本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种质粒提取方法。
背景技术：
质粒(plasmid)是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的dna分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，一般包括超螺旋、开环和线性三种结构，其中超螺旋结构的质粒dna在细胞中的转化和表达效率最高。质粒的长度一般在2-20kbp，分子量一般在106以上，质粒dna分子因具有磷酸基团而显负电，也会与一些基团发生特异性结合。
目前基于质粒dna的基因编辑和调控技术已广泛应用于科学研究，农业检测，医疗诊断等领域中，在疾病治疗研究中乃至临床上的应用倍受瞩目。
基因编辑和基因治疗是利用基因修正手段从分子水平上进行疾病治疗的新兴技术。治疗机理主要是通过基因转移技术奖携带治疗性基因的外源基因导入病变细胞中从而修饰或阻断致病基因，从而实现对疾病的治疗。因质粒dna分子具有更好的安全性及更低的毒性和免疫原性等优点，高质量dna质粒的大规模的分离纯化技术被迫切需要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种质粒提取方法，用于提取不同大小的质粒和提高质粒提取的回收率。
本发明提供了一种质粒提取方法，包括如下步骤：(1)将含有质粒的菌体裂解液上样第一层析柱，使用第一溶液进行洗脱，收集含有质粒的洗脱液，获得第一洗脱液；其中，所述第一层析柱填料为琼脂糖凝胶6ff；(2)将所述第一洗脱液上样第二层析柱，使用第二溶液进行洗脱，收集含有质粒的洗脱液，获得第二洗脱液；其中，所述第二层析柱填料为琼脂糖珠与固定在琼脂糖珠上的2-巯基吡啶配体；(3)将所述第二洗脱液上样第三层析柱，使用第三溶液进行洗脱，收集含有质粒的洗脱液，获得第三洗脱液；其中，所述第三层析柱填料为葡聚糖；(4)将所述第三洗脱液上样第四层析柱，使用第四溶液洗脱，收集含有质粒的洗脱液，获得第四洗脱液；其中，所述第四层析柱填料为带有季铵基团单苯乙烯/二乙烯基苯珠粒。
在一种可能的实现方式中，所述第四溶液为1.0mnacl,10mmedta,100mmtris-hcl,ph7.5。
在一种可能的实现方式中，在所述步骤(4)中，所述第四溶液洗脱为线性梯度洗脱。
在一种可能的实现方式中，所述线性梯度洗脱为流动相中的第四溶液的含量由0％升至100％。
在一种可能的实现方式中，在所述步骤(4)中，在将所述第三洗脱液上样第四层析柱之前，使用第五溶液平衡所述第四层析柱；其中，所述第五溶液为10mmedta,100mmtris-hcl,ph7.5。
在一种可能的实现方式中，所述第三层析柱的径高比为13:40-13:60；优选地，径高比为13:50。
在一种可能的实现方式中，在所述步骤(1)中，上样量为所述第一层析柱填料体积的20％-40％；优选地，上样量为所述第一层析柱填料体积的30％；更优选地，上样量为所述第一层析柱填料体积的20/53。
在一种可能的实现方式中，所述第一溶液为2.1m(nh4)2so4,10mmedta,100mmtris,ph7.5。
在一种可能的实现方式中，所述第二溶液为0.3mnacl,1.7m(nh4)2so4,10mmedta,100mmtris-hcl,ph7.5。
在一种可能的实现方式中，所述第三溶液为10mmedta,100mmtris-hcl,ph7.5。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：提高了质粒提取过程中质粒的回收率，将现有技术中的65％-80％回收率提高至88.5％；可以适用于不同大小质粒的提取，从而省却了现有技术中为提取不同大小质粒而摸索提取方法的繁琐操作；还可以延长阴离子交换色谱柱的寿命。
附图说明
图1为实施例1中步骤15的流出液检测图谱；
图2为实施例1中步骤16的流出液的检测图谱；
图3为实施例1中步骤17的流出液的检测图谱；
图4为实施例1中步骤18的流出液的检测图谱；
图5为实施例2中步骤25的流出液检测图谱；
图6为实施例2中步骤26的流出液的检测图谱；
图7为实施例2中步骤27的流出液的检测图谱；
图8为实施例2中步骤28的流出液的检测图谱；
图9为对比例1中步骤38的流出液检测图谱；
图10为对比例2中步骤48的流出液的检测图谱；
图11为实施例1和对比例2提取的质粒的琼脂糖凝胶电泳图谱；
图12为实施例2和对比例3提取的质粒的琼脂糖凝胶电泳图谱。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。
质粒dna的分离纯化过程主要包括：上游发酵裂解与下游纯化。上游发酵主要包括细菌发酵，细胞收集与裂解，裂解液澄清与浓缩三个步骤。目前，首先，细菌发酵主要有摇瓶发酵和发酵罐发酵两种方法。摇瓶试验可以在有限的空间、时间和人力的条件下，短期内获得大量的数据，所以在实验室研究中被广泛采用。摇瓶试验结果同时可以提供生产菌株的基本信息和发酵工艺数据，后续可经过中试放大后用于工厂发酵罐生产。
结合目前实验室设备条件及纯化规模等因素考虑，选择摇瓶发酵作为细菌发酵方法。接下来，细菌细胞收集才用离心法收集，裂解方法目前常用有有碱裂解法，热裂解法，机械裂解法等。热裂解法不适合大量菌体裂解，同时存在安全隐患并且回收效率低等缺点。而对于机械裂解法，机械破碎裂解大肠杆菌以释放完整的质粒的研究表明，只有微流体化合珠磨法能获得完整的质粒分子，其中最高收率一般在仅在50％左右。因此，在本发明实施例中选用了碱法裂解细菌细胞。将细菌悬浮液暴露于高ph的强阴离子洗涤剂中，使细胞壁破裂，染色体dna和蛋白质变性。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，由于闭环的质粒dna在拓扑学上是互相缠绕仍不会彼此分离。当ph恢复到中性时，dna双链就会再次形成，而大肠杆菌碎片，细菌的大部分基因组dna，细胞壁，细胞蛋白质，脂类，多糖等形成沉淀。此方法具有安全，经济，效率高的优点。接下来，裂解液澄清采取离心过滤的方法，澄清裂解液的浓缩采用超滤杯浓缩的方法，后续随着规模的增大可以考虑采用切相流过滤的方法。此时裂解澄清液中主要包括rna、其他形式dna、内毒素、少量细菌蛋白质和目的超螺旋质粒dna分子。
下游纯化比较常见的方法是溴化乙锭沉淀法和色谱分离纯化法。溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与dna结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状dna的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒dna中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多溴化乙锭，直至达到饱和。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环dna分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同，从而进行分离。然而该纯化过程既昂贵又费时，且仍需要其他手段去处核酸以外杂质。色谱分离法具有选择性高，特异性好，经济方便，质量可控等优点；但是存在的问题有，1、对于分子量较大的质粒的纯化效率低；2.、质粒dna分子的回收率偏低；3、残存了较多内毒素等其他杂质。
本发明实施例对色谱柱纯化法进行了改进，并基于此提供了一种质粒提取方法，即联合凝胶过滤层析、亲和色谱层析、阴离子交换色谱层析进行质粒纯化，可以总结为以下步骤：第一步，基于分子大小差异过凝胶过滤层析实现去除rna。第二步，基于超螺旋质粒dna分子与亲和层析配基结合能力不同实现特异性捕捉超螺旋质粒dna。第三步，基于杂质与阴离子交换层析配基结合能力不同去除内毒素和其他杂质实现最终纯化。
接下来在具体实施例中，对本发明实施例提供的质粒提取方法进行具体说明。
实施例1
11、将crispr/cas9质粒转化至感受态细胞，然后接种于含有氨苄霉素的lb固体培养基中，挑单克隆与2～5ml含有氨苄霉素培养基中进行初培养，然后按培养基：50％甘油＝1:1加入50％甘油，以得到菌种，然后将菌种置于-80℃保存。其中，50％甘油是指10体积水中含有5体积甘油。
12、取步骤11保存的菌种50ul接种于7ml含氨苄霉素培养基中，37℃220r/min培养至od在0.4－0.6。后1:1000加入含氨苄霉素培养基中，然后置于37℃，220r/min摇床，培养14-16h。菌体的收集通过6000r/min离心实现，并称湿重。
13、取步骤12得到的菌体重悬与溶液1中，然后加入等体积溶液2，温和颠倒5～10次，静置5分钟，然后按照13.4ml/菌体湿重(g)加入预冷的溶液3，温和颠倒5～10次，见白色絮状沉淀并在冰上放置30分钟；然后离心过滤，收集滤液，即澄清裂解液。其中，溶液1为50mmtris-hcl,10mmedta,ph8.0；溶液2为200mmnaoh,1％sds；溶液3为1m乙酸钾(potassiumacetate),ph5.5。
14、使用超滤浓缩杯浓缩步骤13获得的澄清裂解液，浓缩5～10倍。超滤杯浓缩杯的浓缩滤膜的分子截留量视质粒大小决定。本实施例中，超滤杯浓缩杯的浓缩滤膜的分子截留量为300kda。
15、去除rna。本实施例采用的凝胶层析柱的填料为琼脂糖凝胶6ff(sepharose6fastflow；其为90μm直径高度交联的6％琼脂糖珠)；填充柱的内径为26mm，高为20cm；即填充柱的径高比为13:100；填料体积为106ml。然后溶液4平衡。溶液4为2.1m(nh4)2so4,10mmedta,100mmtris,ph7.5。将步骤14获得浓缩裂解液上样凝胶层析柱，上样量为40ml，即比吸附量(上样的样品与层析柱填料的体积比)为4:15。使用溶液4进行洗脱，流速为15ml/min。
在步骤15中，使用溶液4洗脱时，分子量较大的dna等物质先流出，分子量较小的rna等物质后流出，从而可以去除rna。具体洗脱液的收集为：洗脱期间用ge公司的akta仪器检测流出液图谱，如图1所示；当洗脱了120ml时，出现第一流出峰11，收集第一流出峰11的流出液75ml；经nanodrop检测和琼脂糖凝胶电泳定性分析，可知收集的75ml第一流出峰11的流出液含有最终目的质粒。当洗脱了230ml时，出现第二流出峰12，经nanodrop检测和琼脂糖凝胶电泳定性分析可知第二流出峰12对应rna等物质。
在步骤15中，实现了dna和rna等小分子的分离。
16、超螺旋质粒dna的捕捉。超螺旋质粒dna的捕捉由过填料为直径为34μm的高度交联的琼脂糖珠与固定在其上的2-巯基吡啶配体的亲和柱实现。亲和柱的内径为26mm，填料高度为3.7cm，即亲和柱的径高比为26:37，填料的体积为20ml。将步骤15收集的75ml第一流出峰11的流出液上样至制备的亲和柱中。亲和柱在使用前，用溶液5平衡，溶液5为2.1m(nh4)2so4,10mmedta,100mmtris,ph7.5。上样，溶液5再平衡。溶液6洗脱，溶液6为0.3mnacl,1.7m(nh4)2so4,10mmedta,100mmtris-hcl,ph7.5。洗脱流速为10ml/min。
在洗脱时，与填料亲和基团作用较弱的其他物质先流出，与填料亲和基团作用较强的超螺旋质粒dna后洗脱流出，从而可以进一步纯化质粒。具体地，洗脱期间用ge公司的akta检测流出液图谱，如图2所示；收集第三流出峰21的流出液120ml，经nanodrop检测和琼脂糖凝胶电泳定性分析，可知，其中含有最终目的质粒dna。
在步骤16中实现了将质粒dna和其他结构形式dna的分离。
17、脱盐处理。超螺旋质粒dna流出液的脱盐处理由自主填充的凝胶色谱柱实现。本步骤中的自主填充的凝胶色谱柱的填料为90μm直径高度交联的9％葡聚糖，采用的柱子的内径为26mm，高度为10cm，即径高比为13:50；填充体积为50ml。使用前用溶液7平衡。溶液7为10mmedta,100mmtris-hcl,ph7.5。将步骤16收集的第三流出峰的流出液120ml浓缩到15ml，上样，溶液7洗脱。
分子量较大的dna等物质先流出，分子量较小的盐等物质后流出。具体地，洗脱期间用ge公司的akta检测流出液图谱，如图3所示；当洗脱了20ml时，出现第四流出峰31，收集第四峰流出液15ml，经nanodrop检测和琼脂糖凝胶电泳定性分析，可知，其中含有最终目的质粒dna；其中，琼脂糖凝胶电泳定性分析结果如图11中泳道122所示。图11中的泳道121为1kbdnamarker的电泳结果。
在步骤17中，进一步将dna和rna等小分子杂质分离。
18、内毒素去除。再次纯化所用的层析柱的填料为source30q，source30q为带有季铵基团直径为30μm单苯乙烯/二乙烯基苯珠粒。层析柱的径高比为的内径为10mm，高为20cm，即径高比为1:20。填充填料体积为20ml。溶液7平衡，将步骤17脱盐后的样品上样，溶液7平衡，溶液8梯度洗脱。具体为线性梯度洗脱，0-200ml流动相中溶液8含量由0％升至100％。溶液8为1.0mnacl,10mmedta,100mmtris-hcl,ph7.5。
与填料阳离子基团不产生作用的其他物质先流出，后根据与填料阳离子基团作用强弱不同的物质梯度洗脱流出。如图4所示；洗脱液组成为溶液8含量为30％时出现第五流出峰41，洗脱液组成为溶液8含量为80％出现第六流出峰42。收集两峰对应流出液并用nanodrop进行含量检测，琼脂糖凝胶电泳进行定性分析。其中，收集的第五流出峰流出液35ml，第二流出峰10ml流出液，经nanodrop检测和琼脂糖凝胶电泳定性分析，可知，其中都包含最终目的质粒dna。其中，第五流出峰41对应的琼脂糖凝胶电泳定性分析结果如图11中的泳道123所示；第六流出峰42对应的琼脂糖凝胶电泳定性分析结果如图11中的泳道124所示。
对第五流出峰41的流出液和第六流出峰42的流出液用bca检测蛋白量，鲎试剂检测内毒素含量，结果显示均无明显差别。
步骤18中，上样前，使用nanodrop检测待上样样品中的质粒dna含量；洗脱，然后测量含有质粒dna洗脱液的质粒dna含量，可知，步骤18的质粒dna回收率为88.5％。
19、质粒dna保存。往步骤18得到的含有质粒的洗脱液加入适量异丙醇，以沉淀质粒dna，然后用30％乙醇洗涤。然后te缓冲液(tris-edtabuffersolution)复溶，然后保存。
实施例2
21、将实施例1的步骤11中的crispr/cas9质粒替换为pgl3质粒，其他同步骤11。
22、同步骤12。
23、同步骤13。
24、同步骤14。
25、同步骤15；其中，洗脱期间用akta检测的流出液图谱如图5所示。
26、同步骤16；其中，洗脱期间用akta检测的流出液图谱如图6所示。
27、同步骤17；其中，洗脱期间用akta检测的流出液图谱如图7所示。含有质粒的流出液的琼脂糖凝胶电泳定性分析结果如图12中泳道132所示。图12中的泳道131为1kbdnamarker的电泳结果。
28、同步骤18；其中，洗脱期间用akta检测的流出液图谱如图8步骤28收集的不同峰对应的含有质粒的流出液的琼脂糖凝胶电泳定性分析结果分别如图12中的泳道133、泳道124所示。
对比例1
31、同步骤11。
32、同步骤12。
33、同步骤13。
34、同步骤14。
35、同步骤15。
36、同步骤16。
37、将步骤36收集到的流出液稀释两倍。
38、将步骤18中的溶液7替换为溶液9。溶液9为0.4mnacl,10mmedta,100mmtris-hcl,ph7.5。其上样的样品为步骤37稀释后的溶液。溶液8的洗脱为直接洗脱(洗脱时直接将洗脱液升高至100％)，不采用线性梯度洗脱，其他同步骤18，洗脱期间用akta检测的流出液图谱如图9所示。
对比例2
41、同步骤11。
42、同步骤12。
43、同步骤13。
44、同步骤14。
45、同步骤15。
46、同步骤16。
47、将步骤46收集到的流出液稀释4倍。
48、同步骤38，洗脱期间用akta检测的流出液图谱如图10所示。其中，步骤48收集到的含有质粒的流出液的的琼脂糖凝胶电泳定性分析结果如图11中的泳道125所示。步骤48的质粒dna的回收率为65％。
对比例3
51、同步骤11。
52、同步骤12。
53、同步骤13。
54、同步骤14。
55、同步骤15。
56、同步骤16。
57、将步骤56收集到的流出液稀释2倍。
58、同步骤38。其中，步骤58收集到的含有质粒的流出液的的琼脂糖凝胶电泳定性分析结果如图12中的泳道135所示。步骤58的质粒dna的回收率为80.1％。
总结起来，本发明提供的质粒提取方法相对于现有技术，具有如下优点：
1、关于凝胶色谱除盐取代了水稀释法降低盐离子浓度的分析。具体如下：
现有技术：对于阴离子柱进样液(多为上部纯化所得的含有目的质粒dna的高盐溶液)的处理，较常用推荐方法为二倍水稀释法。此方法处理样品不能适用于所有大小质粒(比如对比例2vs对比例3)。更大的质粒需要更高倍数的稀释(比如，对比例1vs对比例2)。
现有技术的弊端有：
a.处理方法不固定，当更改纯化目标时，需要重新摸索条件。
b.过度稀释会导致上样液质粒浓度低，从而导致流出液目的质粒dna浓度低，造成流出液的浪费(分管收集，nanodrop检测质粒浓度过低被认定无有效质粒dna存在，不进行下一步浓缩提取)，也会为后续浓缩提取增加难度(浓度过小的质粒dna无法通过异丙醇离心得到沉淀)。
本发明采用了凝胶色谱层析除盐，优点如下：
c.适用于所有大小质粒dna过阴离子交换层析前的处理，方法固定通用。
d.可以控制最终的样品盐浓度/buffer组成，在实施例1和2中，经过凝胶色谱层死将样品buffer最终置换成10mmedta,100mmtris-hcl,ph7.5；不但可使下一步阴离子交换层析平衡液buffer组成盐离子浓度低一些(阴离子交换层析平衡液buffer的盐浓度不小于样品盐离子浓度就可以保证样品与阴离子交换柱的完全结合)，从而平衡液和洗脱液盐离子浓度差变大，可以使得洗脱更加完全；而且，由于持续高盐的操作状态不利于对阴离子交换色谱的使用状态保持以及寿命保持，因此，此方法也利于色谱柱寿命的延长和循环持续使用。
e.此方法为稀释样品，可使得质粒dna收率变高，也方便后续操作处理。
2.阴离子交换色谱的梯度洗脱取代直接洗脱的分析
现有技术中的洗脱方案：平衡液为0.4mnacl,10mmedta,100mmtris-hcl,ph7.5，洗脱液为1.0mnacl,10mmedta,100mmtris-hcl,ph7.5。直接洗脱(洗脱时直接将洗脱液升高至100％)。现有技术的局限为不知道洗脱是否完全，不确定是否为最佳洗脱方案。
本发明采用了线性梯度洗脱，0-200ml流动相中溶液8含量由0％线性升至100％。溶液8为1.0mnacl,10mmedta,100mmtris-hcl,ph7.5。发现：两个洗脱峰，目前通过一些检测来看(凝胶电泳分析结构，bca法分析残留蛋白，鲎试剂法检测残留内毒素)，两个峰流出液均为质粒dna，且相关检验表示两峰流出的质粒dna均符合目前实验室所需的质粒质量要求。分析(1).两峰所收集到的质粒dna相对于原有技术所得质粒dna相比，质量没有差别，收率增加。(2).梯度洗脱可以用于纯化新的目的质粒洗脱条件的确定，观测出峰时buffer条件，可以得到最佳洗脱条件，实施例1和2中，当80％b+20％a洗脱时，最后一个洗脱峰出现，即可以后按照此条件洗脱，降低洗脱液盐离子浓度也有益于色谱柱的保护。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。