基于复合编码探针杂交的DNA检测方法及复合编码探针与流程

文档序号:15457527发布日期:2018-09-15 01:32

本发明涉及DNA检测领域,尤其涉及一种基于复合编码探针杂交的DNA检测方法及复合编码探针。



背景技术:

实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR,FQ-PCR)技术最突出的优势是实现DNA扩增和检测的同步进行。该技术具有操作简便、快速高效、高敏感性等特点,已广泛用于分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等诸多研究领域,是快速检测的现代方法之一。

FQ-PCR扩增产物的富集过程既可通过非特异性荧光染料法来标示,也可以采用特异性荧光共振能量转移(FRET)探针技术来实现检测。非特异性荧光染料法尽管成本较低,但无法克服由于PCR非特异性扩增产物干扰造成的假阳性问题,并且由于荧光染料发光波长单一的局限,故而无法实现多重基因靶点的检测,在实际应用中受到了很大限制。

FRET探针本质为一寡核苷酸,其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团后,在特异性扩增产物产生过程中,由于报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而使得荧光监测系统可接收到荧光信号,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步,解决了非特异性扩增带来的假阳性问题。目前至少有5种荧光基团供FRET探针修饰标记,因此借助FRET探针技术实现了FQ-PCR在多重基因靶点依赖的基因分型应用。

目前来看,市场上应用FRET探针的技术主要包括:美国PE公司研制的水解探针(商品名:TaqMan,美国专利No.6,485,203),Epoch公司在水解探针的基础上增加结合效率的MGB探针(美国专利No.7,205,105),以及,分子信标探针(美国专利No.5,225,517)。

水解探针具有灵敏度高、重现性好等特点,但是由于本身检测区域的限制,原则上无法对特定靶点进行专一性识别。而分子信标探针基于其独特的空间结构,具有高度的靶点检测特异性,但其在PCR过程中存在退火不完全进而导致其检测灵敏性有限。同时,FRET探针技术也受到现有PCR检测仪器检测荧光通道的数量限制,目前的PCR检测仪器能同时检测5种荧光基团,理论上最多能够同时检测5种靶序列。因此,亟待人们通过技术创新去解决FQ-PCR检测容量低的问题。

中国发明专利申请(No.CN106121214A):一种多色荧光熔解曲线的PCR检测方法,该专利公开了一种单色或双色多重FQ-PCR技术,其本质为一种PCR终点多靶点分析的检测方式。该类技术在无法实现扩增和检测的同步的同时,也受到“假阳性”熔解峰的干扰,其最高检测靶序列数还受到分析温度范围的限制。靶序列富集多重PCR技术(TEM-PCR),借助巢式PCR再通过流式荧光技术(xMAP)将核酸芯片技术和流式荧光检测技术有效地结合在一起,很大程度解决了多重基因靶点依赖的基因分型应用难点。但该技术具有对特定仪器的依赖性、检测流程繁琐、易造成扩增产物污染等诸多缺点。中国发明专利申请(No.CN1936019A):用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法,该专利公开的方案克服了上述技术的缺点,但其探针合成修饰存在技术不稳定性,检测成本也相应增高。



技术实现要素:

本发明的目的在于克服现有的DNA检测技术中检测容量小的不足,并提供一种快速简单、成本低、非仪器依赖性、多重检测能力更强的DNA检测方法,即通过提供一种复合编码探针从而实现该检测方法可多重实时检测的靶点数目明显多于目前仪器可检测的荧光通道数目。

为实现上述目的,本发明的第一方面提供了一种基于复合编码探针杂交的DNA检测方法,包括以下步骤:

a.根据待测靶标基因的特异性序列合成一条或多条复合编码探针;

所述复合编码探针为由第一子探针和第二子探针部分配对所形成的一双发卡结构的核酸序列,其包含:loop环状区、茎末端区和修饰基团区;

所述第一子探针和第二子探针上位于茎末端区的碱基序列相互配对,所述第一子探针和第二子探针上位于loop环状区的碱基序列分别与待测靶标基因的正义链和反义链的不同区域的碱基序列构成互补序列;

所述修饰基团区的数量为二,该修饰基团区包括相配合的荧光基团和淬灭基团;

b.根据待测靶标基因的特异性序列合成上游引物和下游引物;

c.采用上述获得的探针和引物构建反应体系,对待测靶标基因进行PCR扩增;

d.在PCR扩增反应结束后,收集PCR产物的荧光信号以形成相应的扩增曲线,对待测靶标基因进行分析。

图1示出了本发明复合编码探针的结构,参考图1,所述复合编码探针1由第一子探针11和第二子探针12部分配对而成,进一步的,其包含:loop环状区2、茎末端区3和修饰基团区4。

第一子探针11和第二子探针12上位于茎末端区3的碱基序列相互配对,以实现上述第一子探针和第二子探针的部分配对;而位于loop环状区1的碱基序列分别与待测靶标基因的正义链和反义链的不同区域的碱基序列构成互补序列,这使得第一子探针和第二子探针在下述PCR扩增反应时,loop环状区的序列能较大概率地与待测靶标基因的特异性序列进行配对结合,否则,第一子探针11和第二子探针12位于该loop环状区1的碱基序列会自行配对,则会降低探针与待测靶标基因结合的概率,使得检测无法进行。所述修饰基团区4的数量为二,该修饰基团区包括相配合的荧光基团和淬灭基团。所述荧光基团和淬灭基团的作用机理与现有荧光探针的基团发光机理相似,即当荧光基团和淬灭基团相互靠近时,会发生荧光共振能量转移(FRET),荧光基团发出的信号被淬灭基团吸收;而在荧光基团与淬灭基团分离时,荧光基团发出相应波长的荧光,并被PCR仪器检测。

这样,根据待测靶标基因可能存在的不同的特异性序列,可合成一个或多个复合编码探针,利用该复合编码探针构建PCR反应体系,对待测靶标基因进行PCR扩增:

(1)在每一轮PCR扩增反应的变性步骤中,不仅存在着DNA双链的解链,所述复合编码探针的茎末端区也进行了相应的解链;

(2)经过变性步骤之后,在退火步骤,解链后的第一子探针和第二子探针位于loop环状区的碱基序列识别待测靶标基因上对应的特异性序列,上游引物和下游引物也识别待测靶标基因上相应的特异性序列;

(3)在延伸步骤中,通过体系中DNA聚合酶的作用,上游引物和下游引物开始延伸,形成双链DNA产物;同时,荧光基团和淬灭基团相互分离,发出对应波长的荧光;

(4)随后进入下一轮PCR扩增反应中,并直到循环结束。在PCR扩增反应结束后,收集PCR产物所产生的荧光信号以形成相应的扩增曲线,并对待测靶标基因进行分析。

在以上过程中,由于第一、第二子探针部分配对,且包含两组相配合的荧光基团和淬灭基团,在未发生解链的状态下,由于荧光基团和淬灭基团距离较近,不会发出荧光信号,因而该形成的复合编码探针结构稳定;而在延伸步骤中,由于两个修饰基团的荧光基团均能发出对应波长的荧光,因此该复合编码探针的特异性信号即为该两个荧光基团发出的荧光信号的组合,从而在具有相同数量荧光通道检测能力的PCR检测仪器的情况下,扩充了特异性信号的种类差异性,且该种类差异性并未对PCR检测仪器提出更高的要求,从而可以根据复合编码探针具有的不同的荧光信号的组合,对待测靶标基因进行检测分析,克服了现有技术中的荧光探针只能携带1个荧光基团和1个淬灭基团,因而特异性信号的种类即对应于PCR检测仪器能检测的荧光通道的数量,在相同情况下,提高了检测容量,仪器依赖性低,多重检测能力好,检测效率高。

在某一实施例中:所述茎末端区的数量为二,所述loop环状区的两端分别连接所述两个茎末端区,该两个茎末端区的另一端分别连接所述两个修饰基团区,使得两个修饰基团区位于复合编码探针的两端。

在某一实施例中:所述两个修饰基团分别为第一修饰基团和第二修饰基团;第一修饰基团和第二修饰基团的所包含的两个荧光基团分别位于同一子探针上的5'端和3'端。

在某一实施例中:所述两个修饰基团分别为第一修饰基团和第二修饰基团;第一修饰基团和第二修饰基团的所包含的两个荧光基团分别位于不同的子探针上的5'端或3'端。

上述关于两个荧光基团位置的不同实施例,分别对应于图2a和图2b所示出的情况。

在某一实施例中:所述第一荧光基团和第二荧光基团分别采用以下所述基团中的一种,其包括但不限于:ALEXA350、FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Texas Red、Cy5、Cy5.5、TAMRA;所述第一淬灭基团和第二淬灭基团分别采用以下所述基团中的一种,其包括但不限于:Dabcyl、BHQ-1、BHQ-2、QYS-7。

在某一实施例中:所述第一子探针和第二子探针为可用于FQ-PCR的荧光探针,可采用以下探针中的一种,其包括但不限于:水解探针、MGB探针、分子信标探针、置换探针、蝎子引物、Amplifier引物,从而,复合编码探针可基于现有荧光探针的基础上改进,设计成本低。

在某一实施例中:所述loop环状区的长度为包括15-40个碱基对;所述茎末端区的长度为包括6-20个碱基对,从而保证双发卡结构稳定。

在某一实施例中:第一子探针和第二子探针上位于所述的茎末端区的碱基序列与待测靶标基因的特异性序列不相关,从而防止茎末端区的碱基序列与待测靶标基因的特异性序列发生配对,干扰检测结果。

在某一实施例中:所述步骤c中的PCR扩增,其变性温度为95℃、退火温度为60℃、延伸温度为72℃。

基于以上的发明精神,为实现上述目的,本发明的第二方面提供了一种复合编码探针,适用于基于聚合酶链式反应的DNA检测方法,所述复合编码探针是上述的技术方案中的复合编码探针。

附图说明

图1为本发明一实施方式中复合编码探针的结构示意图,其中具有填充图样的圆点代表荧光基团,不具有填充图样的圆点代表淬灭基团;

图2a为本发明一实施方式中两荧光基团所处位置的示意图,其中具有填充图样的圆点代表荧光基团,不具有填充图样的圆点代表淬灭基团;

图2b为本发明另一实施方式中两荧光基团所处位置的示意图,其中具有填充图样的圆点代表荧光基团,不具有填充图样的圆点代表淬灭基团;

图3a示出了实施例一中待测样本的梯度稀释扩增曲线;

图3b示出了实施例一中待测样本的梯度稀释扩增曲线的Ct值与DNA起始拷贝数的对数关系曲线;

图4a-4d分别示出了实施例二中待测样本中仅含有四种亚型HPV病毒中的任意一种时对应的扩增曲线。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例选择人体ALDH2基因(Gene ID:217)为待测靶标基因,根据本发明之相应精神,设计相应的引物和复合编码探针的具体序列如下,其中组成复合编码探针的第一子探针和第二子探针分别以探针P1和探针P2表示(下同):

上游引物:5'-GCCCAGTCACCCTTTGGT-3'

下游引物:5'-GACCCTCAAGCCCCAACA-3'

探针P1:5'-ROX-AATCGCGGGGTTTTGTCGGGGAGTGGCCGGGAGTTTGCGCTGACGA-FAM-3'

探针P2:5'-BHQ1-TCGTCAGCGCAAAGGACCTGCTGGGGGCTCAGGAAACCCCGCGATT-BHQ1-3'

选择用量为1×108copies/μL、1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL(即为10倍梯度稀释)的ALDH2基因质粒标准品作为反应模板。10μL的PCR反应体系内含有2μL的ALDH2基因质粒标准品,10mmol/L Tris-HCl,其pH=8.3,50mmol/L KCl,0.5U Taq酶,2.5mmol/L dNTP,3.5mmol/L Mg2+,0.45μmol/L探针P1,0.45μmol/L探针P2,0.3μmol/L上游引物,0.3μmol/L下游引物。PCR扩增反应的程序为:95℃3分钟;95℃10秒,60℃15秒,72℃15秒,45个循环;在60℃退火阶段采集荧光信号。

本实施例中,探针P1的5'和3'末端被标记了两种不同的荧光基团,分别为FAM基团和ROX基团,而探针P2的5'和3'末端被标记相同的BHQ1淬灭基团。在自然状态下,探针P1和探针P2形成探针复合体,荧光基团和淬灭基团相互靠近不产生荧光信号。在PCR扩增反应的退火阶段,探针P1和P2均与PCR产物结合,即探针P1和P2的荧光基团和淬灭基团分开,并产生两种不同的荧光信号。随着PCR循环数的增加,体系中的荧光信号随着PCR产物的积累而逐渐增强形成两条典型的扩增曲线。由于探针P1同时携带两种不同的荧光基团并具有同样的荧光信号产生机理,因此两条扩增曲线高度吻合。本实施例的梯度稀释扩增曲线见图3a。如图3a所示,10倍梯度稀释样本的扩增曲线1a体现较好的梯度,而2a(阴性对照ddH2O,即为没有模板的存在)无特异性产物的扩增,故检测不到特异信号。参照图3b,其示出了待测样本的梯度稀释扩增曲线的Ct值与DNA起始拷贝数的对数关系曲线,可以看出1×108copies模板用量的反应管的Ct值为20.25(Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数)、1×107copies模板用量的反应管的Ct值为23.66、1×106copies模板用量的反应管的Ct值为27.45、1×105copies模板用量的反应管的Ct值为31.07、1×104copies模板用量的反应管的Ct值为33.23、1×103copies模板用量的反应管的Ct值为36.82,因而,以上结果表明了本实施例所采用的由探针P1、P2所形成的复合编码探针在FQ-PCR技术中具有可行性,该PCR反应体系具有较高的反应效率,梯度样本扩增曲线的Ct值与其DNA起始拷贝数的对数有很好的线性关系(R2=0.996),体现了该技术较强的定量检测能力。

实施例二

本实施例以四种高危险亚型的HPV病毒(HPV18、HPV33、HPV52、HPV58)为研究对象,针对以上四种亚型设计引物和探针如下:

所用的引物的序列为:

HPV18-F2:5'-AATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCAC-3'

HPV18-R2:5'-ACTGAAAAATAAACTGCAAATCATATTCC-3'

HPV33-F2:5'-AGGTATTTGTTACTGTGGTAGATACC-3'

HPV33-R2:5'-GCATAGTTGAAAAACAAACTGTAGATC-3'

HPV52-F2:5'-ATCAGTTGTTTGTCACAGTTGTG-3'

HPV52-R2:5'-CATCAGCTGTTAATGTAATTTTGCAC-3'

HPV58-F2:5'-AGTTATTTGTTACCGTGGTTGATAC-3'

HPV58-R2:5'-AAGCTGAAAAACAAACTGTAAGTCA-3'

所用的复合编码探针的序列为:

HPV18-P1:5'-HEX-AATCGCAAAGTTTCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGC-

-TTTACTGCGTTT-ROX-3'

HPV18-P2:5'-BHQ1-AAACGCAGTAAACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATG-

-AAACTTTGCGATT-BHQ1-3'

HPV33-P1:5'-FAM-AATCGCAAAGTTTTGACTTTATGCACACAAGTAACTAGTG-

-ACAGTTTACTGCGTTTG-FAM-3'

HPV33-P2:5'-BHQ1-CAAACGCAGTAAAAATTTTAAAGAATATATAAGACATGTT-

-GAAGAAACTTTGCGATT-BHQ1-3'

HPV52-P1:5'-HEX-AATCGCAAAGTTTGTGCTGAGGTTAAAAAGGAAAGCACA-

-TTTACTGCGTTT-CY5-3'

HPV52-P2:5'-BHQ1-AAACGCAGTAAATTTAAGGAATACCTTCGTCATGGCGAA-

-AACTTTGCGATT-BHQ1-3'

HPV58-P1:5'-CY5-AATCGCAAAGTTTGCACTGAAGTAAATAAGGAAGGTACTT-

-TACTGCGTTTG-FAM-3'

HPV58-P2:5'-BHQ1-CAAACGCAGTAAAAAGGAATATGTACGTCATGTTGAAGA-

-AACTTTGCGATT-BHQ1-3'

在20μL的PCR反应体系内含有2μL的模板,10mmol/L Tris-HCl,其pH=8.3,50mmol/L KCl,0.5U Taq酶,2.5mmol/L dNTP,3.5mmol/L Mg2+,各条探针的终浓度都是0.45μmol/L,各引物的终浓度都是0.3μmol/L。PCR扩增反应程序为:95℃3分钟;95℃10秒,60℃15秒,72℃15秒,45个循环;在60℃退火阶段采集荧光信号。

以上所建立的多重PCR反应体系可以检测出仅含四种亚型HPV中的任意一种的HPV亚型的样本,其相应的扩增曲线如图4a-4d所示出的曲线,分别为包含HPV18、HPV33、HPV52和HPV58的样本的检测结果,可以看出,四种不同的HPV高危险亚型病毒间不存在交叉反应,本实施例只需一次检测实验即可对待测样本进行准确检测,体现了该技术较高的检测效率。

实施例三

本实施例以人的TP53基因(Gene ID:7157)中的一个SNP位点(rs12951053)为研究对象,运用本发明的方法进行基因分型,所设计的引物和探针序列如下:

引物F5H-A1:5'-GTGGATGGGTAGTAGTATGGA-3'

引物F5H-C2-2A:5'-GTGGATGGGTAGTAGTATGaC-3',其中标记下划线并小写字母的碱基为人工引入的错配碱基

引物F5H-R:5'-ATCCTCACCATCATCACACTG-3'

探针F5H-P1:5'-HEX-AATCGCAAAGTTTGGTGGGCCCAGGGGTCAGAGGCAA-

-GCTTTACTGCGTTT-FAM-3'

探针F5H-P2:5'-BHQ1-AAACGCAGTAAAGCAGGGTGGCAAGTGGCTCCTGACC-

-TAAACTTTGCGATT-BHQ1-3'

测序引物:

F:5'-GGGAGCAGTAAGGAGATTC-3'

R:5'-TCTGCTTGCCTCTGACCC-3'

本实施例中包含反应液A和反应液B两种组成配方形成的反应体系,其分别用于检测待测样本的SNP位点是否含有A型基因和C型基因。

反应液A:10μL PCR反应体系内含2μL模板,10mmol/L Tris-HCl,其pH=8.3,50mmol/L KCl,0.5U Taq酶,2.5mmol/L dNTP,3.5mmol/L Mg2+,0.45μmol/L探针F5H-P1,0.45μmol/L探针F5H-P2,0.3μmol/L引物F5H-A1,0.3μmol/L引物F5H-R。

反应液B:10μL PCR反应体系内含2μL模板,10mmol/L Tris-HCl,其pH=8.3,50mmol/L KCl,0.5U Taq酶,2.5mmol/L dNTP,3.5mmol/L Mg2+,0.45μmol/L探针F5H-P1,0.45μmol/L探针F5H-P2,0.3μmol/L引物F5H-C2-2A,0.3μmol/L引物F5H-R。

PCR扩增反应程序为:95℃3分钟;95℃10秒,60℃15秒,72℃15秒,45个循环;60℃退火阶段采集荧光信号。

随机选取23个由厦门市第一医院提供的外周血样本,利用上述的A、B两种反应体系分别对以上23个样本进行基因分型检测并统计各自的检测结果,将其组合以得到待测样本的SNP位点的基因型结果。

在23个待测样本中,TP53基因的SNP位点检测结果为rs12951053中有12个为AA型,10个为AC型,1个为CC型,具体如下表1所示。发明人还对23个样本的第二次PCR扩增产物分别进行了Sanger测序,所得结果与表1完全相同。

表1

因而,在本实施例中,本发明提供的复合编码探针及相应的DNA检测方法可以高效地同时对多个样品的SNP位点同时进行检测,并得到准确可信的结果。而与Sanger测序法相比,本实施例大大提高了测序的通量,能够同时对多个样品的SNP位点进行有效的检测,并减少中间样品处理的步骤,提高实验效率,检测成本更低。

以上所述仅为本发明的优选实施例,并非因此限制其专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换,直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。

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