本发明涉及一种四价铂大分子前药pda、四价铂大分子磷酸钙纳米颗粒及其应用，属于有机化学和纳米材料制备领域。
背景技术：
：顺铂作为一种作用于dna的抗癌药物，其目前广泛用于治疗各类癌症(如卵巢癌、宫颈癌、脑癌等)。然而其具有很强的毒副作用包括肾毒性和神经毒性并且易产生耐药性限制了其在抗肿瘤药物中的应用。为了降低对正常细胞的毒性并克服癌细胞的耐药性，科研工作者们合成了许多化学惰性、无毒性的四价铂前药，并且研究表明四价铂分子在进入癌细胞后会被胞内如谷胱甘肽、抗坏血酸等还原成二价铂的形式从而达到抗癌的效果。近年来，聚合大分子药物日益受到科学家们的关注。杨军等人首先合成了两种由顺铂衍生的四价铂小分子dhp和dsp，并进一步合成了三种四价铂大分子聚合物p(dhp-da)-peg，p(dsp-pa)和p(dsp-eda)。文献中验证了这三种四价铂大分子聚合物可以被肿瘤细胞摄取并且它们的细胞毒性普遍比其相应的母体小分子高。景遐斌课题组首先合成了一端带羧基的四价铂化合物，然后与带有氨基正离子的mpeg-b-pcl-b-pll进行键合，从而自组装形成聚合物胶束，并且研究表明该聚合物胶束的细胞毒性比顺铂和其对应的母体聚合物要强。然而由于大多数大分子聚合物在体内都是不可生物降解的，其在体内循环时的生物安全性还有待考证。同时磷酸钙是天然存在的无机矿化材料。众所周知，磷酸钙是牙齿和骨头等硬组织的无机组成部分，因此具有无毒性、可降解性和极好的生物相容性等特点，所以纳米磷酸钙以其优秀的物理化学特性引起了的越来越多人的关注。由于纳米磷酸钙具有出色的物理和化学特性，这使得其在体内转运时能保持自身的完整性，所以在纳米药物载体领域，纳米磷酸钙的应用也越来越多。基于此，本发明首先合成了一种新的四价铂大分子前药pda，利用其上众多的羧基为磷酸钙的矿化提供条件，表面再以聚乙二醇修饰以达到长循环的效果，从而制备出一种新型的四价铂大分子磷酸钙纳米颗粒并对其药物释放和抗肿瘤效果进行了研究。技术实现要素：本发明是为避免现有技术所存在的不足之处，旨在提供一种四价铂大分子前药pda、四价铂大分子磷酸钙纳米颗粒及其应用。本发明所制备的四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒稳定性好，生物相容性高，有着很好的ph响应性释放效果和较好的肿瘤细胞杀伤效果，为解决目前四价铂前药所存在的稳定性低、易被肾脏清除等缺点开辟了一条新的途径。本发明四价铂大分子前药pda，其结构式为：所述四价铂大分子前药pda的分子量范围为8000～12000。本发明四价铂大分子磷酸钙纳米颗粒，是以磷酸钙包埋所述四价铂大分子前药pda，表面再以亲水性嵌段聚合物进行修饰获得的纳米颗粒。本发明四价铂大分子磷酸钙纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：步骤1：将顺铂加入水中，升温至60℃，然后加入双氧水(30wt％)氧化，搅拌反应4h；反应结束后静置冷却，-50℃下冻干得淡黄色固体dhp，为轴向带有羟基的四价铂小分子；dhp的结构式如下：步骤2：称取dhp和均苯四甲酸二酐(pmda)加入二甲亚砜(dmso)中，在60℃条件下搅拌反应2h；反应结束后，将反应液置于透析袋内(mwco，3500)透析24h，-50℃下冻干，得到四价铂大分子前药pda；pda的结构式为：步骤3：称取亲水性嵌段聚合物和pda加入蒸馏水中溶解，用0.1mnaoh溶液调节ph至9，然后向反应液中滴加0.1mca(no3)2溶液，搅拌反应5h，然后再向反应液中滴加0.1mna2hpo4溶液，搅拌反应10h，透析2天，冻干，得到目标产物。步骤1中，双氧水中h2o2和顺铂的物质的量之比为159：1。步骤2中，dhp和pmda的物质的量之比为1：1。步骤2中，pda的分子量为8000～12000。步骤3中，所述亲水性嵌段聚合物为peg5k-paa或peg5k-paa-5-af。当亲水性嵌段聚合物为peg5k-paa-5-af时，制备出带荧光的四价铂磷酸钙纳米载药颗粒。步骤3中，亲水性嵌段聚合物和pda上羧基的物质的量之比为5～6：1；ca(no3)2和na2hpo4的物质的量之比为1：2；pda上羧基与ca(no3)2的物质的量之比为1：2～3。本发明制备的四价铂大分子磷酸钙纳米颗粒的粒径为50～100nm。本发明pda的合成路线如下：其中peg5k-paa是发明人合成的亲水性高分子材料，peg5k-paa-5-af是将5-af与peg5k-paa键合得到的带有荧光素的高分子材料。制备过程如下：亲水性嵌段共聚物peg5k-paa的合成：1、将乙硫醇(24.85g，400mmol)和60ml蒸馏水混合并搅拌，然后在冰浴条件下缓慢滴加32g质量浓度为50％的naoh溶液(其中naoh16g，400mmol)，再在冰浴条件下加入20ml丙酮，搅拌30min，然后再加入二硫化碳(34.2g，450mmol)溶液变成澄清的橘黄色，并搅拌30min；2、冰浴条件下缓慢滴加2-溴丙酸(62.73g,410mmol)，然后再逐滴滴加32g质量浓度为50％的naoh溶液(其中naoh16g，400mmol)；放热停止后移除冰浴，然后加入60ml蒸馏水，在室温条件下反应24h；反应结束后在冰浴条件下加入60ml蒸馏水，用浓盐酸调节其ph为2，所得油状物用二氯甲烷萃取3次，旋蒸除去二氯甲烷，然后用正己烷重结晶，重复3次，得到淡黄色晶体etp；3、取聚乙二醇5000单甲醚(10g,2mmol)溶解在60ml甲苯中，然后加入二环己基碳二亚胺(dcc,4.5386g,22mmol)和4-二甲氨基吡啶(dmap,25.9mg,0.212mmol)，用恒压滴液漏斗滴加etp(4.2068g,20mmol)的甲苯溶液(20ml)，反应12h；反应结束后，过滤除去不溶物dcu，旋蒸除去部分甲苯，然后在冰乙醚中沉淀，如此反复3次，离心，抽干得etp-peg5k；4、将etp-peg5k(2.1616g,0.4163mmol)、丙烯酸(aa,3g,41.63mmol)和偶氮二异丁腈(aibn,13.67mg,0.08326mmol)溶解在30ml1,4-二氧六环中，冰浴条件下通n230min，移至60℃油浴锅中反应24h；反应结束后旋蒸除去部分1,4-二氧六环，用无水乙醚沉淀3次，离心，抽干得产物peg5k-paa。接有荧光素的亲水性嵌段共聚物peg5k-paa-5-af的合成1、将5-氨基荧光素(0.05g,0.144mmol)溶解在20mldmf中，然后加入二环己基碳二亚胺(dcc,0.0594g,0.288mmol)和4-二甲氨基吡啶(dmap,35mg,0.0288mmol)；2、用恒压滴液漏斗滴加peg5k-paa(0.1927g,1.44mmol)的dmf溶液(10ml)，反应12h；反应结束后过滤除去不溶物dcu，然后在冰乙醚中沉淀，如此反复3次，离心，抽干得产物peg5k-paa-5-af。本发明四价铂大分子磷酸钙纳米颗粒的用途，是在制备抗癌药物中的应用。本发明的有益效果体现在：1、本发明制备四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒的过程中所用溶液是水体系，安全无毒环保；2、本发明所合成的四价铂大分子前药pda带有大量羧基，更易于与ca2+绑缚，可以提高体系的载药量；3、本发明所制备的四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒稳定性好，生物相容性高，有着很好的ph响应性释放效果和较好的肿瘤细胞杀伤效果。附图说明图1为四价铂大分子前药pda在氘代dmso中的核磁氢谱图；图2为pda-na在水相凝胶渗透色谱中的所测得的gpc图；图3为亲水性嵌段共聚物peg5k-paa在d2o中的核磁氢谱图；图4中a为接有荧光素的亲水性嵌段共聚物peg5k-paa-5-af在d2o中的核磁氢谱图，b为5-af在氘代dmso中的核磁氢谱图；图5中a为测得的peg5k-paa-5-af的荧光曲线，b为5-af的荧光曲线，c为带荧光四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒的荧光曲线；图6中a，b分别是所制备的三种四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒粒径的dls数目分布图和dls强度分布图；图7是四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒的透射电镜图；图8中曲线a，b分别是四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒通过dls测得的在pbs(ph＝7.4)和dmem溶液中粒径随时间变化图；图9中曲线a，b，c，d分别是四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒在ph＝7.4的pbs溶液、ph＝7.4的pbs+5mmvc溶液、ph＝5.0的pbs溶液和ph＝5.0的pbs+5mmvc溶液中利用icp-ms测得的药物释放曲线；图10中a，b分别是在所测xps数据的基础上用xpspeak软件算出的四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒在ph＝5.0的pbs溶液中不同时间点的二价铂、四价铂的相对含量和在ph＝5.0的pbs+5mmvc溶液中不同时间点的二价铂、四价铂的相对含量；图11是不同浓度四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒经紫外测试算得的溶血值数据；图12是含有不同pt浓度的dhp、pda以及四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒对mda-mb-231的细胞毒性值；图13是不同浓度不包有四价铂大分子的裸纳米磷酸钙颗粒对mda-mb-231的细胞毒性值；图14是荧光标记的四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒在mda-mb-231细胞中经流式细胞仪测得的曲线图；图15是dhp、pda以及四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒中铂元素被mda-mb-231细胞的定量摄取结果。具体实施方式下面通过具体的实施例对本发明技术方案作进一步分析说明。下述实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1：四价铂大分子前药pda的合成1、称取顺铂400mg(1.334mmol)加入12ml水中，升温至60℃后逐滴加入24ml30％(212mmol)的双氧水，反应5min后体系为黄色溶液，1h后出现少量淡黄色沉淀，之后无现象变化，搅拌反应4h；反应结束后将反应液冷却至室温，冰浴静置过夜得淡黄色沉淀，过滤，冰水洗涤，冻干得淡黄色固体dhp；2、称取dhp150mg(0.45mmol)和pmda97.92mg(0.45mmol)加入15mldmso中，在60℃条件下搅拌反应2h，然后加入过量的乙醇封端；反应结束后，将反应液置于透析袋内(mwco，3500)透析24h，冻干，得到四价铂大分子前药pda。图1为四价铂大分子前药pda在氘代dmso中的核磁氢谱图，经分析产物为pda。图2为四价铂大分子前药pda-na在水相凝胶渗透色谱中的所测得的gpc图。具体是将四价铂大分子前药pda用0.1mnaoh溶液调至ph为9左右，再用水相凝胶渗透色谱对其所配成的水溶液进行测试，gpc水相流速为1ml/min。表1为四价铂大分子前药pda-na经水相凝胶渗透色谱测试所给出的相应数据。可以看出pda-na的分子量为9000左右，pdi为2.993。表1化合物保留时间/minmpmwmnpdipda-na25.43689431275242612.993实施例2：亲水性嵌段共聚物peg5k-paa的合成1、将乙硫醇(24.85g，400mmol)和60ml蒸馏水混合并搅拌，然后在冰浴条件下缓慢滴加32g质量浓度为50％的naoh溶液(其中naoh16g，400mmol)，再在冰浴条件下加入20ml丙酮，搅拌30min，然后再加入二硫化碳(34.2g，450mmol)溶液变成澄清的橘黄色，并搅拌30min；2、冰浴条件下缓慢滴加2-溴丙酸(62.73g,410mmol)，然后再逐滴滴加32g质量浓度为50％的naoh溶液(其中naoh16g，400mmol)；放热停止后移除冰浴，然后加入60ml蒸馏水，在室温条件下反应24h；反应结束后在冰浴条件下加入60ml蒸馏水，用浓盐酸调节其ph为2，所得油状物用二氯甲烷萃取3次，旋蒸除去二氯甲烷，然后用正己烷重结晶，重复3次，得到淡黄色晶体etp；3、取聚乙二醇5000单甲醚(10g,2mmol)溶解在60ml甲苯中，然后加入二环己基碳二亚胺(dcc,4.5386g,22mmol)和4-二甲氨基吡啶(dmap,25.9mg,0.212mmol)，用恒压滴液漏斗滴加etp(4.2068g,20mmol)的甲苯溶液(20ml)，反应12h；反应结束后，过滤除去不溶物dcu，旋蒸除去部分甲苯，然后在冰乙醚中沉淀，如此反复3次，离心，抽干得etp-peg5k；4、将etp-peg5k(2.1616g,0.4163mmol)、丙烯酸(aa,3g,41.63mmol)和偶氮二异丁腈(aibn,13.67mg,0.08326mmol)溶解在30ml1,4-二氧六环中，冰浴条件下通n230min，移至60℃油浴锅中反应24h；反应结束后旋蒸除去部分1,4-二氧六环，用无水乙醚沉淀3次，离心，抽干得产物peg5k-paa。图3为亲水性嵌段共聚物peg5k-paa在d2o中的核磁氢谱图，经分析产物为peg5k-paa，且所接上的aa单元数为87个。实施例3：接有荧光素的亲水性嵌段共聚物peg5k-paa-5-af的合成1、将5-氨基荧光素(0.05g,0.144mmol)溶解在20mldmf中，然后加入二环己基碳二亚胺(dcc,0.0594g,0.288mmol)和4-二甲氨基吡啶(dmap,35mg,0.0288mmol)；2、用恒压滴液漏斗滴加peg5k-paa(0.1927g,1.44mmol)的dmf溶液(10ml)，反应12h；反应结束后过滤除去不溶物dcu，然后在冰乙醚中沉淀，如此反复3次，离心，抽干得产物peg5k-paa-5-af。图4中a为接有荧光素的亲水性嵌段共聚物peg5k-paa-5-af在d2o中的核磁氢谱图，b为5-af在氘代dmso中的核磁氢谱图。图5中a为测得的peg5k-paa-5-af的荧光曲线，b为5-af的荧光曲线，c为带荧光四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒的荧光曲线。综合图4和图5的结果，可知5-af已经成功键合到了peg5k-paa上并使其带有荧光效应。实施例4：四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒的制备称取16.92mgpeg5k-paa(-cooh：0.1220mmol)，6.25mgpda(-cooh：0.02272mmol)于25ml单口瓶中，加入10ml蒸馏水溶解，用0.1mnaoh溶液调节ph至9；然后向反应液中逐滴慢速滴加0.1mca(no3)2溶液0.625ml，搅拌5h后再逐滴慢速滴加1.250ml0.1mna2hpo4溶液，搅拌10h，透析2天，冻干得产物。当我们在反应前加入1.692mgpeg5k-paa-5-af，我们制备出了带荧光的四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒。另外，我们将pda的投料量换成5mg和3.13mg，利用上述同样的方法制得了另外两种四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒。图6中a，b分别是所制备的三种四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒粒径的dls数目分布图和dls强度分布图。图7是所制备的四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒粒径的透射电镜图，可以看出颗粒大小均一，粒径在40nm左右。图8中曲线a，b分别是选取pda投料量为6.25mg制得的四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒通过dls测得的在pbs(ph＝7.4)和dmem溶液中粒径随时间变化图，可以看出颗粒稳定性好。表2是三种四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒通过dls测得的粒径数据和通过icp-ms测得的载药量和载药效率数据。表2实施例5：四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒的药物释放实验我们选取pda投料量为6.25mg制得的四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒进行相应的释放实验，具体的实施方案如下：1、量取4组2ml1.0mg/ml四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒溶液加入到透析袋中(透析袋使用前沸水煮5min，透析袋一端用绳子扎紧，一端用夹子)，分别配制ph＝7.4的pbs溶液、ph＝5.0的pbs溶液、ph＝7.4的pbs+5mmvc溶液、ph＝5.0的pbs+5mmvc溶液，每个时间点各取15ml上述缓冲液加入离心管中，离心管放在恒温振荡箱中，温度设定为37℃，在不同的时间点将透析袋取出放进新鲜的缓冲液中，时间点为0h，2h，4h，12h，24h，48h，72h，收集的离心管放在-20℃保存，冻干，冻干得到的样品用icp-ms测定其中pt的含量。2、另外我们量取2组2ml3.0mg/ml四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒溶液并将其分别加入到10ml的ph＝5.0的pbs溶液和10ml的ph＝5.0的pbs+5mmvc溶液，在不同的时间点各取出2ml样品液，收集冻干并用xps测定其中二价铂与四价铂的相对含量。图9中曲线a，b，c，d分别是四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒在ph＝7.4的pbs溶液、ph＝7.4的pbs+5mmvc溶液、ph＝5.0的pbs溶液和ph＝5.0的pbs+5mmvc溶液中利用icp-ms测得的药物释放曲线，可以看出在ph＝7.4的pbs溶液和ph＝7.4的pbs+5mmvc溶液中四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒中的药物基本不释放，在ph＝5.0的pbs溶液中释放较快，在ph＝5.0的pbs+5mmvc溶液中药物释放更快。图10中a，b分别是在所测的xps数据的基础上用xpspeak软件算出的四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒在ph＝5.0的pbs溶液中不同时间点的二价铂、四价铂的相对含量和在ph＝5.0的pbs+5mmvc溶液中不同时间点的二价铂、四价铂的相对含量，可以看出在ph＝5.0的pbs溶液中四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒基本以四价铂的形式释放，在ph＝5.0的pbs+5mmvc溶液中二价铂含量逐渐增多，并在12h后基本全部转化成了二价铂。实施例6：四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒的溶血实验1、先将0.8ml新鲜小鼠血离心(2500rpm，10min)，倒出上清液，再加入1ml0.01mpbs(ph＝7.4)溶液稀释得到稀释血；2、再分别配制5ml0.1mg/ml，0.01mg/ml，0.001mg/ml四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒的pbs(ph＝7.4)溶液各三组，用三组5mlpbs溶液(ph＝7.4)做阴性对照，三组5ml去离子水做阳性对照；3、将上述15组溶液放在恒温振荡箱中，温度设定为37℃，时间30min，再加稀释血摇匀，37℃培养1h，测紫外，记录540nm处峰值。图11是0.1mg/ml，0.01mg/ml和0.001mg/ml四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒经紫外测试算得的溶血值数据，可以看出该颗粒的浓度在不超过0.1mg/ml时，其溶血值不超过2％，与血液相容性较好。实施例7：四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒的细胞毒性实验我们选取了四价铂小分子dhp、四价铂大分子前药pda和四价铂大分子磷酸钙纳米载药颗粒(pt(iv)cpnp)通过mtt实验考察它们对mda-mb-231的细胞毒性，同时我们也考察了裸磷酸钙纳米载药颗粒对mda-mb-231的细胞毒性，具体的实施方案如下：(1)将mda-mb-231细胞接种到96孔板中，每孔接种1×105个细胞，再在每孔中加入100μldmem完全培养基置于37℃培养箱中培养24小时；(2)将pbs、dhp、pda以及pt(iv)cpnp用dmem完全培养基稀释到不同的浓度配成溶液，每组溶液取100μl加入孔板中，平行组设为3组，再继续置于37℃培养箱中培养48h；(3)培养结束，吸去培养基并补加相同体积的dmem完全培养基。将每孔中加入25μlmtt储液(5mgml-1于pbs溶液中)，空白孔中加入25μlpbs缓冲液，继续培养2小时；(4)在每孔中加入100μldmso孵育半个小时；(5)用酶标仪测定溶液在570nm的吸光度(abs)。用下面的公式计算细胞活力：其中，abs(sample)是样品孔的吸收值；abs(blank)为空白孔的吸收值；abs(control)为pbs对照孔的吸光值。图12是含有不同pt浓度的dhp、pda以及四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒对mda-mb-231的细胞毒性值，可以看出在同等铂浓度下相比于dhp和pda，四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒的细胞毒性更强，杀伤效果更好。图13是不同浓度不包有四价铂大分子的裸纳米磷酸钙颗粒对mda-mb-231的细胞毒性值，可以看出裸纳米磷酸钙颗粒的细胞毒性低，安全性好。实施例8：四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒(pt(iv)cpnp)的细胞定性摄取实验(1)将mda-mb-231细胞接种在24孔板中，每孔接种1×105个细胞，加入100μldmem完全培养基，然后37℃培养箱中培养24小时；(2)培养结束后，去除培养基，然后换入新的含有5-氨基荧光素标记的pt(iv)cpnp纳米颗粒的dmem完全培养基，在37℃条件下与细胞共培养2h、4h、6h；(3)去除培养液，用pbs缓冲液清洗两遍，使用0.25％的胰蛋白酶(含edta)消化并收集细胞至流式管中，使用流式细胞仪检测细胞内的绿色荧光信号，结果用flowjo_v10软件进行分析。图14是荧光标记的pt(iv)cpnp在mda-mb-231细胞中经流式细胞仪测得的曲线图，可以看出pt(iv)cpnp可以被细胞摄取，并在4h后基本被摄取完全。实施例9：四价铂大分子纳米磷酸钙颗粒(pt(iv)cpnp)的细胞定量摄取实验(1)将mda-mb-231细胞分别以每孔5×105个细胞种植在96孔板中，使用100μldmem完全培养基，37℃培养箱中培养24小时；(2)去除培养基，换入新的dmem完全培养基，加入dhp、pda和pt(iv)cpnp溶液，使铂元素的总浓度为2、4、8μg/ml，在37℃条件下与细胞共培养3h；(3)去除培养液，使用冷pbs清洗三遍，使用0.25％胰蛋白酶消化细胞，收集细胞至pbs溶液中，置于干净的烧杯内，加入500μl浓硝酸并将其蒸干，再加入500μl王水并定容至5ml；(4)使用icp-ms检测细胞内铂元素的含量。图15是dhp、pda以及pt(iv)cpnp中铂元素被mda-mb-231细胞的定量摄取结果，从中可以看出pt(iv)cpnp中铂元素被mda-mb-231细胞摄取量高于dhp和pda。以上所述仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12