本发明属于分子生物学基因多态性检测
技术领域：
，具体涉及一种基因分型检测的试剂盒及方法。
背景技术：
：酒精，也就是乙醇，在人体内的代谢过程主要发生在肝脏，乙醇首先通过乙醇脱氢酶转化为乙醛，乙醛通过乙醛脱氢酶转化为乙酸。乙醛对人体的伤害非常大，是酒精中毒的罪魁祸首，对人体内的各个器官伤害极大，而乙酸对人体基本没有伤害。酒精代谢过程中，乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶是其主要限速酶，代谢的速度快慢直接导致了乙醛在人体内停留的时间长短，也就是对人体伤害的程度大小，而限速酶的活性强弱因人而异，这与编码乙醇脱氢酶的adh1b基因和乙醛脱氢酶的aldh2基因的多态性密切相关。adh1b基因rs1229984位点位点是tt基因型的人群能使乙醇脱氢酶活性变高，乙醇转化为乙醛的代谢加快，同时能够分解与乙醇结构类似的存在于酒精中的毒素，而cc基因型的人群则乙醇脱氢酶活性低，喝进去的乙醇转化为乙醛的速度很慢，表现为酒气大，ct基因型的人群酶活性则正常，代谢正常。aldh2基因rs671位点是aa和ag基因型的人群，乙醛脱氢酶活性较低，将乙醛代谢为乙酸的速度极慢，而gg基因型的人群，乙醛脱氢酶活性高，酒精代谢能力强。因此，检测这两个基因的型别是一件很有意义的事情，可以知道自己对酒精代谢的快慢，从而知道自己是否适合喝酒，避免发生酒精中毒等对自身身体损伤的事件。咖啡因是从茶叶、咖啡果中提取出来的一种生物碱。某些人摄入的咖啡因能很快从体内清除出，不能令人产生特别明显的兴奋感；而对于另外一些人，咖啡因在体内的清除速度很慢，起作用时间也就较长，往往一杯咖啡就会令他们夜不能寐，有的还会影响食欲，呕吐和痉挛；这种现象与咖啡因代谢快慢有关，而cyp1a2基因是参与咖啡因初级代谢过程的主要代谢酶，是细胞色素p450氧化酶的一个亚家族，约占肝脏cyp450s酶含量的13％。研究发现，该位点是aa基因型的人群，其cyp1a2酶活性高，咖啡因代谢快；ac和cc基因型的人群，其cyp1a2酶活性低，咖啡因代谢慢。还有一些研究表明，咖啡因在人体内的积累量与患心血管疾病的风险相关。因此检测咖啡因代谢能力也是一件很有意义的事情。铁是人体内含量最丰富的一种必需元素，存在于所有细胞内。在体内主要参与血红蛋白的合成和氧的输送。铁代谢平衡被破坏会导致人体铁缺乏或铁过载。铁缺乏可以引起缺铁性贫血，铁过载可以引起血色病。tmprss6基因编码跨膜丝氨酸蛋白酶s6，在正常生理情况下，跨膜丝氨酸蛋白酶6通过体内一系列的信号转导通路抑制hamp基因的表达，跨膜丝氨酸蛋白酶6活性降低，则体内铁调素含量增高。hamp是编码铁调素的基因，铁调素是调控小肠上皮细胞铁泵蛋白吸收铁离子的关键分子，当铁调素水平上升时，血清铁水平就会下降，引起缺铁性贫血。研究发现，tmprss6基因上的rs855791位点突变(aa基因型)，导致tmprss6蛋白酶活性降低，潜在影响了铁调素的过多分泌，从而抑制了机体铁的吸收和动员，最终增加人体患铁缺乏或缺铁性贫血的风险。因此检测人体铁的吸收代谢能力也是一件很有意义的事情。目前市场上有对aldh2基因和adh1b基因检测的试剂盒，有cyp1a2基因检测的试剂盒，也有tmprss6基因检测试剂盒。但是方法不一，最多的是基因芯片法，基因芯片法最大的优点是通量大，但是有成本比荧光定量pcr法高，且操作复杂耗时长，有非特异性信号，灵敏度和重复性较差的缺点。还有各种pcr法，如taqman探针水解法，其最大的优点是准确性高，设计简单，但是成本较高，但检测1个snp至少需要两条探针、两种荧光基团，对检测通道有限制。大部分的荧光定量pcr仪只能同时检测5个通道，taq-man探针针水解法只能同时检测2个snp，检测通量小。另外，有中国专利申请cn2017010622578.4公开了一种分子信标法检测aldh2基因rs671的快速检测方法，其淬灭剂为非荧光淬灭剂，且要进行mgb修饰，且检测rs671的两个等位基因用了2条分子信标探针，成本极高。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种基因分型检测的试剂盒及方法，旨在解决现有同时检测人的adh1b、aldh2、cyp1a2和tmprss6四个基因的基因型的成本高、操作繁琐的技术问题。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：本发明一方面提供一种基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括针对adh1b基因rs1229984位点的第一引物对和第一分子信标探针，针对aldh2基因rs671位点的第二引物对和第二分子信标探针，针对cyp1a2基因rs762551位点的第三引物对和第三分子信标探针，针对tmprss6基因rs855791位点的第四引物对和第四分子信标探针；其中，所述第一引物对的核酸序列为seqidno：1和seqidno：2，所述第一分子信标探针的核酸序列为seqidno：3，所述第二引物对的核酸序列为seqidno：4和seqidno：5，所述第二子信标探针的核酸序列为seqidno：6，所述第三引物对的核酸序列为seqidno：7和seqidno：8，所述第三分子信标探针的核酸序列为seqidno：9，所述第四引物对的核酸序列为seqidno：10和seqidno：11，所述第四分子信标探针的核酸序列为seqidno：12；所述第一分子信标探针、第二分子信标探针、第三分子信标探针和第四分子信标探针的5'端连接有荧光报告分子、且3'端连接有猝灭剂。本发明另一方面提供一种基因分型检测的方法，包括如下步骤：提取样本dna；将所述样本dna与本发明的上述试剂盒中的试剂混合，进行多重荧光定量pcr扩增，得到溶解曲线的tm值；根据所述tm值，判断所述样本dna中的adh1b、aldh2、cyp1a2和tmprss6的基因型。本发明的试剂盒旨在针对人体酒精代谢(对应adh1b和aldh2基因)、咖啡因代谢(对应cyp1a2基因)和铁吸收(对应tmprss6基因)的相关基因分型的检测，该试剂盒选用分子信标探针熔解曲线法来进行分型检测，与基因芯片法相比操作简单耗时短，灵敏度高且重复性好，与taqman探针水解法相比，1个snp位点只需要设计1条分子信标探针，省了一倍的成本；利用本发明试剂盒可以快速、简便地检测四种对应基因的基因型及对应的代谢吸收类型。本发明提供的基因分型检测的方法利用本发明的特有的试剂盒进行检测，该方法中通过用多重不对称pcr技术，利用试剂盒中设计的互不影响的4对引物和4条分子信标探针，经过多次调试序列和引物探针浓度比例，优化pcr扩增条件，克服了各个困难，最终成功研发了只需一管试剂便能同时检测这4个基因分型的方法，大大增加了检测的通量和节约了成本。附图说明图1为本发明的试剂盒对人adh1b基因rs1229984位点的熔解曲线检测结果图；图2为本发明的试剂盒对人aldh2基因rs671位点的熔解曲线检测结果图；图3为本发明的试剂盒对人cyp1a2基因rs762551位点的熔解曲线检测结果图；图4为本发明的试剂盒对人tmprss6基因rs855791位点的熔解曲线检测结果图；图5为本发明实施例2中样本jyh的熔解曲线检测结果图；图6为本发明实施例2中阳性对照品的熔解曲线检测结果图；图7为本发明实施例2中阴性对照品的熔解曲线检测结果图。具体实施方式为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。一方面，本发明实施例提供了一种基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括针对adh1b基因rs1229984位点的第一引物对和第一分子信标探针，针对aldh2基因rs671位点的第二引物对和第二分子信标探针，针对cyp1a2基因rs762551位点的第三引物对和第三分子信标探针，针对tmprss6基因rs855791位点的第四引物对和第四分子信标探针；其中，所述第一引物对的核酸序列为seqidno：1和seqidno：2，所述第一分子信标探针的核酸序列为seqidno：3，所述第二引物对的核酸序列为seqidno：4和seqidno：5，所述第二子信标探针的核酸序列为seqidno：6，所述第三引物对的核酸序列为seqidno：7和seqidno：8，所述第三分子信标探针的核酸序列为seqidno：9，所述第四引物对的核酸序列为seqidno：10和seqidno：11，所述第四分子信标探针的核酸序列为seqidno：12；所述第一分子信标探针、第二分子信标探针、第三分子信标探针和第四分子信标探针的5'端连接有荧光报告分子、且3'端连接有猝灭剂。本发明实施例的试剂盒旨在针对人体酒精代谢、咖啡因代谢和铁吸收的相关基因分型的检测，该试剂盒选用分子信标探针熔解曲线法来进行分型检测，与基因芯片法相比操作简单耗时短，灵敏度高且重复性好，与taqman探针水解法相比，1个snp位点只需要设计1条分子信标探针，省了一倍的成本；通过本试剂盒可以快速、简便地检测四种对应基因的基因型及对应的代谢吸收类型。分子信标探针熔解曲线法的原理是：分子信标探针是一段双重标记的寡核苷酸(25～40nt)形成具有一个环和一个自身互补的茎的发夹结构。荧光报告分子在5'端，猝灭剂在3'端。低温条件下，分子信标形成发夹结构，荧光报告分子和猝灭剂分子通过探针自身互补形成的茎结构紧靠在一起，因此抑制了荧光信号。当pcr退火时，如果探针遇到靶dna序列，根据热力学原理，分子信标探针将优先和靶dna结合而不是形成发夹结构，由于茎结构被破坏，荧光报告分子与猝灭剂相互分离，荧光报告分子得以发射荧光。当模板通过不对称pcr扩增获得一定量的单链扩增子后，探针会与单链靶序列特异性杂交，在低温到高温的过程中，双链会逐渐熔解，不同的靶序列有不同的熔解曲线特征，从而可以达到snp单碱基分辨的目的。一般来说，探针与靶序列完全杂交的tm会比错配1个碱基的靶序列的tm值高3.5-10℃左右。分子信标探针熔解曲线法的缺点是探针设计难，有些snp由于附近的gc含量及自身发夹结构的问题，导致设计困难。我们通过调整茎环的位置和碱基的组合，不断优化探针的tm值，gc含量及2级发夹结构，最终针对每个snp设计了只有一种稳定茎环结构的分子信标探针。用该四组特有的引物和分子信标探针制成的试剂盒，可将酒精代谢、咖啡因代谢和铁吸收能力关联性最强的基因放在一起一次性同时检测，方便有需要的人群，一次性完成代谢吸收相关能力的检测；整个过程只需3-4个小时，无需昂贵的设备，非常的快速便捷。而且本试剂盒采用直用型的pcr试剂，直接加模板上机扩增即可，操作非常的简便快速，同时因操作时间短，最大的优势体现在大大提高了检测通量，降低了原材料的成本，缩短了检测的时间，带来了非常可观的经济效益。进一步地，所述荧光报告分子包括hex、texasred、cy5和fam中的至少一种。所述猝灭剂包括bhq1、bhq2和dabcyl中的至少一种。进一步地，所述试剂盒还包括hstaq聚合酶、ung酶、mgcl2，pcrbuffer和duplusdntpmix。优选使用ung酶的技术，大大降低了试剂被环境污染的风险，操作非常的安全，结果可信度也大大增加。更优选地，所述试剂盒还包括阳性对照品和/或阴性对照品。其中，所述阳性对照品包括adh1b的ct型质粒、aldh2的ga型质粒、cyp1a2的ca型质粒和tmprss6的ga型质粒。所述阴性对照品为水。另一方面，本发明实施例提供了一种基因分型检测的方法，包括如下步骤：s01：提取样本dna；s02：将所述样本dna与权利要求1-7任一项所述的试剂盒中的试剂混合，进行多重荧光定量pcr扩增，得到溶解曲线的tm值；s03：根据所述tm值，判断所述样本dna中的adh1b、aldh2、cyp1a2和tmprss6的基因型。多重pcr是在一个反应体系里加入多对特异性引物，针对多个模板或同个模板的不同区域扩增出多个目的片段的pcr技术。一个理想的多重pcr体系，并非是单一pcr的简单混合，而是需要选择各个高度特异性的目的片段和不互相影响各引物对，能够利用同样的扩增条件和试剂达到同时扩增出目的片段的pcr技术，引物对的序列选择、目的片段的选择、pcr扩增条件和试剂的调试优化都是多重pcr技术的难点。不对称pcr则是通过调整上下游引物浓度比例，通常限制性引物：非限制性引物的浓度比是1:5～20；这样使得目的片段中含有非限制性引物扩增出的单链dna，在dna杂交技术中经常使用。引物浓度和引物浓度比例的调试优化是不对称pcr的难点。而本发明实施例中提供的基因分型检测的方法利用本发明的特有的试剂盒进行检测，用多重不对称pcr技术，设计了互不影响的4对引物和4条分子信标探针，经过多次调试序列和引物探针浓度比例，优化pcr扩增条件，克服了各个困难，最终成功研发了只需一管试剂便能同时检测这4个基因分型，大大增加了检测的通量和节约了成本。具体地，可以依据图1、图2、图3、图4和表7对样本dna的检测结果进行判定。进一步地，所述样本dna来自人的全血、口腔上皮细胞、唾液、皮肤和头发中任一一种的全基因组。本发明实施例2中样本是人口腔上皮细胞，而本试剂盒对人dna的样本来源无限制，只要是能够提取出正常的人全基因组即可，比如人的全血，头发，唾液，皮肤等。而所述样本dna的浓度优选为5ng/ul-20ng/ul。本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。实施例1一种分子信标探针法用于人体酒精代谢、咖啡因代谢、铁吸收能力相关基因分型检测的试剂盒。该试剂盒包括：1×pcrmix；阳性对照品；阴性对照品。1×pcrmix包括：1u的hstaq聚合酶，0.5u的ung酶，3.25mm的mgcl2，1×pcrbuffer(20mm(nh4)2so4，10mmtri-hcl，2mmmgcl2)，200um的duplusdntpmix，adh1b基因的上下游引物探针，aldh2基因的上下游引物探针，cyp1a2基因的上下游引物探针，tmprss6基因的上下游引物探针。具体的引物探针序列如下。人adh1b基因rs1229984位点的上下游引物及分子信标探针见下表1。表1人aldh2基因rs671位点的上下游引物及分子信标探针见下表2。表2人cyp1a2基因rs762551位点的上下游引物及分子信标探针见下表3。表3人tmprss6基因rs855791位点的上下游引物及分子信标探针见下表4。表4上述试剂盒中：hstaq聚合酶是购于宝日医生物技术有限公司，hstaq酶具有高保真性，能够保证扩增产物的碱基错配率在测序允许的标准范围内。ung酶是购于宝日医生物技术有限公司，用我们试剂盒扩增的pcr产物中含有尿嘧啶，ung酶能在25℃下将前期不小心引入的扩增产物中尿嘧啶切断，使其不能成为扩增模板，ung酶在95℃下失活，不影响接下来人dna作为模板的扩增，从而有效预防由pcr产物的污染导致的假阳性结果。1×pcrbuffer是由购于上海生工生物工程有限公司的10×pcrbuffer(含(nh4)2so4、20mmmgcl2)稀释10倍得到的。duplusdntpmix是购于宝日医生物技术有限公司，含有datp(2.5mm)，dctp(2.5mm)，dgtp(2.5mm)，dutp(7.5mm)。3.25mm的mgcl2是我们根据多重扩增的效果，自己配制。阳性对照品是自己生产的，分别由合成的adh1b的ct型质粒，aldh2的ga型质粒，cyp1a2的ca型质粒，tmprss6的ga型质粒按照1：1：1：1比例混合，终浓度是各1um。阴性对照品是去离子水。实施例2使用上述实施例1的试剂盒对人口腔样本进行基因检测(假设只有一个待检样本jyh，样本编号jyh)。步骤一：dna提取。步骤二：dna质量检测，要求dna浓度在5ng/ul-20ng/ul，浓度太低可以浓缩，浓度太高需要稀释到要求范围内。要求dna纯度od260/od280的值在1.7-2.0之间。不符合dna质量的样本需要重新采集和dna提取。步骤三：pcr扩增加样：将试剂盒各组分拿出来冻融；准备好荧光可读取的pcr管。按照下表5的组分和体积进行加样，同时对样本jyh，阳性对照品，阴性对照品进行加样，加样后振荡混匀，离心。表5成分加量1×pcrmix23ul样本jyh/阳性对照品/阳性对照品2ul总体积25ul步骤四：上机。使用bioradcfx96荧光定量pcr仪进行扩增和熔解曲线分析，设置的pcr程序，如下表6。表6步骤五：扩增程序后读取熔解曲线的检测结果，按照附图1，图2，图3，图4，以及对应的下表7各基因对应的检测位点、检测通道、tm值范围以及对应的基因型对基因检测结果进行判读。表7最终，该样本jyh的熔解曲线检测结果如图5所示；样本jyh的基因检测结果评价见下表8。正常的扩增结果阳性对照应该有结果，峰型如附图6中的显示一样，阴性对照无结果，峰型如附图7中的显示一样。表8本实施例的数据都是用bioradcfx96荧光定量pcr仪实验获取的，本发明试剂盒可以应用于其他厂家和型号的荧光定量pcr仪，但这些pcr仪必须有fam；hex；texasred；cy5这4个检测通道，且使用其他荧光定量pcr仪，表7的数据会有稍微的差异，但不影响判读，可通过每次实验的阳性对照品进行判断。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>深圳鼎新融合科技有限公司<120>基因分型检测的试剂盒及方法<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctgaatctgaacagcttctctttattct28<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tcatggcctaaaatcacaggaa22<210>3<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ccacgtctgtcgcacagatgaccacgtgg29<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ccccaagagtgatttctgca20<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tcccacactcacagttttcac21<210>6<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ccactggcatacactgaagtgaagtgg27<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7tgatgtgtggaggagagagc20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gctgagggttgagatggaga20<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ccgtgggcccaggacgcacgg21<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10tggcgtcacctggtagcgata21<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11cagagcaggagagaagtaggc21<210>12<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cccggtagcgataggcctcgctgcaccggg30当前第1页12