本发明涉及一种高通量筛选对左旋多巴合成能力提高的酪氨酸酚裂解酶及其突变体的方法。(二)
背景技术：
：酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenol-lyase,tpl)又名β-酪氨酸酶，它是一类磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’-phosphate,plp)依赖型裂解酶。tpl能够催化l-酪氨酸发生α,β-消去反应，生成丙酮酸、苯酚和氨。此反应为可逆反应，若以邻苯二酚替代苯酚，该酶可催化生成左旋多巴，其催化机理可以用下式表示：左旋多巴是生物有机体中重要的活性物质，是治疗帕金森氏病的主要药物。其治疗帕金森氏病的原理为：左旋多巴的衍生物─多巴胺是治疗帕金森氏病的一种重要的神经递质，但它不能够通过血脑屏障，因此不能通过外在补充多巴胺来治疗帕金森氏病，而左旋多巴能够通过血脑屏障，到达中枢神经系统，并在体内脱羧酶的作用下，转变为多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加，进而发挥治疗帕金森综合症的作用。鉴于左旋多巴植物提取方法产能不稳定、步骤复杂，化学合成工序多、成本高、环境污染严重，微生物法合成左旋多巴越来越受到关注。酪氨酸酚裂解酶催化邻苯二酚，丙酮酸和氨合成左旋多巴具有反应条件温和、原子经济性高等显著优势。随着基因工程技术的快速发展，通过酶高通量筛选、分子改造等技术，可以有效提高酪氨酸酚裂解酶催化合成左旋多巴的效率。由于自然界中存在的酪氨酸酚裂解酶种类繁多，酶分子改造所获得的突变文库突变体数量巨大(通常含104～106突变体)，通过传统的色谱等检测手段很难高效地筛选获得催化性能提高的酪氨酸酚裂解酶。因此，建立快速、准确的酪氨酸酚裂解酶高通量筛选方法具有重要意义。(三)技术实现要素：本发明为了克服筛选高活力酪氨酸酚裂解酶周期长、工作量大等难题，提供了一种基于深孔板的微型化培养与基于酶标仪微量化检测的高通量酪氨酸酚裂解酶筛选方法，其机理如下：参与左旋多巴合成的底物丙酮酸钠在强碱溶液中与水杨醛生成一种显色的1,5-双(2-羟苯基)-1、4-戊二烯酮产物，在465nm波长有吸收值。随着丙酮酸钠浓度的降低，颜色从橘红色变为淡黄色。若酪氨酸酚裂解酶的活力越低，说明其合成左旋多巴的能力越弱，丙酮酸钠的剩余浓度越大，则显色反应液颜色越深，若酪氨酸酚裂解酶的活力越高，说明其合成左旋多巴的能力越强，丙酮酸钠的剩余浓度越小，显色反应液颜色越浅。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法，所述方法为：(1)转化反应：将待测菌株(优选含酪氨酸酚裂解酶基因的待测菌株)经发酵培养获得的湿菌体作为待测菌株样品加入底物反应液中，在10-30℃、100-300rpm摇床反应20-120min(优选1mhcl或于95℃下放置5-10min终止反应)，将反应液离心，获得上清液；所述底物反应液终浓度组成为：邻苯二酚2-15g/l，丙酮酸钠2-20g/l，乙酸铵5-50g/l，亚硫酸钠0.1-2g/l，edta-2na0.1-2g/l，磷酸吡哆醛(plp)0.2-2mm，ph7.0-8.0，溶剂为超纯水；(2)显色反应：取步骤(1)上清液加入显色反应液中，室温静置显色，在465nm处测吸光值，根据丙酮酸钠标准曲线，获得上清液中丙酮酸钠的含量，进而获得待测菌株样品中酪氨酸酚裂解酶的活力，从而筛选出对左旋多巴合成能力提高的酪氨酸酚裂解酶高活力菌株；所述显色反应液由10-250g/l氢氧化钠水溶液与水杨醛和超纯水以体积比3:0.1～3:5-10组成；所述标准曲线是在待测菌株检测相同条件下，将底物反应液与含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌转化反应后的上清液进行显色反应，以丙酮酸钠浓度为横坐标，以465nm处吸光值为纵坐标绘制而成。进一步，所述底物反应液终浓度组成为：邻苯二酚4-8g/l，丙酮酸钠4-10g/l，乙酸铵30-50g/l，亚硫酸钠0.5-1g/l，edta-2na1-2g/l，磷酸吡哆醛0.5-1mm，ph7.0-8.0，溶剂为超纯水，更优选底物反应液终浓度组成为：邻苯二酚5g/l、丙酮酸钠5g/l、乙酸铵50g/l、亚硫酸钠1g/l、edta-2na2g/l、plp1mm，溶剂为超纯水。进一步，所述显色反应液由250g/l氢氧化钠水溶液与水杨醛和超纯水以体积比3:0.1:6.7组成。进一步，步骤(2)所述显色反应按如下步骤进行：先后分别加入1ml250g/lnaoh水溶液，200μl步骤(1)上清液，6.7ml超纯水，100μl水杨醛，2ml250g/lnaoh水溶液，混合均匀，构成10ml显色反应体系，室温静置显色，在465nm处测吸光值。进一步，所述丙酮酸钠标准曲线按如下方法制备：(1)转化反应：将含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌湿菌体加入底物反应液中，30℃、150rpm摇床反应5min-5h，定时取样(分别在10、20、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300min时取样)加入1mhcl终止反应后，于3000rpm离心10min，获得不同反应时间的上清液；所述底物反应液终浓度组成为：邻苯二酚5g/l、丙酮酸钠5g/l、乙酸铵50g/l、亚硫酸钠1g/l、edta-2na2g/l、磷酸吡哆醛1mm，溶剂为超纯水，ph7.0-8.0；所述湿菌体加入终浓度为4g/l；(2)显色反应：依次加入1ml250g/lnaoh水溶液，200μl步骤(1)不同反应时间获得的上清液，6.7ml超纯水，100μl水杨醛，2ml250g/lnaoh水溶液，混合均匀，构成显色反应体系10ml，室温下放置2h，用酶标仪于465nm测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以丙酮酸钠转化率为横坐标，获得丙酮酸钠标准曲线。进一步，所述含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌是将seqidno.1所示核苷酸序列的基因导入大肠杆菌获得的。进一步，待测菌株发酵方法为：将待测菌株接种至发酵培养基，在20-37℃，100-300rpm摇床培养6-12h，获得湿菌体；所述发酵培养基组成为：蛋白胨5-20g/l，酵母粉2-10g/l，氯化钠2-10g/l，iptg10-30g/l，溶剂为水，ph值自然。进一步，所述待测菌株在发酵前先进行种子活化培养，再将种子液以体积浓度2-5％的接种量接种至发酵培养基，所述种子活化培养方法为：将待测菌株接种至种子培养基，在30-37℃，100-300rpm摇床培养10-14h，获得种子液；所述种子培养基组成为：蛋白胨5-20g/l，酵母粉2-10g/l，氯化钠2-10g/l，卡那酶素50-100μg/ml，溶剂为水，ph值自然。进一步，所述方法在96孔板中进行反应，所述96孔板均为深孔板，深孔板的硅胶孔垫上孔与深孔板的深孔对应，保证各微孔独立地与外界交换空气。培养基装液量为深孔板孔体积的30％-50％，接种量是发酵培养基体积的20％-50％。进一步，所述方法为：(1)将待测菌株接种于装有种子培养基的深孔板ⅰ中，于30-37℃，100-300rpm摇床培养10-14h，获得种子液；(2)将深孔板ⅰ中的种子液对应地接种到装有发酵培养基的深孔板ii中，于20-37℃，100-300rpm摇床培养6-12h；将深孔板ii放置于孔板离心机，1000-3000×g离心10-30min，弃去上清液；(3)在深孔板ii中加入100-400μl底物反应液，10-30℃，100-300rpm摇床反应20min-2h，加入100-400μl1mhcl终止反应；将深孔板ii放置于孔板离心机，1000-3000×g离心10-30min，获得上清液；(4)向深孔板ⅲ先后分别加入1ml250g/lnaoh水溶液，步骤(3)上清液200μl，6.7ml超纯水，100μl水杨醛，2ml250g/lnaoh水溶液，混合均匀，构成10ml显色反应体系，室温下放置20min-2h进行显色反应，用酶标仪检测465nm处吸光值，根据丙酮酸钠标准曲线获得上清中丙酮酸钠的含量，进而获得重组菌对底物的转化率和活力，当活力高于对照菌株20％以上时筛选获得含酪氨酸酚裂解酶活力提高的菌株。由于酪氨酸酚裂解酶活力越高，反应剩余丙酮酸钠的含量越低，根据丙酮酸钠浓度与吸光值的对应关系获得上清中丙酮酸钠的含量，获得酪氨酸酚裂解酶重组菌合成左旋多巴的能力，当所述活力高于出发菌株的20％以上时，即确定为活力提高的菌株，进行进一步高效液相色谱分析确定。所述待测菌株包括含酪氨酸酚裂解酶基因及其突变基因的重组大肠杆菌，所述酪氨酸酚裂解酶基因序列来源不限。本发明提供一种筛选对左旋多巴合成能力提高的含酪氨酸酚裂解酶菌株的高通量方法，该方法基于左旋多巴合成的底物丙酮酸钠在强碱溶液中与水杨醛生成一种显色的1,5-双(2-羟苯基)-1、4-戊二烯酮产物进行，丙酮酸钠浓度不同，显色程度不同，根据丙酮酸钠浓度与465nm处吸光值的对应关系，快速筛选获得左旋多巴合成能力提高的酪氨酸酚裂解酶及其突变体。与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明所涉及的筛选方法，可以直接高通量筛选获得对左旋多巴合成能力提高的酪氨酸酚裂解酶及其突变体，与传统的高效液相检测方法相比，时间从分析一个样品需要20min,缩短到分析近60个样只需1min，且本发明综合利用多孔板进行菌种的快速培养、发酵，利用酶标仪进行快速测定，具有操作简便、检测快速又经济实惠等优点，容易实现机械化自动化操作，为高效合成左旋多巴的酪氨酸酚裂解酶的快速筛选带来了极大的便利，该高通量筛选方法灵敏有效，与高效液相法相比较，所测得的酶活误差控制在3％以内，且相比于对照菌株酶活提高20％的菌株能直接筛选获得。(四)附图说明图1为酪氨酸酚裂解酶及其高活力菌的高通量筛选流程。图2为高通量筛选过程中丙酮酸钠浓度与吸光值的对应关系。图3为高通量筛选过程中不同底物浓度在不同显色时间内的吸光值随时间变化曲线；丙酮酸钠浓度：0mm(■)，2.5mm(●)，5mm(▲)，10mm(◆)，20mm(▼)，40mm(□)，60mm(○)，80mm(△)，100mm(◇)。图4为不加菌体时模拟反应进程中丙酮酸钠浓度与吸光值的对应关系。图5为加入菌体时反应进程中吸光值和转化率的对应关系。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：本发明实施例所述超纯水超纯水(ultrapurewater)又称up水，是指电阻率达到18mω*cm(25℃)的水。实施例1丙酮酸钠浓度与吸光值的对应关系用超纯水配置0-100mm(0mm、2.5mm、5mm、10mm、20mm、40mm、60mm、80mm、100mm)的丙酮酸钠溶液。反应体系10ml，先后分别加入1ml250g/lnaoh水溶液，200μl不同浓度的丙酮酸钠溶液，6.7ml超纯水，100μl水杨醛，2ml250g/lnaoh水溶液，其中在加入水杨醛后摇匀使其和丙酮酸钠充分反应显色。室温下放置2h，用酶标仪于465nm测定吸光度。以吸光度为纵坐标，丙酮酸钠浓度为横坐标，绘制吸光曲线，结果如图2。丙酮酸钠的浓度越高，吸光值越大，且两者呈线性关系：y＝0.0434x+0.3046，r2＝0.9998。实施例2显色反应时间的确定用超纯水配置0-100mm(0mm、2.5mm、5mm、10mm、20mm、40mm、60mm、80mm、100mm)的丙酮酸钠溶液。反应体系10ml，先后分别加入1ml250g/lnaoh水溶液，200μl不同浓度的丙酮酸钠溶液，6.7ml超纯水，100μl水杨醛，2ml250g/lnaoh水溶液，混合均匀。室温下放置，每隔10min取样用酶标仪于465nm测定吸光度，反应时间2h。以吸光度为纵坐标，显色反应时间为横坐标，绘制吸光曲线，结果如图3。表明在显色反应1h以上，吸光值基本趋于稳定。实施例3不加菌体反应体系下，丙酮酸钠浓度与吸光值的对应关系底物反应液(ph7.0-8.0)终浓度组成为：邻苯二酚5g/l、丙酮酸钠(分别为0、1、2.5、5、7.5、10、15、20、30、40g/l)、乙酸铵50g/l、亚硫酸钠1g/l、edta-2na2g/l、磷酸吡哆醛(plp)1mm，溶剂为超纯水。不同浓度丙酮酸钠在30℃、150rpm摇床依次反应30min，分别加入400μl1mhcl终止反应，获得不同浓度丙酮酸钠的反应液。显色反应步骤为：显色反应体系10ml，先后分别加入1ml250g/lnaoh水溶液，200μl不同丙酮酸钠浓度的反应液，6.7ml超纯水，100μl水杨醛，2ml250g/lnaoh水溶液，混合均匀。室温下放置2h，用酶标仪于465nm测定吸光度。分别以吸光度为纵坐标，丙酮酸钠浓度为横坐标，绘制曲线，结果如图4。表明在不加菌体条件下，不同丙酮酸钠浓度下的吸光值和丙酮酸钠浓度成线性关系：y＝0.0282x+0.1630，r2＝0.9973。实施例4添加菌体反应体系下，丙酮酸钠浓度与吸光值的对应关系(1)含有具核梭杆菌来源的酪氨酸酚裂解酶基因重组大肠杆菌的构建：所述含具核梭杆菌来源酪氨酸酚裂解酶基因重组大肠杆菌是将酪氨酸酚裂解酶编码基因(seqidno.1所示)导入大肠杆菌构建获得，具体构建方法参考文献(enzymemicrobtech,2018,266:20-26)。所述的含具核梭杆菌来源酪氨酸酚裂解酶重组大肠杆菌按以下方式培养获得：将重组菌于lb培养基中37℃培养至od600为0.6～0.8后，加入1mmol/l的iptg，28℃下诱导10-12h。培养结束后，离心收集湿菌体，用0.85％生理盐水洗涤2次。(2)底物反应液(ph7.0-8.0)终浓度组成为：邻苯二酚5g/l、丙酮酸钠5g/l、乙酸铵50g/l、亚硫酸钠1g/l、edta-2na2g/l、plp1mm，溶剂为超纯水。具体转化反应步骤为：吸取底物反应液400μl，加入含有具核梭杆菌来源酪氨酸酚裂解酶重组大肠湿菌体(湿菌体加入终浓度为4g/l)，使菌体和底物反应液混合均匀，30℃、150rpm摇床反应5min-5h(分别为10、20、30、40、50、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300min)，加入400μl1mhcl终止反应后，于3000rpm离心10min，取不同反应时间的上清进行显色反应。(4)显色反应显色反应体系10ml，先后分别加入1ml250g/lnaoh水溶液，200μl不同反应时间获得的上清，6.7ml超纯水，100μl水杨醛，2ml250g/lnaoh水溶液，混合均匀。室温下放置2h，用酶标仪于465nm测定吸光度，高效液相色谱法测丙酮酸钠转化率。分别以吸光度为纵坐标，丙酮酸钠转化率为横坐标，绘制曲线，结果如图5。表明在加入菌体条件下，丙酮酸钠转化率与吸光值成线性关系：y＝-0.01076x+1.2423，r2＝1。液相检测条件如下：液相色谱为shimadzulc-16(日本)，色谱柱为：c18柱(welch,5μm×250×4.6mm)；柱温：34℃；流速：1ml/min；进样量：10ml；检测波长：uv210nm；流动相：20mmkh2po4(hcl调ph至2.6)：甲醇＝9:1。实施例5本发明高通量筛选方法与传统高效液相色谱分析方法的对比(1)取实施例4方法获得的含酪氨酸酚裂解酶基因的重组大肠杆菌作为待测菌株涂布于含100ug/ml卡那抗性的lb琼脂培养基，37℃培养12h，获得的单菌落作为待筛选酪氨酸酚裂解酶高活力菌株；(2)无菌条件下，取待筛选酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的单菌落接种于含种子培养基的于96孔板中，活化后待用；(3)将活化后的菌液按体积浓度2％接种于含发酵培养基的于96孔板中，28℃培养10h，1000-3000×g离心30min，得到菌体；(4)在步骤(3)得到菌体的96孔板中加入底物反应液400μl，30℃、150rpm摇床反应，于反应10,20,30,40,50,60min后分别取样，所取样品在95℃下放置5-10min终止反应，3000×g离心10min。上述底物反应液(ph8.0)终浓度组成为：邻苯二酚5g/l、丙酮酸钠8g/l、乙酸铵50g/l、亚硫酸钠2g/l、edta-2na1g/l、plp1mm，溶剂为超纯水；(5)取步骤(4)离心后的上清液进行显色反应1h，以酶标仪于465nm测定吸光度，上述显色反应体系为10ml，先后分别加入1ml250g/lnaoh水溶液，200μl由步骤(4)不同反应时间所取得的样品离心后的上清液，6.7ml超纯水，100μl水杨醛，2ml250g/lnaoh水溶液，混合均匀。根据实施例4所获得的丙酮酸钠浓度与吸光值对应关系曲线y＝-0.01076x+1.2423，计算获得上清液中丙酮酸钠的含量，进一步获得重组菌对底物的转化率，筛选获得酪氨酸酚裂解酶活力较高的菌株。(6)同时取步骤(4)不同反应时间所取得的样品离心后的上清液同时进行高效液相色谱分析。丙酮酸钠的液相检测条件如下：液相色谱为shimadzulc-16(日本)，色谱柱为：c18柱(welch,5μm×250×4.6mm)；柱温：34℃；流速：1ml/min；进样量：10ml；检测波长：uv210nm；流动相：20mmkh2po4(hcl调ph至2.6)：甲醇＝9:1。在上述色谱条件下，丙酮酸钠的出峰时间为3.37min。取待测上清液稀释20倍，使用高效液相色谱法进行分析，计算重组菌对底物的转化率。本高通量筛选方法与传统高效液相色谱分析方法对比结果如表1，随着反应时间的延长，邻苯二酚转化率提高，丙酮酸钠浓度降低，吸光度下降，且通过显色反应所测得的转化率与高效液相色谱法所测得的转化率正相关，测试方法准确，误差范围在3％之内，证明了96孔板酶标法的可行性。表1相同反应时间下不同方法所测丙酮酸钠转化率的对比通过2种方法检测时间的对比(见表2)，样品前处理的时间差忽略不计。表2本方法、高效液相色谱法检测时间对比本方法高效液相色谱法检测时间(57个样品)/min11140本高通量筛选方法(选用96孔板)，每个样品做三次平行，一块96孔板检测57个样品，检测时间约为1min。高效液相色谱法的程序为每个样品20min，检测57个样品需要约1140min。因此，本发明所建立的高通量筛选方法，大大减少了筛选时间，提高了筛选效率。实施例6对多个未知菌株筛选的验证(1)无菌条件下，取未知待筛选单菌落(含酪氨酸酚裂解酶基金)接种于含种子培养基的96孔板中，活化后待用；(2)将活化后的菌液按体积浓度2％接种于含发酵培养基的于96孔板中，28℃培养10h，1000-3000×g离心30min，得到菌体；(3)在步骤(2)得到菌体的96孔板中加入底物反应液400μl，30℃、150rpm摇床反应，于反应30min后分别取样，所取样品在95℃下放置5-10min终止反应，3000×g离心10min。上述底物反应液(ph8.0)终浓度组成为：邻苯二酚5g/l、丙酮酸钠8g/l、乙酸铵50g/l、亚硫酸钠1g/l、edta-2na2g/l、plp1mm，溶剂为超纯水；(4)取步骤(3)离心后的上清液进行显色反应1h，以酶标仪于465nm测定吸光度，上述显色反应体系为1ml，先后分别加入100μl250g/lnaoh水溶液，20μl由步骤(3)不同反应时间所取得的样品离心后的上清液，670μl超纯水，10μl水杨醛，200μl250g/lnaoh水溶液，混合均匀。根据实施例4所获得的丙酮酸钠浓度与吸光值对应关系曲线y＝-0.01076x+1.2423，计算获得上清液中丙酮酸钠的浓度，进一步获得重组菌对底物的转化率，获得酪氨酸酚裂解酶活力较高的菌株。(5)取步骤(3)所取得的样品离心后的上清液同时进行高效液相色谱分析。丙酮酸钠液相检测条件如下：液相色谱为shimadzulc-16(日本)，色谱柱为：c18柱(welch,5μm×250×4.6mm)；柱温：34℃；流速：1ml/min；进样量：10ml；检测波长：uv210nm；流动相：20mmkh2po4(hcl调ph至2.6)：甲醇＝9:1。在上述色谱条件下，丙酮酸钠的出峰时间为3.37min。取待测上清液稀释20倍，使用高效液相色谱法进行分析，计算未知菌对底物的转化率。表396孔板第一行12株未知菌株不同方法所测丙酮酸钠转化率的对比对待测菌株进行高通量筛选，结果显示，通过本发明所建立的显色反应测得的转化率与高效液相色谱法所测得的转化率正相关，测试方法准确。本发明所涉及的酪氨酸酚裂解酶来源，不仅限于实施例所提到的具核梭杆菌来源酶，而是对其他来源的酪氨酸酚裂解酶及其突变体普遍适用。本发明不受上述具体文字描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内作各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。序列表<110>浙江工业大学<120>一种酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量筛选方法<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1383<212>dna<213>未知(unknown)<400>1atgagatttgaagattatccagcagagccatttagaattaaaagtgtagaaactgttaaa60atgattgataaggcagcaagagaagaagtaattaaaaaagcaggatataatactttctta120attaactctgaagatgtttacattgatttattaactgatagtggaactaatgctatgagt180gataaacaatggggtggattaatgcaaggtgatgaagcttatgcaggaagtagaaatttc240ttccacttagaagaaactgtaaaagaaatatttgggtttaaacatatagttcctactcac300caaggaagaggagcagaaaatattttatctcaaatagctataaaacctggacaatatgtt360cctggaaatatgtattttacaactactagatatcaccaagaaagaaatggtggaatattt420aaagatattatcagagatgaggcacatgatgctactcttaatgttcctttcaaaggagat480attgacttaaataaattacaaaaattaatagatgaagttggagcagaaaacattgcttat540gtttgtttagctgtaactgtaaaccttgctggtggacaaccagtttctatgaaaaatatg600aaagcagttagagaactaactaaaaaacatggaataaaagttttctatgatgcaactaga660tgtgttgaaaatgcttacttcattaaagaacaagaagaaggatatcaagataaaactata720aaggaaatagtgcatgaaatgtttagctatgctgatggatgtactatgagtggtaaaaaa780gattgtcttgttaatataggtggatttttatgtatgaatgatgaagatttattcttagct840gcaaaagaaatagttgttgtttatgaaggtatgccatcttatggtggacttgctggtaga900gatatggaagctatggcaatagggttaagagaatctttacaatatgaatacattagacat960agaattttacaagttagatacttaggagaaaaattaaaagaagctggtgtacctatactt1020gaaccagttggaggacatgctgtattcctagatgctagaagattctgtcctcatatccca1080caagaagaattcccagctcaagctcttgcagcagctatctatgttgaatgtggtgtaaga1140actatggaaagaggaataatttctgctggtagagatgtaaaaactggtgaaaaccataaa1200cctaaactagaaactgttagagttactattccaagaagagtttatacttataaacatatg1260gatg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