体，株系5678-2a、5726-1为阴性转基因单株；2079-5a、5758-1a、5769-3a为阳性转基因单株。阴性转基因材料的叶片涂抹部位明显黄化或干枯坏死，而阳性转基因材料的叶片涂抹部位稍微黄化、无明显干枯坏死。
同时，取材转基因小麦的叶片制备dna及cdna，利用引物cqm17694-f2/r2进行pcr扩增对转基因材料进行筛选确认。如图2a所示，a、b为以gdna为模板的pcr结果；a图pcr引物为cqm17694-f2/r2；h2o为阴性对照，p为质粒dna阳性对照；b图pcr引物为lb306f/cqm17694-r2，其中引物lb306f为匹配载体框架中guslinker片段的引物序列，位置位于cqm17694正向、反向片段中间，lb306f的引物序列如seqidno.11所示，具体为5’-gacctcgcaaggcatattg-3'；h2o为阴性对照，p为质粒dna阳性对照。多数样品可产生与阳性对照(载体dna)相同的扩增条带，表明来自阳性转基因材料。
实施例2抗条锈菌小麦条锈病抗性鉴定
小麦条锈菌新鲜孢子的繁殖：温室内种植感病品种辉县红，一叶一心期用注射器注射孢子水溶液接菌，然后用喷壶喷水并搭盖塑料薄膜进行保湿。为保证充分发病可重复接菌2-3次，每次间隔1周。孢子水溶液的准备：取干燥、冻存(-80℃)的孢子，用适量自来水悬浮至淡橙色，室温下置于摇床震荡混匀30min(180rpm)，然后注射接菌。接菌后约20天可见零星发病，大约30天后可见大量叶片发病，可收集大量新鲜孢子用于转基因材料的接种鉴定。
利用t1:2世代(收获实施例1中第一代转基因材料的种子)种子在温室大棚内种植并接种小麦条锈菌，鉴定其条锈病抗性。种植前一周温室浇水浇透，晾晒一周左右。挑选15粒健康饱满的转基因种子均匀点播，行距25cm，行长1m。每隔十行种植2行转基因受体品种cb037。待生长至一叶一心期左右，取新鲜孢子进行接菌，接种后浇水并搭盖塑料布保持高湿环境。为了保证接种成功，初次接种后每隔一周进行重复接种，重复三次，每株至少接种三个分蘖。野生型cb037充分发病后，对转基因材料进行抗病性调查并记录，每隔一周重复鉴定一次，重复三次。
利用温室鉴定的抗病材料，收获t2:3世代种子后，在人工气候箱内进行重复鉴定。取干净的9cm培养皿，内置3层圆形滤纸，加入4ml去离子水，使滤纸浸湿。放置健康饱满的种子15～20粒/皿，盖上培养皿盖并用封口膜封口；用铝箔纸包裹避光于4℃冰箱内低温处理2～3天，打破种子休眠。于23℃光照培养箱中培养3～5d后移栽至土壤中，选取边长15cm的方形小花盆，每盆种植4棵。待植株长至一叶一心期，利用温室繁殖的条锈菌混合孢子进行接种。将孢子与滑石粉按大约1:10比例充分混匀后，用小毛刷蘸取孢子进行叶片接菌。接种后首先黑暗处理24h，温度11℃，湿度100％；然后进行正常光照培养，光照16h/温度22℃、黑暗8h/温度15℃，定期加湿，保持叶尖有水滴，至对照材料叶片充分发病(10-12天)。
转基因小麦温室接种条锈菌后叶片发病情况如图3所示，其中a为野生型cb037，b为pc897转基因材料。温室种植t1:2材料重复接菌三次之后，野生型cb037发病充分，叶片表面有大量孢子堆；而转基因材料叶片表面未见孢子堆产生，条锈病抗性效果明显。
转基因小麦人工气候箱接种条锈菌后叶片发病情况如图4所示：a为野生型cb037；b为pc897转基因材料。t2:3材料在培养箱内接菌12天后，野生型cb037充分发病，叶片表面布满孢子；而pc897转基因材料只有轻度褪绿，叶片未见有孢子产生，表明pstg_17694基因的沉默表达可显著提高小麦对条锈菌的抗性。
实施例3抗条锈菌小麦中pstg_17694基因的表达鉴定
小麦苗期叶片接菌12天后，野生型cb037叶片表面布满大量孢子堆。在接菌后不同时间点取cb037及转基因材料叶片约100mg，使用trizol法提取rna，制备cdna用于实时荧光定量pcr。实时荧光定量pcr引物序列为cqm_17694-f3和cqm_17694-r3，具体引物序列如序列表seqidno.7、seqidno.8所示。以小麦条锈菌α微管蛋白基因为内参(黄雪玲等，农业生物技术学报，2012，20(2)：181-187)，引物tuba-f/r序列如序列表seqidno.9、seqidno.10所示。
pcr体系为：5μl2×sybrgreenmaster，正向与反向引物(10μm)各1μl，1μlcdna，2μlddh2o，总体系为10μl。pcr反应采用两步法：95℃10min，40个循环的95℃15s，60℃1min。
利用2－△△ct算法分析各个基因的表达，利用sigmaplot12.5软件作图。
转基因小麦接种条锈菌后本发明所述基因的荧光定量表达分析结果如图5所示：其中pc897为所选阳性转基因小麦，cb037为小麦转基因受体。小麦叶片接种条锈菌不同取材检测基因表达水平。定量pcr引物为cqm17694-f3/r3。
转基因小麦接种条锈菌后叶片组织染色观察结果如图6所示，a为pc897转基因材料，b为野生型cb037。在接菌后第12天，用wga-fitc荧光染料染色。野生型cb037叶片中菌丝密集，表面可见孢子堆(b)；而转基因材料只在叶片内部观察到次生菌落且菌丝量少而短(a)；表明与野生型cb037相比，转基因植株叶片中小麦条锈菌pstg_17694基因的表达受到明显抑制，说明在小麦中表达rnai沉默载体pc897，可有效降低侵染小麦的条锈菌中的目标基因的表达水平。
由上述实施例可知，本发明提供的pstg_17694基因能够有效的调控小麦条锈菌的生长繁殖，将所述pstg_17694基因应用于小麦条锈病防治中，通过沉默所述pstg_17694基因达到抑制小麦条锈菌生长繁殖的作用。本发明提供的利用该基因培育抗条锈菌小麦的方法所获得的小麦具有显著的小麦条锈菌抗性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>山东农业大学
<120>小麦条锈菌pstg_17694基因在条锈病防治中的应用和抗条锈菌小麦的培育方法
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
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