本发明涉及天然产物提取领域，具体涉及一种从密蒙花中同时提取苯乙醇苷和黄酮类化合物的方法。
背景技术：
密蒙花(buddlejaofficinalismaxim)为马钱科醉鱼草属植物密蒙花的干燥花蕾及花序。其味甘，性微寒，归肝、胆经，具有疏风清热，养肝明目，退翳的功效，用于目赤肿痛，多泪羞明，眼生翳膜，肝虚目暗，视物昏花等症。临床上主要用于干眼症、糖尿病视网膜病变、结膜炎等眼部疾病，疗效显著。研究表明，密蒙花中富含苯乙醇苷和黄酮类成分，含量显著高于其它成分，前者包含毛蕊花苷、异毛蕊花苷、毛柳苷、松果菊苷、连翘酯苷b等；后者包含蒙花苷、密蒙花新苷、刺槐素、木犀草素、芹菜素等，其中毛蕊花苷和蒙花苷含量突出，显著高于其它成分，密蒙花中苯乙醇苷类和黄酮类成分均具有抑菌活性，能抑制醛糖还原酶，有效缓解糖尿病视网膜病变；黄酮类也可有效治疗雄激素水平下降所致的干眼症，可见苯乙醇苷类和黄酮类成分是密蒙花发挥临床疗效的物质基础。
技术实现要素：
本发明的目的在克服现有技术的缺陷，提供一种利用大孔树脂同时分离纯化密蒙花中苯乙醇苷和黄酮两个有效部位的最佳工艺，以获得最佳洗脱率和纯度的毛蕊花苷和蒙花苷，为密蒙花中药新药有效部位研究和生产提供参考。
具体而言，本发明提供了一种从密蒙花中同时提取苯乙醇苷和黄酮类化合物的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)取密蒙花乙醇提取物，上样于hpd-bjqh型大孔树脂，水洗至无色后，以体积百分比浓度为70～80％的乙醇水溶液为流动相进行洗脱，收集洗脱液，浓缩后得浓缩液；
(2)将所述浓缩液上样于hpd-100型大孔树脂，水洗至无色后，依次用体积百分比浓度分别为10～15％、25～30％、32～38％以及65～75％的乙醇水溶液洗脱；
收集所述浓度为25～30％的洗脱液，即为苯乙醇苷的有效部位；
收集所述浓度为65～75％的洗脱液，即为黄酮类化合物的有效部位。
本发明提供的方法创造性地采用hpd-bjqh和hpd-100大孔树脂联用技术对密蒙花中苯乙醇苷和黄酮有效部位进行分离纯化。
对于密蒙花而言，毛蕊花苷和蒙花苷是该植物中苯乙醇苷类化合物和黄酮类化合物中的典型代表，因此，本发明提供的方法以毛蕊花苷和蒙花苷相对生药的含量、洗脱率、纯度及洗脱液总固物得率等参数为评价指标。
本发明通过大量实践发现，hpd-100型大孔树脂能有效地洗脱分离密蒙花中苯乙醇苷和黄酮有效部位，尤其是对毛蕊花苷以及蒙花苷的洗脱率和提纯效果优异，较其他常见的类似大孔树脂(如hpd-300、x-5、ab-8大孔树脂)对二者的分离效果好。但如果仅采用单一的hpd-100型大孔树脂进行分离纯化，目标产物的保留率较低，纯度也达不到50％；而hpd-bjqh型大孔树脂虽然分离毛蕊花苷和蒙花苷效果不佳，但是采用浓度70～80％的乙醇可同时将二者进行洗脱，洗脱率均达80％以上，且除杂效果较好，可有效除杂且保留有效成分。因此，本发明创造性地采用hpd-bjqh型大孔树脂先进行初步纯化除杂后，再采用hpd-100大孔树脂最佳洗脱工艺分离纯化苯乙醇苷和黄酮有效部位。在采用hpd-100型大孔树脂进行洗脱时，本发明先采用10～15％的乙醇溶液进行第一次除杂，然后收集浓度为25～30％的洗脱液为苯乙醇苷的有效部位；再采用32～38％的乙醇溶液进行第二次除杂，然后收集浓度为65～75％的洗脱液为黄酮类化合物的有效部位。
本发明所述密蒙花乙醇提取物是以密蒙花药材为原料，用乙醇采用本领域已知的方法提取而言。作为本发明的优选方案，所述密蒙花乙醇提取物是采用如下方法提取得到：取密蒙花药材，加入体积百分比浓度为55～65％乙醇水溶液提取30～60min，再加入与之前提取相同浓度的乙醇水溶液提取15～45min，合并两次提取所得的提取液，浓缩，即得。优选地，所述密蒙花乙醇提取物是采用如下方法提取得到：取密蒙花药材，第一次加入10倍量60％乙醇溶液提取45min，第二次加入8倍量60％乙醇溶液提取30min，合并滤液，回收乙醇，即得。
本发明对提取过程中的上样量、流动相洗脱体积以及洗脱速度等参数进行全面优选，以同时提高苯乙醇苷和黄酮类化合物的收率和纯度。具体而言：
本发明优选所述步骤(1)中：
上样的乙醇提取物浓度为0.12～0.13g/ml。本发明通过实践发现，当上样液质量浓度在该范围内时，目标产物的洗脱率更高；尤其是，相应洗脱液中毛蕊花苷的洗脱率比浓缩液质量浓度为0.1g/ml或0.2g/ml时毛蕊花苷的洗脱率显著提高了1.5～2倍，能更有效地将毛蕊花苷洗脱下来。
所述密蒙花乙醇提取物的上样量与hpd-bjqh型大孔树脂的质量比为1:1.5～2.5。本发明通过实践发现，当上样量与大孔树脂质量比1:1或1:1.5时，毛蕊花苷和蒙花苷均有泄露，当上样量与大孔树脂质量比达到1.5～2.5时，毛蕊花苷和蒙花苷基本无泄露。
所述流动相洗脱体积为11～13bv。本发明通过实践发现，采用浓度为70～80％的乙醇水溶液经过11～13bv的洗脱可以将两类目标产物均充分洗脱下来。
所述流动相洗脱的流速为2～3bv/h。本发明通过实践发现，随着洗脱剂流速的增大，毛蕊花苷的洗脱率降低，而蒙花苷洗脱率则随着洗脱速率增大先增大后略微降低，而采用2～3bv/h洗脱流速时，毛蕊花苷和蒙花苷的洗脱率无显著性差异。
本发明优选所述步骤(2)中：
上样的浓缩液质量浓度为0.12～0.13g/ml。本发明通过实践发现，当上样液质量浓度在该范围内时，目标产物的洗脱率更高；尤其是，相应洗脱液中毛蕊花苷的洗脱率比浓缩液质量浓度为0.1g/ml或0.2g/ml时毛蕊花苷的洗脱率显著提高了1.5～2倍，能更有效地将毛蕊花苷洗脱下来。
所述浓缩液的上样量与hpd-100型大孔树脂的质量比为1:1.5～2.5。本发明通过实践发现，当上样量与大孔树脂质量比1:1或1:1.5时，毛蕊花苷和蒙花苷均有泄露，当上样量与大孔树脂质量比达到1.5～2.5时，毛蕊花苷和蒙花苷基本无泄露。
所述浓度为10～15％、25～30％、32～38％以及65～75％的流动相的洗脱体积分别为：7～9bv、17～19bv、11～13bv以及11～13bv。采用上述特定的洗脱体积，可以确保采用10～15％以及32～38％的浓度时除杂充分，且采用25～30％以及65～75％的浓度时目标产物被充分洗脱。
所述流动相洗脱的流速为2～3bv/h。本发明通过实践发现，随着洗脱剂流速的增大，毛蕊花苷的洗脱率降低，而蒙花苷洗脱率则随着洗脱速率增大先增大后略微降低，而采用2～3bv/h洗脱流速时，毛蕊花苷和蒙花苷的洗脱率无显著性差异。
作为本发明的一种具体的优选方案，所述方法包括如下步骤：
(1)取质量浓度为0.125g/ml密蒙花乙醇提取物，上样于hpd-bjqh型大孔树脂，上样量与树脂质量比为1:2；水洗至无色后，用12bv体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液的流速进行洗脱，收集洗脱液，浓缩后得质量浓度为0.125g/ml的浓缩液；
(2)将所述浓缩液上样于hpd-100型大孔树脂，上样量与树脂质量比为1:2；水洗至无色后，依次用8bv浓度为12％的乙醇水溶液、18bv浓度为28％的乙醇水溶液、12bv浓度为35％的乙醇水溶液以及12bv浓度为70％的乙醇水溶液溶液以3bv·h-1的流速进行洗脱；
收集所述浓度为28％的洗脱液，即为苯乙醇苷的有效部位；
收集所述浓度为70％的洗脱液，即为黄酮类化合物的有效部位。
本发明所述方案中“bv”代表柱体积，即将大孔树脂填充于色谱柱后的色谱柱体积，实际上等于大孔树脂的体积。
采用本发明提供的经大孔树脂hpd-bjqh和hpd-100对密蒙花进行联合分离纯化后，苯乙醇苷有效部位和黄酮有效部位中毛蕊花苷和蒙花苷保留率均达到80％以上，纯度亦均达到50％以上。
本发明首次以毛蕊花苷和蒙花苷相对生药的含量、洗脱率、纯度及洗脱液总固物得率为评价指标，采用hpd-bjqh型和hpd-100型大孔树脂联用技术对密蒙花中苯乙醇苷和黄酮有效部位进行分离纯化，获得的工艺稳定可行，为密蒙花中药新药有效部位研究和生产提供参考。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例
本实施例提供了一种从密蒙花中同时提取苯乙醇苷和黄酮类化合物的方法。
本实施例采用的密蒙花乙醇提取物采用如下方法提取得到：取密蒙花药材，第一次加入10倍量60％乙醇溶液提取45min，第二次加入8倍量60％乙醇溶液提取30min，合并滤液，回收乙醇，即得。
所述从密蒙花中同时提取苯乙醇苷和黄酮类化合物的方法具体为：
(1)取质量浓度为0.125g/ml密蒙花乙醇提取物，上样于hpd-bjqh型大孔树脂，上样量与树脂质量比为1:2；水洗至无色后，用12bv体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液的流速进行洗脱，收集洗脱液，浓缩后得质量浓度为0.125g/ml的浓缩液；
(2)将所述浓缩液上样于hpd-100型大孔树脂，上样量与树脂质量比为1:2；水洗至无色后，依次用8bv浓度为12％的乙醇水溶液、18bv浓度为28％的乙醇水溶液、12bv浓度为35％的乙醇水溶液以及12bv浓度为70％的乙醇水溶液溶液以3bv·h-1的流速进行洗脱；
收集所述浓度为28％的洗脱液，即为苯乙醇苷的有效部位；收集所述浓度为70％的洗脱液，即为黄酮类化合物的有效部位。
本实施例进一步对所得苯乙醇苷的有效部位中的毛蕊花苷以及黄酮类化合物中的蒙花苷的含量进行测定。测定条件包括：
a、色谱条件色谱柱：welchromc18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)，梯度洗脱：0～10min，a20％、10～20min，a20％～40％、20～30min，a40％～60％；检测波长：327nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：25℃；进样量：10μl。在上述条件下，毛蕊花苷、蒙花苷的理论塔板数均不低于5000。
b、对照品溶液的配置精密称取毛蕊花苷对照品10.14mg、蒙花苷对照品10.32mg，分别置于100ml棕色容量瓶中，加入适量甲醇溶液超声溶解，冷却，并用甲醇定容至刻度，摇匀，即得毛蕊花苷101.40μg·ml-1、蒙花苷103.20μg·ml-1的对照品储备液。分别移取5.0ml上述对照品储备液于25ml容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，即得毛蕊花苷20.28μg·ml-1、蒙花苷20.64μg·ml-1的混合对照品溶液。
c、供试品溶液的制备分别精密移取洗脱液2.0ml至25ml容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
d、线性关系的考察将上述对照品溶液稀释，得到一系列不同质量浓度的对照品溶液。精密吸取6种浓度的对照品溶液10μl进样，按2.1.1项下色谱条件测定峰面积。以对照品质量浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到毛蕊花苷和蒙花苷的回归方程分别为：y＝11.9923x-21.1340，r＝0.9995(n＝6)；y＝19.3013x+13.1770，r＝0.9999(n＝6)。表明毛蕊花苷和蒙花苷对照品分别在10.14～101.40μg·ml-1、10.32～103.20μg·ml-1范围内，与相应峰面积呈现良好的线性关系。
经检测，经所述方法纯化前的密蒙花乙醇提取物中毛蕊花苷以及蒙花苷的含量、保留度和纯度(作为对照)以及本实施例所得产物中毛蕊花苷以及蒙花苷的含量、保留度和纯度结果如表1所示。
表1：毛蕊花苷以及蒙花苷的含量、保留度和纯度
以上结果表明，本发明提供的方法可以实现对毛蕊花苷以及蒙花苷的有效分离和提纯。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。