本发明涉及混配金属基配合物，具体是一种混配的铜基配合物及其制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤治疗一直面临着严峻的挑战。肿瘤的生长、恶化、浸润和转移与新血管生成密切相关。恶性肿瘤可以衍生自身的脉管系统而获得营养，肿瘤细胞获得营养后，又促进肿瘤血管的生成，这意味着肿瘤血管和肿瘤细胞在肿瘤的生长中起到一个相互促进的作用。此外，抑制肿瘤血管生成同时诱导肿瘤细胞凋亡可以达到显著地抗肿瘤效果，发现既有肿瘤血管生成抑制的效果又有杀死肿瘤细胞双重功能的抗肿瘤药物有重要意义。
铜是所有生物体中一个至关重要的微量元素，铜配合物是有效的细胞毒性药物。铜活性化合物在作用机制、生物分布和细胞毒性方面不同于当前使用的铂类药物，而且它们对抗那些化学敏感性差或传统铂药物产生了抗药性的癌症是有效的，至少大体是有效的。此外，铜而不是其他金属，对血管生成有着密切的关系，血管内皮细胞对铜有着特殊的敏感性，因为螯合作用而使铜水平降低有效地降低肿瘤血管的密度，而铜螯合物本身对肿瘤血管生成的影响几乎未被研究。我们的研究发现，一个活性铜基配合物能作为肿瘤血管生成抑制剂，而且还是肿瘤细胞以及耐顺铂的肿瘤细胞的凋亡和损伤的诱导剂，并对与肿瘤血管生成与肿瘤细胞增殖、生存与转移密切相关的重要信号分子进行了研究，阐述了活性铜基配合物抑制肿瘤血管生成以及杀死肿瘤细胞和耐顺铂的肿瘤细胞的分子机理。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种自身既可作为抗肿瘤药物又可作为肿瘤血管生成抑制剂的混配铜基活性配合物。
本发明所要解决的技术问题，通过以下技术方案予以实现：
一种混配铜基配合物，其结构式为[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh，其中[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]是配位单元，c10h10no5sbr是席夫碱阴离子配体，c12h8n2是中性配体1,10'-邻二氮杂菲。
所述的混配铜基配合物的制备方法，包含如下步骤：
s1.将牛磺酸和强碱混合，加入有机溶剂搅拌溶解，然后加入5-溴-2-羟基-3-甲氧基苯甲醛，恒温搅拌2~4h，停止反应，得配体的钾盐k2c10h10no5sbr；
s2.将配体的钾盐k2c10h10no5sbr和可溶性铜盐混合，溶于甲醇/水的混合溶剂，再加入1,10'-邻二氮杂菲，恒温反应8~20h，反应结束后得混配的铜基配合物[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh。
上述制备方法，s1中所述的牛磺酸、强碱和5-溴-2-羟基-3-甲氧基苯甲醛的摩尔比为1~2：2~3：1~2，所述的强碱为氢氧化钾。
优选地，s1中所述的牛磺酸、强碱和5-溴-2-羟基-3-甲氧基苯甲醛的摩尔比为1：2：1。
s1中所述的有机溶剂为无水醇，恒温温度为45~55℃。
优选地，s1中所述的有机溶剂为无水甲醇，恒温温度为50℃，恒温时间为3.0h。
s2中所述的配体的钾盐k2c10h10no5sbr、铜盐和1,10'-邻二氮杂菲的摩尔比为1~3:2~4:1~2。
优选地，s2中所述的配体的钾盐k2c10h10no5sbr、可溶性铜盐和1,10'-邻二氮杂菲的摩尔比为2:3:2。
s2中所述的铜盐为硫酸铜，硝酸铜，氯化铜；优选硫酸铜。
s2中所述的甲醇/水混合溶剂体积比为v甲醇:v水=24:1。
s2中所述的恒温温度为50℃，反应时间为12h。
所述的混配铜基配合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的混配铜基配合物作为肿瘤血管生成抑制剂的应用。
所述的混配铜基配合物作为抗肿瘤药物和肿瘤血管生成抑制剂的应用。
优选地，所述的混配铜基配合物作为抗肿瘤和肿瘤血管生成抑制剂的应用。
本发明的有益效果：（1）本发明所述的混配铜基配合物具有显著地抑制肿瘤细胞甚至是耐顺铂肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡与损伤的能力，以及抑制血管内皮细胞增殖、迁移和管形成的作用；（2）本发明混配铜基配合物对肿瘤细胞具有显著的细胞毒性，而且对非肿瘤正常细胞的细胞毒性小；（3）所述的混配铜基配合物具有比顺铂显著的细胞毒性，而且对耐顺铂的肿瘤细胞在体内和体外都具有显著地诱导凋亡作用，此外抑制肿瘤血管生成的效果比阳性对照苏拉明效果好。因此，本发明所述的配铜基配合物是抑制肿瘤生长以及抑制肿瘤血管生成的双重功能的抗肿瘤药物的候选。
附图说明
图1为本发明混配铜基配合物的晶体结构图。
图2（a）为本发明混配铜基配合物诱导宫颈癌细胞c33a凋亡和损伤实验结果图，其中（a）为混配铜基配合物与c33a细胞孵育20h的实验结果，（b）为混配铜基配合物与c33a细胞孵育40h的实验结果；
（b）为本发明混配铜基配合物与耐顺铂的a549/ddp细胞孵育24h诱导细胞凋亡和损伤实验结果图，图中ddp：顺铂；
（c）为本发明混配铜基配合物诱导人脐静脉内皮细胞huvecs凋亡和损伤实验结果图，其中（a）为混配铜基配合物与huvecs孵育24h的实验结果，（b）为混配铜基配合物与huvecs孵育48h的实验结果；
图中cu-1指混配铜基配合物。
图3(a)为本发明混配铜基配合物和阳性对照苏拉明在生长因子vegf刺激下，对人脐静脉内皮细胞huvecs微管形成的抑制作用结果图；
(b)为本发明混配铜基配合物在生长因子vegf刺激下，对鸡胚尿膜囊血管形成抑制作用结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例1混配铜基配合物[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh的制备
（1）将牛磺酸（1.2514g，10mmol）和koh（1.1220g，20mmol）溶于35ml无水甲醇，再逐滴加入15ml的5-溴-3-甲氧基-水杨醛（2.3104g，10mmol）的无水甲醇溶液，在50℃水浴搅拌3小时，得到黄色澄清液；经过减压蒸馏除去大部分溶剂，过滤，洗涤，得到黄色粉末，真空干燥2天后，即配体的钾盐k2c10h10no5sbr；
(2)称取k2c10h10no5sbr（0.0829g，0.2mmol）和无水硫酸铜（0.0527g，0.3mmol）加入25ml甲醇和水的混合溶剂（v甲醇:v水=24:1），置于50℃水浴加热搅拌回流，得黄绿色澄清液；回流20分钟后，加入1,10'-邻二氮杂菲（0.0399g，0.2mmol)，继续恒温搅拌回流12小时后，停止反应，冷却后过滤，得到亮绿色澄清液；滤液在室温下静置，自然挥发，若干天后析出块状深绿色晶体，即为[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh。
实施例2[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh体外细胞毒性实验
mtt法：取处于对数生长期的肿瘤细胞，调整活细胞浓度为8×104/ml加于96孔培养板，每孔100μl，在培养箱中培养12h待贴壁后，再分别加入用无血清培养稀释的不同浓度受试样品100μl，加样组每个浓度设6个复孔，同时做阴性对照，置于37℃，5％co2培养48h，然后加入mtt（5mg/ml）20μl/孔，4h后用微量注射器轻轻吸出清夜，加入二甲基亚砜（dmso）150μl/孔，振荡10min左右，用酶标仪在490nm波长下测定od值。计算细胞存活抑制率，通过软件计算其半数抑制浓度ic50。
抑制率=(od阴性组平均值-od测试组平均值)/(od阴性组平均值-od培养基对照)×100%
用mtt方法研究[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh抑制不同细胞增殖的能力。所选的细胞有人宫颈癌细胞株（c33a和hela）、人耐顺铂肺癌细胞株（a549/ddp),人脐静脉内皮细胞株（huvecs）。从表1中ic50值可以看出，[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh对非癌细胞血管内皮细胞有一定的细胞毒性，具有的ic50为（5.25±0.034）µm，说明[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh对血管内皮细胞增殖有着明显的抑制，表明对肿瘤血管的生成有显著的抑制作用，这也跟血管内皮细胞对金属铜而不是其他金属有着特别的偏爱有关，特别在血管形成的时候。[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh对宫颈癌细胞c33a和hela的毒性比读对非癌细胞的毒性大很多，ic50分别为（2.99±0.28）和（1.96±0.01）µm，同等条件下，[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh对肿瘤细胞毒性胜过了顺铂，甚至对耐顺铂的肺癌细胞a549依然表现出显著的细胞毒性，ic50为（8.28±0.88）µm。因此，本发明所述的[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh具有显著地抑制所测肿瘤细胞增殖的能力，以及对血管内皮细胞也具有很强的抑制增殖作用。
表1.[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh与受试细胞孵育48h的ic50值.
实施例3流式细胞分析仪测定[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh体外诱导细胞凋亡与损伤实验
凋亡分析试剂盒annexinv/pi购买于美国bd公司(bdbioscience)，根据试剂盒使用说明进行凋亡检测。细胞(2×105/孔)被种在12-孔板（康宁）培养12h,然后用不同浓度的[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh与细胞孵育一定的时间（c33a细胞分别孵育20h和40h；a549/ddp孵育24h;huvecs孵育24h和48h）。为检测早期和晚期凋亡，悬浮的和贴壁的细胞全部收集，用1×pbs洗涤两次，以1000r/min转速离心5分钟，除去上清夜。细胞用100µlbindingbuffer重悬。随后,先用5µlannexin-v染细胞，轻轻重悬细胞后,再用5µlpi染细胞。将细胞轻轻重悬，在37℃避光孵育15分钟。然后加bindingbuffer重悬细胞调整细胞密度，滤膜过滤后，用流式细胞分析仪（facscalibur，bdbioscience)检测。
实验结果如图2所示，（a）图结果表明，[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh能随着浓度的增加以及时间的递增，显著地诱导宫颈癌细胞凋亡以及一定程度损伤。5µm[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh与c33a细胞孵育40h,诱导细胞损伤为10.9%，细胞总凋亡达57.1%，其中早凋为29.8%，晚凋为27.3%。浓度增大到6.5µm[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh时，诱导总凋亡达65.7%。[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh对a549/ddp也有显著地诱导凋亡的作用，孵育时间为24h,4.0、8.0和12.0µm[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh诱导a549/ddp的总凋亡率分别为19.6%、24.5%和49.1%。而[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh对huvecs的诱导凋亡作用和细胞损伤虽然也随着浓度的增大和时间的增长而轻微增大，但远比对肿瘤细胞的诱导凋亡和细胞损伤作用弱。综上结果表明，5.0µm[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]•ch3oh体外能显著地诱导肿瘤细胞c33a凋亡与损伤，但对血管内皮细胞的损伤与凋亡很弱。
实施例4[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]•ch3oh体外抑制huvecs管形成实验
根据使用说明，将基质胶在4℃过夜溶解，将基质胶铺到预冷的96-孔板，每孔60µl，在细胞培养箱孵育30分钟固化。细胞先与各种浓度的受试样品（[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh和苏拉明）以及vegf(20ng/ml)孵育12h，然后收集重悬接种到有基质胶的孔中，每孔200µl4.0×104个细胞。然后放置到细胞培养箱中培养，同时做空白与vegf(20ng/ml)对照，12h后，用倒置显微镜观察huvecs形成管状结构的完整性与数量，拍照。
实验结果如图3（a）所示，与control相比，vegf(20ng/ml)能显著地刺激huvecs形成管状结构，而且管的数量多和完整性好，然而用低浓度的[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]•ch3oh和vegf(20ng/ml)孵育huvecs细胞后，管的数量和完整性好随着[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh的浓度增大而显著减少，5.0µm的[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh已经几乎完全抑制huvecs的管形成，与相同浓度的阳性对照苏拉明相比，[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh比苏拉明的抑制效果好。实验结果表明，[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh能显著抑制huvecs的迁移和管形成。
实施例5[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]•ch3oh抑制鸡绒毛膜尿囊血管生成实验
鸡胚绒毛尿膜囊常被用于构建抗血管模型来分析化学诱导血管和抑制肿瘤血管。受精鸡蛋在37℃，湿度为80%的无菌恒温孵化箱中孵化约6天，然后将鸡蛋从尿膜囊区域的外壳上打开一个约1cm孔径的小孔，观察到鸡胚中的血管的生长情况。将血管生长较好的鸡胚分组：control、vegf（100ng/egg）、[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh+vegf（100ng/egg）以及阳性对照组苏拉明+vegf（100ng/egg）。各组受试样分别作用在鸡胚中的血管区域，每个检测样及不同浓度的设4个鸡胚平行试验。在无菌条件下加样完毕，用胶带将打开的孔密封起来，放入无菌恒温孵化器中继续孵育4天。然后取出，打开原来的孔，观察各测试组中鸡胚绒毛尿膜囊的动脉分枝情况，拍照。抗血管效应用动脉支管的相对数量来评价。
实验结果如图3（b）所示，与control相比，vegf(100ng/egg)能显著地刺激鸡尿膜囊血管形成，动脉支管数量比control组大大增多，表明vegf能刺激鸡尿膜囊血管形成，然而7.5nmol/egg的[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh在vegf(100ng/egg)刺激下显著抑制鸡尿膜囊血管形成，而且效果比相同物质的量的苏拉明抑制效果好，随着[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh物质的量增加，抑制效果增强。实验结果表明，[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh能显著抑制鸡尿膜囊血管形成。实施例4和实施例5的结果表明，[cu(c10h10no5sbr)(c12h8n2)]·ch3oh可能是血管生成抑制剂。