本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及b646l基因过表达腺病毒载体及其构建方法。
背景技术：
：非洲猪瘟(africanswinefever,asf)是由非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus,asfv)引起的猪的一种急性、烈性传染病。临床上以高热、全身性出血和高死亡率为特征。该病对养猪业危害巨大，被oie列为a类疫病。尽管我国尚无该病的传入，却时刻面临传入的风险。因此，对该病开展储备性研究，对于该病的防范具有重要意义。asfv为正20面体，直径约175nm～215nm。由外包膜、病毒衣壳、内包膜、核壳、病毒核酸5个组成部分。病毒核酸为双链dna，长度为170kb～190kb。病毒基因可编码200多种蛋白质，其中结构蛋白有54种。p72是asfv的一种主要结构蛋白，由b646l基因编码。是病毒衣壳的主要组成部分，产生于病毒感染晚期，位于细胞内病毒粒子的中层或表层，也是含量最多的病毒蛋白，占病毒蛋白总量的32％。p72是一种非常保守的抗原性蛋白，对自然感染具有免疫原性，可以作为诊断指标和疫苗开发。迄今为止，国际上尚未有任何可预防非洲猪瘟病毒感染的疫苗，现有技术中，缺乏对非洲猪瘟防疫的疫苗或其它防范措施的研究。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达非洲猪瘟病毒b646l基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，以制备过表达b646l基因的重组腺病毒，用于研究asfv候选疫苗。腺病毒是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳动物细胞中高水平地表达目的蛋白。因腺病毒感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞。同时其可感染的宿主范围广泛，可感染除人以外的几乎所有类型的细胞，包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡等物种。并且具有病毒滴度高，可用于动物试验以及有较好的生物安全性等特点。因此，利用腺病毒进行表达b646l基因重组腺病毒载体的构建及重组腺病毒的包装，对研究基于表达非洲猪瘟p72蛋白的候选疫苗具有重要意义。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种表达非洲猪瘟病毒b646l基因重组腺病毒载体，包括pad-ef1α-gfp腺病毒载体、插入pad-ef1α-gfp腺病毒载体多克隆位点的非洲猪瘟病毒b646l基因。b646l基因的序列如seqno.1所示。所述多克隆位点为asisi和mlui的酶切位点。一种表达非洲猪瘟病毒b646l基因重组腺病毒载体的构建方法，包括如下步骤：1)将b646l序列在基因合成公司合成，该序列两端加酶切位点asisⅰ和mluⅰ；2)用限制性内切酶asisⅰ和mluⅰ分别对基因合成序列b646l和pko-fh载体进行双酶切，分别得到b646l基因片段和pko线性化载体片段；将得到的b646l基因片段和pko载体片段进行连接，得到pko-b646l；3)用限制性内切酶pi-sce和i-ceu分别对所述步骤2)得到的pko-b646l和pad-ef1α-gfp腺病毒载体进行双酶切，分别得到线性化b646l基因片段和腺病毒pad载体片段；4)将所述步骤3)得到的线性化b646l基因片段和腺病毒pad载体片段进行连接，得到pad-b646l，使用cmv-f与fh-r进行测序；5)将所述步骤4)得到的质粒pad-b646l用限制性内切酶pacⅰ进行单酶切，挑选重组阳性质粒进行后续实验。优选的，所述步骤2)中双酶切反应的酶切反应体系如下表1：表1双酶切体系b646l基因片段或pko-fh载体20ul10×buffer3μlasisⅰ1μlmluⅰ1μlddh2o5μl总计30μl所述双酶切的温度为37℃，所述双酶切的时间为1小时。优选的，所述步骤2)中连接体系如下表2：表2连接体系目的基因b646l片段2～6μlpko载体片段2～4μl10×t4buffer1μlt4dna连接酶(10u/μl)1μl总计10μl所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。优选的，所述步骤2)中连接后还包括：对所述连接得到重组质粒进行阳性菌落的构建和鉴定。优选的，所述步骤3)中双酶切的反应体系如下表3：表3双酶切反应体系所述双酶切的酶切程序如下表4：表4双酶切反应程序优选的，所述步骤4)中连接体系如下表5：表5连接体系目的基因b646l片段2～6μl腺病毒pad载体片段2～4μl10×t4buffer1μlt4dna连接酶(10u/μl)1μl总计10μl所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。优选的，所述步骤5)中单酶切的酶切反应体系如下表6：表6单酶切反应体系重组质粒pad-b646l20μl(约2-3μg)10×buffer5μlddh2o24.5μlpacⅰ0.5μl总计50μl所述单酶切程序为37℃，3hr；95℃，5min。本发明提供了表达非洲猪瘟病毒b646l基因的重组腺病毒的制备方法，由以下步骤制备得到：a)将8μl的聚醚酰亚胺pei和250μldmem培养基配制成混合液mix1，静置5分钟以上。将前述步骤5)中得到的重组阳性质粒与250μldmem培养基制成混合液mix2。将混合液mix1和mix2均匀混合并震荡混匀，离心并静置30分钟。b)在细胞板上铺满细胞数0.3-0.5×106个/孔的hek293细胞。c)将步骤a)得到的静置后的混合液逐滴加入细胞板，十字混匀后置于co2培养箱培养2-3天。d)收集具有cpe效应的细胞，破碎细胞，转移至离心管中，离心后收集上清和细胞沉淀，上清过滤得到含b646l基因表达的重组腺病毒。本发明提供了含有b646l基因的腺病毒扩增与收毒、纯化与浓缩以及滴度检测、特异性检测。步骤4)具体为：收集具有cpe效应的细胞，用电移液枪移至离心管中，并做好相应的标记，离心弃上清，沉淀用a195回溶得到回溶液；ep管分装回溶液后先干冰冻存6-10min，再置于37℃，待管中冰块即将融化时取出摇匀，反复冻融4次后，12000g离心2min，取上清备用，4℃保存或-80℃保存；病毒的预处理：a)病毒上清处理：将在4℃条件下保存的上清离心，3500g，4℃，离心30min；离心后弃上清，收集病毒沉淀；用a195将病毒沉淀重悬，收集到管中；b)细胞沉淀处理：细胞沉淀用a195重悬，混匀，反复冻融四次；冻融时样品置于干冰中冻12-15分钟，然后转移至37℃水浴锅中融2-3分钟，如此反复四次；冻融完毕后，3500g，4℃，离心30min，分别收集上清和细胞沉淀；上清与重悬后的病毒沉淀混合；细胞碎片用a195重悬后加入5mol/lnacl至终浓度为1mol/l；c)超声破碎细胞:重悬后的细胞碎片超声破碎3-4次,ampl值为30％，30s/次，每次间隔20-30s，至液体不粘稠；超声完毕后，12000rpm，4℃离心10min；离心后，与病毒上清和细胞沉淀处理后样品混合；用电动移液器在离心管中逐层加入不同浓度的碘克沙醇；先加入60％碘克沙醇溶液4.2ml形成第一层，再加入40％碘克沙醇溶液5ml形成第二层，其次加入25％碘克沙醇溶液6ml形成第三层，最后加入15％碘克沙醇溶液9ml形成第四层；将经过病毒的预处理步骤的病毒液加入到离心管最上层，48000rpm离心2小时30分钟；离心前应将对应的离心管配平，误差控制在0.1g以内；离心完毕，弃前5ml，收集6-10ml液体至15ml离心管并用pbs、pf68的混合液稀释至体积15ml，然后用0.20μm的滤膜过滤，将过滤后的液体置于超滤管中，3500g离心50min。将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，最后加入5×a195储存液至储存液终溶度为1×；所述的5×a195为含30％胎牛血清的dmem培养基，pf68为含10％甘油、10％dmso的dmem，百分比为质量分数；pbs、pf68的混合液中，pbs、pf68体积比为1：1，其中pbs溶液：nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l。相对于现有技术，本发明提供了一种表达b646l的重组腺病毒及其构建方法，以pad-ef1a-gfp腺病毒表达载体为基础，引入asfvb646l基因，该载体携带cmv强启动子，能在真核细胞中过表达其携带的基因，同时该载体带有绿色荧光蛋白可用于筛选阳性细胞，经筛选，最终得到能够直接感染真核细胞的腺病毒，从而实现了b646l在真核细胞中正常表达的目的，为进一步研究基于表达b646l重组腺病毒载体疫苗打好基础。附图说明图1为实施例5中重组腺病毒载体pad-b646l的paci酶切线性化图，1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳显示两条带，一条为3kb或5kb左右，一条30kb左右，根据重组机制的不同，酶切后条带大小不同；图2是本发明实施例5中质粒转染一周后细胞的荧光表达图；图3是本发明实施例5中质粒转染一周后细胞cpe图；图4为本发明的pko-fh载体结构图；图5为本发明的pad-ef1α-gfp载体结构图。具体实施方式本发明对所述混合的方法没有特殊限制，采用的培养方案没有特殊限制。本发明中，所述过滤的方法优选采用微滤。所述微滤的孔径优选为0.2μm。本发明中，所述离心的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的细胞离心方案即可。本发明中，所述细胞系的种类优选为hek293细胞。本发明提供了一种非洲猪瘟病毒b646l基因重组腺病毒及其构建方法，以pad-ef1a-gfp腺病毒表达载体为基础，引入b646l基因；所述b646l基因具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列。实施例1非洲猪瘟病毒b646l基因geneid:kj195685.1，非洲猪瘟病毒b646l基因，由上海生工有限公司合成并加入酶切位点xhoi、asisi，合成的b646l基因连接于t载体上，获得带有b646l片段的t载体。实施例2用限制性内切酶asisⅰ和mluⅰ分别对基因合成序列b646l(即带有b646l片段的t载体)和腺病毒穿梭质粒载体pko-fh(图4)进行双酶切，分别得到线性化b646l基因片段和pko载体片段。双酶切反应的酶切反应体系如下表1：表1双酶切体系b646l基因片段或pko-fh载体20ul10×buffer3μlasisⅰ1μlmluⅰ1μlddh2o5μl总计30μl所述双酶切的温度为37℃，所述双酶切的时间为1小时。反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小，并用胶回收试剂盒回收目的片段。载体pko-fh做同样的酶切，胶回收载体序列。实施例3用t4连接酶将线性化b646l基因片段和pko载体片段进行连接，得到pko-b646l。连接体系如下表2：表2连接体系目的基因b646l片段2～6μlpko载体片段2～4μl10×t4buffer1μlt4dna连接酶(10u/μl)1μl总计10μl混匀后微离心，22℃连接2h。将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。涂布于含卡那霉素抗性的lb平板进行筛选，挑取单个菌落，扩大培养后提取质粒，asisⅰ和mluⅰ双酶切鉴定阳性克隆，并测序验证，获得正确的pko-b646l克隆，使用cmv-f(seqno.2:5’caatgggagtttgttttggcacca-3’)与fh-r(seqno.3:5’cttattagtggtggtggtggtggtgctcg-3’)进行测序。转化过程如下：(1)从-80℃取出提前制备好的dh5a感受态置于冰浴中。(2)待dh5a感受态细胞融化后，取1μl连接产物于20μldh5a感受态细胞中，充分混匀，冰浴中静置30分钟。(3)将离心管放入42℃水浴锅中40秒(期间不要摇动离心管)，然后快速移至冰浴中，静置2分钟。(4)向离心管中加入200μl的无菌的lb培养基(不加抗生素)，混匀后置于摇床中37℃，200rpm，振摇1小时。涂布到卡那霉素抗性的固体培养基平皿中。(5)37℃培养箱中培养过夜。实施例4用限制性内切酶pi-sce和i-ceu分别对连接产物pko-b646l和腺病毒pad-ef1α-gfp载体(图5)双酶切线性化，胶回收相应片段。连接酶连接b646l基因片段和pad载体片段，将连接产物转化大肠杆菌扩增，而后提取质粒，鉴定正确后获得pad-b646l。双酶切的反应体系如下表3：表3双酶切反应体系所述双酶切的酶切程序如下表4：表4双酶切反应程序连接酶连接b646l基因片段和pad载体片段时，连接体系如表5所示：表5连接体系目的基因b646l片段2～6μl腺病毒pad载体片段2～4μl10×t4buffer1μlt4dna连接酶(10u/μl)1μl总计10μl将提取的质粒(pad-b646l)用pacⅰ单酶切(线性化酶切)后，线性化重组质粒与pei混匀离心，静置，加入dmem培养基。单酶切反应体系如表6。表6单酶切反应体系重组质粒pad-b646l20μl(约2-3μg)10×buffer5μlddh2o24.5μlpacⅰ0.5μl总计50μl单酶切反应条件：37℃，3hr；95℃，5min，50μl体系。将重组腺病毒质粒载体混合液转染hek293细胞，病毒包装完成，即得到含有b646l基因重组腺病毒(图2和图3)。由图2和图3可知，重组病毒包装成功。转染过程如下：1.250μldmem和8μlpei配成mix1，静置5min以上。2.250μldmem和单酶切后的重组质粒配成mix2。3.将mix1和mix2混合，震荡混匀，离心后静置30min。4.静置期间铺6孔板hek293细胞，细胞数约0.3-0.5×106个/孔。5.将静置后的混合液逐滴加入至6孔板的细胞中。十字混匀后置于co2培养箱中培养。在以上技术方案中，所述pko-b646l质粒双酶切后回收的条带大小为目的基因b646l基因序列大小加上1.2kb。在以上技术方案中，所述连接酶为t4dna连接酶，所述大肠杆菌为dh5α大肠杆菌；在以上技术方案中，所述hek293细胞装于10cm细胞盘中，十字摇匀后置于co2培养箱培养2-3天。实施例5观察转染后细胞的cpe出现情况，将出现cpe的细胞进行扩增，收毒。步骤如下：1)将六孔板中有cpe的细胞连同培养基吹下加入10cm盘中，摇匀后置于co2培养箱中培养，2-3天后收毒。2)收集具有cpe效应的10cm盘细胞，用电动移液枪移至15ml离心管中，并做好相应的标记；3500rpm，离心7min；3)离心完成后，取出离心管，倒掉上清(需要大量扩增的病毒需要将上清倒入一个新的15ml管中备用，短时间保存可以放在4℃冰箱中，长时间保存需要放在-80℃冰箱中)，残余部分用200μl枪吸干净。然后沉淀用1ml的1╳a195回溶；4)用a195不断地吹打沉淀，保证完全回溶，然后分别吸到1.5mlep管中，并做好相应标记；5)将准备好的ep管放入干冰中冻6-10min，然后放入干式恒温器中，设置温度为37.0℃，待到管中残余一点冰块的时候取出用手颠倒混匀，如此反复冻融四次；6)冻融完成后，ep管12000g离心2min；7)将上清用1ml枪移到管中，然后存放于-80℃的冰箱中。实施例6将收集起来的病毒上清进行大量扩增及收毒，步骤如下：1)将收集起来的病毒上清平均滴加到10个10cm盘中，混匀后置于co2培养箱中培养，2-3天后收毒。2)收集具有cpe效应的10个10cm盘细胞，用电动移液枪分别移至50ml离心管中，并做好相应的标记；3)3500rpm，离心7min，分别收集上清和细胞沉淀；4)病毒上清中加入nacl和peg8000后摇匀，每30min摇匀一次，共摇三次，4℃直立放置过夜。细胞沉淀置于-80℃保存，后续实验用。实施例7将病毒上清及细胞沉淀的纯化前的处理。1.病毒上清处理(1)将4℃过夜的上清离心，3500g，4℃，离心30min；(2)离心后弃掉上清，收集病毒沉淀；(3)用2mla195将病毒沉淀重悬，收集到15ml管中。2.细胞沉淀处理(1)细胞沉淀用6mla195重悬，混匀，反复冻融四次。冻融时把样品放在干冰中冻12-15分钟，然后拿到37℃水浴锅中融2-3分钟，如此反复四次；(2)冻融完毕后，3500g，4℃，离心30min，分别收集上清和沉淀(细胞碎片)；(3)上清与重悬后的病毒沉淀混合；细胞碎片用2mla195重悬后加入0.5ml5mol/lnacl至终浓度为1mol/l。3.超声破碎细胞(1)重悬后的细胞碎片超声破碎3-4次(ampl值为30％，30s/次，每次间隔20-30s)，至液体不粘稠；(2)超声完毕后，将液体分装到2个ep管中，12000rpm，4℃离心10min；(3)离心完后，超声破碎细胞步骤获得的样品与病毒上清(病毒上清处理获得的产物、细胞沉淀处理步骤中获得的上清)和细胞沉淀处理后的样品(细胞沉淀处理步骤获得的细胞碎片重悬后产物)混合。实施例8病毒纯化与浓缩，具体步骤如下：纯化：1)用电动移液器在50ml离心管中逐层加入不同浓度的碘克沙醇。先加入60％碘克沙醇层4.2ml，再加入40％碘克沙醇层5ml，其次加入25％碘克沙醇层6ml，最后加入15％碘克沙醇层9ml。碘克沙醇溶液的浓度为质量浓度，溶剂为150mmol/lkcl、30mmol/lmgcl2、120mmol/l三甲基甘氨酸的koh溶液，ph7.8。2)将处理好的病毒液加入到最上层，48000rpm离心2小时30分钟。离心前应将对应的离心管配平，误差控制在0.1g以内。浓缩：(1)离心完毕后，将超滤管底用针头刺破，弃掉前5ml，收集第6ml到第10ml溶液至15ml管中。(2)将收集的5ml液体用pbs+pf68稀释至体积15ml，然后用0.20μm的滤膜过滤。(3)将过滤后的液体置于一个15ml的超滤管中，3500g离心50min。如果超滤管中剩下的液体体积还不到理想体积，需要将离心下去的液体弃掉，向超滤管中加入pbs+pf68稀释，再次离心。时间长短可以根据溶液的粘稠程度而定。(4)将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，最后加入5×a195储存液至储存液终溶度为1×，标明名称和日期。(5)将收集起来的病毒涡旋震荡混匀后离心，吸10μl病毒液进行滴度检测。所述的5×a195为含30％胎牛血清的dmem培养基，pf68为含10％甘油、10％dmso的dmem，百分比为质量分数；pbs、pf68的混合液中，pbs、pf68体积比为1：1，其中pbs溶液：nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l。选取的a195、pf68配方，使得对病毒损伤小。实施例9对已制备好的病毒进行滴度检测，具体步骤如下：1)去除病毒外壳，各组成体系如下表7：表7滴度检测组成成分组成成分体积病毒液5μl蛋白酶k(5μg/μl)1μl超纯水4μl37℃孵育30min，然后95℃维持5min使酶失活。2)12,000rpm离心2min，取上清。3)设置7个梯度稀释浓度分别为：2.58╳1012vp/μl，2.58╳1011vp/μl，2.58╳1010vp/μl，2.58╳109vp/μl，2.58╳108vp/μl，2.58╳107vp/μl，并将超纯水作为阴性对照。4)pcr检测，总共20μl体系，具体反应体系如下表8：表8滴度检测具体反应体系所述步骤4)中pcr如下95℃5min；95℃15sec；60℃15sec；72℃15sec；40个循环。5)病毒颗粒数(个/ml)＝与标准品相对值×1000。病毒颗粒数检测结果为3.1╳109pfu/μl。实施例10病毒特异性检测，具体步骤如下：1)去除病毒外壳，各组成体系如下表9：表9特异性检测组成成分组成成分体积病毒液5μl蛋白酶k(5μg/μl)1μl超纯水4μl37℃孵育30min，然后95℃维持5min使酶失活。2)12,000rpm离心2min，取上清。3)pcr反应，总共20μl体系，具体反应体系如下表10：f、r引物分别有特异性引物与通用引物，两者pcr体系一样；表10pcr反应体系所述步骤3)中pcr反应程序如下：95℃4min；95℃30sec；64℃45sec；72℃1min1cycles95℃30sec；62℃45sec；72℃1min2cycles95℃30sec；60℃45sec；72℃1min3cycles95℃30sec；58℃45sec；72℃1min26cycle72℃10min；4℃无限。4)pcr产物跑胶，胶回收测序。pcr产物跑胶，扫胶，比对条带大小，若特异性引物的pcr产物条带不明显，稀释通用引物的pcr产物：加超纯水3倍测序，比对序列。将pcr产物与b646l序列进行序列比对，结果为同源性100％。以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表<110>扬州大学<120>一种表达非洲猪瘟病毒b646l基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法<130>xhx2018032701<141>2018-03-27<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1938<212>dna<213>africanswinefevervirus<400>1atggcatcaggaggagctttttgtcttattgctaacgatgggaaggccgacaagattata60ttggcccaagacttgctgaatagcaggatctctaacattaaaaatgtgaacaaaagttat120gggaaacccgatcccgaacccactttgagtcaaatcgaagaaacacatttggtgcatttt180aatgcgcattttaagccttatgttccagtagggtttgaatacaataaagtacgcccgcat240acgggtacccccaccttgggaaacaagcttacctttggtattccccagtacggagacttt300ttccatgatatggtgggccatcatatattgggtgcatgtcattcatcctggcaggatgct360ccgattcagggcacgtcccagatgggggcccatgggcagcttcaaacgtttcctcgcaac420ggatatgactgggacaaccaaacacccttagagggcgccgtttacacgcttgtagatcct480tttggaagacccattgtacccggcacaaagaatgcgtaccgaaacttggtttactactgc540gaataccccggagaacgactttatgaaaacgtaagattcgatgtaaatggaaattcccta600gacgaatatagttcggatgtcacaacgcttgtgcgcaaattttgcatcccaggggataaa660atgactggatataagcacttggttggccaggaggtatcggtggagggaaccagtggccct720ctcctatgcaacattcatgatttgcacaagccgcaccaaagcaaacctattcttaccgat780gaaaatgatacgcagcgaacgtgtagccataccaacccgaaatttctttcacagcatttt840cccgagaactctcacaatatccaaacagcaggtaaacaagatattactcctatcacggac900gcaacgtatctggacataagacgtaatgttcattacagctgtaatggacctcaaacccct960aaatactatcagccccctcttgcgctctggattaagttgcgcttttggtttaatgagaac1020gtgaaccttgctattccctcagtatccattcccttcggcgagcgctttatcaccataaag1080cttgcatcgcaaaaggatt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