本发明涉及阳离子脂质以及转基因载体，具体涉及一类同时含有烃基链、苯环、三氮唑以及多胺化合物的阳离子脂质、含该类阳离子脂质的转基因载体及其制备方法。
背景技术：
基因治疗作为最前沿的医学手段之一，已经在癌症以及艾滋病等各类重大疾病的治疗中显示出巨大的威力。在基因治疗过程中，基因载体扮演着十分重要的角色。
裸露的dna比较松散、体积较大，一般以舒展的线型螺旋形式存在，而且具有负电性，因此自身很难跨膜进入细胞，即使有少量dna进入细胞，在到达细胞核表达之前，也很容易被细胞内的核酸酶降解。这些不利因素都使得dna分子在不借助其它技术手段的情况下，很难进行有效地基因转染，因此发展安全有效的基因载体是基因治疗成功的前提条件。
基因载体包括两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体具有转染效率高、靶向性好等优点。但是潜在的免疫反应以及载量小等缺点极大地限制了其在临床中的应用。非病毒载体完全可以克服病毒载体的上述缺点，具有载量大、安全性高、结构易于修饰等优点，因此得到了研究者的广泛关注。
技术实现要素：
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，多胺分子经不同长度烃基链修饰之后，表现出较低的细胞毒性，转染效率与烃基链的长度有很大关系：随着烃基链的增加，转染效率增加，含有不饱和键的载体转染效率高于含有饱和键的载体。基于这种发现，完成了本发明。
本发明的一个目的是解决上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种具有多功能的多胺类阳离子脂质的转基因载体，不仅具有低的细胞毒性，而且同时具有较高的转染效率，以促进基因治疗的发展。
本发明还有一个目的是提供多胺类阳离子脂质的制备方法以及含有该阳离子脂质的转基因载体的制备方法。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种多胺类阳离子脂质，所述阳离子脂质的结构式(1)如下：
式(1)中，r1为烃基链，r2为多胺分子。
其中，优选的是，r1为ch3(ch2)2ch2，ch3(ch2)6ch2，ch3(ch2)10ch2，ch3(ch2)16ch2，ch3(ch2)7chch(ch2)7ch2中的一种，r2为
本发明的目的还可以进一步由多胺类阳离子脂质的制备方法来实现，该方法的合成路线如下：
所述方法具体步骤包括：
步骤一、按比例称取式2化合物、脂肪胺、催化剂、缩合剂和有机碱，加入溶剂溶解，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析分离得到式3化合物；
步骤二、所述步骤一得到的式3化合物与boc保护的炔丙胺溶于四氢呋喃溶剂中得四氢呋喃溶液，将溶有硫酸铜和维生素c的水溶液加入所述四氢呋喃溶液中，室温下反应15～20小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析分离所得化合物加入到氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液中，室温搅拌反应0.5～1小时，将溶剂浓缩，真空干燥18-24小时，得到式1化合物阳离子脂质。
优选的是，其中，在所述步骤一中，所述式2化合物，所述脂肪胺r1nh2化合物，所述催化剂为1-羟基苯并三唑，所述缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸与所述有机碱为三乙胺的物质的量的比为1:1:2:2:3，柱层析分离中采用的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比为4:1。
优选的是，其中，在所述步骤二中，所述四氢呋喃溶液中的四氢呋喃和所述水溶液中的水的体积比为2:1，所述式3化合物与所述式4化合物的摩尔比为1:2.2，所述柱层析分离中采用的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，还提供了一类转基因载体，所述转基因载体由不同长度烃基链修饰的树枝状分子类阳离子脂质、二油酰磷脂酰乙醇胺和高纯灭菌缓冲液组成。
优选的是，其中，所述阳离子脂质的摩尔浓度为1.0mm，所述阳离子脂质与所述二油酰磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1:6。
本发明的目的还可以进一步由转基因载体的制备方法来实现，该方法具体包括步骤：将所述阳离子脂质、二油酰磷脂酰乙醇胺与无水氯仿加入到高温灭菌的烧瓶中，溶解后减压浓缩得到脂质体膜，将所述脂质体膜真空干燥去除残留氯仿，干燥后的脂质体膜与预先预热到70℃的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液混合配成所需浓度的溶液，超声得到所述转基因载体。
本发明的目的还可以进一步由含有不同长度烃基链的多胺类阳离子脂质的制备转基因载体中的应用来实现。
本发明至少包括以下有益效果：
1、由于本发明提供的阳离子脂质体的结构中含有仲胺和叔胺，在生理条件下能够部分质子化而带上正电荷，因而能够与带负电的dna静电作用，并将dna浓缩为适合细胞内吞的纳米颗粒；
2、转基因载体细胞毒性较低，载体/dna复合物与细胞培养后细胞存活率均大于90％；
3、阳离子脂质和转基因载体的制备方法简单、成熟、易于掌控；
4、转基因载体转染效率在e1和hela细胞中转染效率较低，低于售转基因载体lipofectamine2000；在mg63和hek293细胞中均超过基因载体lipofectamine2000，其中在细胞hek293中的转染效率为lipofectamine2000的3倍，也就是说提供的阳离子脂质体表现出一定的细胞选择性，在不同细胞中的转染效率有较大差异，可为临床靶向治疗提供可能性；
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的转基因载体与dna复合物的琼脂糖凝胶电泳实验结果示意图；
图2为本发明所述转基因载体与质粒dna的复合物在e1、hela、mg63、和hek293细胞中的细胞毒性图；
图3为本发明所述转基因载体与质粒dna的复合物的粒径及zeta电位；
图4是本发明所述不同浓度的转基因载体1e与pgl-3dna复合物在e1细胞中的转染示意图。
图5是本发明所述转基因载体1a-1e与pgl-3dna复合物在e1、hela、mg63和hek293细胞中的转染示意图。
下面结合具体实施方式和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
具体实施方式
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
<实例1>
步骤一、按比例称取式2化合物(0.86mmol)、正丁胺化合物(0.86mmol)、1-羟基苯并三唑催化剂(1.72mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸缩合剂(1.72mmol)与三乙胺(2.58mmol)，加入二氯甲烷溶剂40ml溶解，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压蒸掉溶剂，加入35ml水，二氯甲烷(40mlx2)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，去除溶剂，硅胶柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯体积比＝4/1)得白色固体得到式3a化合物，产率：89％；
核磁1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.67(s,2h),7.40(s,1h),6.18(brs,1h),4.43(s,4h),3.47(dd,j＝3.0,7.1hz,2h),1.65-1.60(m,2h),1.47-1.38(m,2h),0.97(t,j＝7.3hz,3h)；
核磁13cnmr(101mhz,cdcl3)δ166.68,136.75,136.09,130.10,126.46,54.12,39.99,31.61,20.15,13.74；
质谱esi-ms:m/z＝288.1554([m+h]+).
步骤二、所述步骤一得到的式3a化合物(0.1mmol)与boc保护的炔丙胺式4化合物(0.22mmol)溶于四氢呋喃溶剂中得四氢呋喃溶液，将溶有硫酸铜和维生素c的水溶液加入所述四氢呋喃溶液中，室温下反应15～20小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析(洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，其体积比为10:1)分离得白色固体。然后将上述固体加入到氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液中，室温搅拌反应0.5～1小时，将溶剂浓缩，真空干燥18～24小时，得到式1a化合物阳离子脂质，收率：77％。
核磁1hnmr(400mhz,d2o)δ8.45(s,2h),7.70(s,2h),7.57(s,1h),5.78(s,4h),4.69(s,4h),3.55-3.53(m,16h),3.35(t,j＝6.8hz,2h),3.21-3.20(m,8h),2.97(brs,8h),1.60-1.51(m,2h),1.37-1.31(m,2h),0.89(t,j＝7.3hz,3h)；
核磁13cnmr(101mhz,d2o)δ172.68,169.32,136.20,136.18,138.81,131.15,128.22,127.05,53.47,49.56,46.76,39.86,39.16,36.88,30.54,28.91,19.55,13.11；
质谱esi-ms:m/z＝854.5593([m+h]+)。
<实例2>
步骤一、按比例称取式2化合物(0.86mmol)、正辛胺化合物(0.86mmol)、1-羟基苯并三唑催化剂(1.72mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸缩合剂(1.72mmol)与三乙胺(2.58mmol)，加入二氯甲烷溶剂40ml溶解，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压蒸掉溶剂，加入35ml水，二氯甲烷(40mlx2)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，去除溶剂，硅胶柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯体积比＝4/1)得白色固体得到式3b化合物，产率：91％；
核磁1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.67(s,2h),7.39(s,1h),6.24(brs,1h),4.42(s,4h),3.44(dd,j＝13.2,7.1hz,2h),1.64-1.60(m,2h),1.37-1.29(m,10h),0.87(t,j＝6.8hz,3h)；
核磁13cnmr(101mhz,cdcl3)δ166.65,136.75,136.09,130.08,126.45,54.12,40.33,31.78,29.57,29.29,29.19,27.03,22.62,14.05；
质谱esi-ms:m/z＝344.2196([m+h]+).
步骤二、所述步骤一得到的式3b化合物(0.1mmol)与boc保护的炔丙胺式4化合物(0.22mmol)溶于四氢呋喃溶剂中得四氢呋喃溶液，将溶有硫酸铜和维生素c的水溶液加入所述四氢呋喃溶液中，室温下反应15～20小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析(洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，其体积比为10:1)分离得白色固体。然后将上述固体加入到氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液中，室温搅拌反应0.5～1小时，将溶剂浓缩，真空干燥18～24小时，得到式1b化合物阳离子脂质，收率：59％。
核磁1hnmr(400mhz,d2o)δ8.45(s,2h),7.70(s,2h),7.61(s,1h),5.78(s,4h),4.66(s,4h),3.54-3.53(m,16h),3.35(t,j＝5.9hz,2h),3.19(brs,8h),2.95(brs,8h),1.57(brs,2h),1.17(brs,10h),0.74-0.73(m,3h)；
核磁13cnmr(101mhz,d2o)δ173.22,169.20,136.78,132.02,128.83,127.84,54.07,50.07,47.36,40.71,39.78,37.48,31.67,29.56,28.97,26.80,22.62,14.12；质谱esi-ms:m/z＝910.6207([m+h]+).
<实例3>
步骤一、按比例称取式2化合物(0.86mmol)、1-十二胺化合物(0.86mmol)、1-羟基苯并三唑催化剂(1.72mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸缩合剂(1.72mmol)与三乙胺(2.58mmol)，加入二氯甲烷溶剂40ml溶解，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压蒸掉溶剂，加入35ml水，二氯甲烷(40mlx2)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，去除溶剂，硅胶柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯体积比＝4/1)得白色固体得到式3c化合物，产率：89％；
核磁1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.67(s,2h),7.41(s,1h),6.13(brs,1h),4.44(s,4h),3.46(dd,j＝13.2,7.1hz,2h),1.64-1.61(m,2h),1.38-1.24(m,18h),0.88(t,j＝6.8hz,3h)；
核磁13cnmr(101mhz,cdcl3)δ166.60,136.81,136.15,130.10,126.39,54.15,40.34,31.91,29.66,29.62,29.57,29.36,29.34,27.05,22.68,14.10；
质谱esi-ms:m/z＝400.2814([m+h]+)；
步骤二、所述步骤一得到的式3c化合物(0.1mmol)与boc保护的炔丙胺式4化合物(0.22mmol)溶于四氢呋喃溶剂中得四氢呋喃溶液，将溶有硫酸铜和维生素c的水溶液加入所述四氢呋喃溶液中，室温下反应15～20小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析(洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，其体积比为10:1)分离得白色固体。然后将上述固体加入到氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液中，室温搅拌反应0.5～1小时，将溶剂浓缩，真空干燥18～24小时，得到式1c化合物阳离子脂质，收率：80％。
核磁1hnmr(400mhz,d2o)δ8.46(s,2h),7.75(s,2h),7.36(s,1h),5.60(s,4h),4.61(s,4h),3.48(brs,16h),3.16(brs,10h),2.91(brs,8h),1.49(brs,2h),1.14(brs,18h),0.75(brs,3h)；
核磁13cnmr(101mhz,d2o)δ172.49,167.72,136.20,135.48,130.98,128.44,127.41,53.39,49.41,46.91,40.24,39.28,36.95,31.85,29.68,29.64,29.31,29.15,26.96,22.58,13.99；
质谱esi-ms:m/z＝966.6844([m+h]+).
<实例4>
步骤一、按比例称取式2化合物(0.86mmol)、硬脂胺化合物(0.86mmol)、1-羟基苯并三唑催化剂(1.72mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸缩合剂(1.72mmol)与三乙胺(2.58mmol)，加入二氯甲烷溶剂40ml溶解，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压蒸掉溶剂，加入35ml水，二氯甲烷(40mlx2)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，去除溶剂，硅胶柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯体积比＝4/1)得白色固体得到式3d化合物，产率：91％；
核磁1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.67(s,2h),7.41(s,1h),6.13(brs,1h),4.44(s,4h),3.46(dd,j＝13.3,7.0hz,2h),1.66-1.60(m,2h),1.37-1.18(m,30h),0.88(t,j＝6.8hz,3h)；
核磁13cnmr(101mhz,cdcl3)δ166.58,136.82,136.17,130.10,126.37,54.16,40.34,31.93,2971,29.68,29.63,29.37,27.05,22.69,14.11；
质谱esi-ms:m/z＝484.3754([m+h]+).
步骤二、所述步骤一得到的式3d化合物(0.1mmol)与boc保护的炔丙胺式4化合物(0.22mmol)溶于四氢呋喃溶剂中得四氢呋喃溶液，将溶有硫酸铜和维生素c的水溶液加入所述四氢呋喃溶液中，室温下反应15～20小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析(洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，其体积比为10:1)分离得白色固体。然后将上述固体加入到氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液中，室温搅拌反应0.5～1小时，将溶剂浓缩，真空干燥18～24小时，得到式1d化合物阳离子脂质，收率：75％。
核磁1hnmr(400mhz,d2o)δ8.43(s,2h),7.73(s,2h),7.25(s,1h),5.55(s,4h),4.58(s,4h),3.40(brs,16h),3.13(brs,10h),2.88(brs,8h),1.48(brs,2h),1.17(brs,30h),0.78(brs,3h)；
核磁13cnmr(101mhz,d2o)δ172.41,167.60,136.19,135.42,130.94,128.46,127.42,53.34,49.34,46.87,40.29,39.26,36.93,36.60,31.95,29.87,29.44,29.15,27.11,22.66,14.01；
质谱hr-ms:1050.7787([m+h]+).
<实例5>
步骤一、按比例称取式2化合物(0.86mmol)、油胺化合物(0.86mmol)、1-羟基苯并三唑催化剂(1.72mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸缩合剂(1.72mmol)与三乙胺(2.58mmol)，加入二氯甲烷溶剂40ml溶解，在氮气氛围下反应8～10小时，反应结束后，减压蒸掉溶剂，加入35ml水，二氯甲烷(40mlx2)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，去除溶剂，硅胶柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯体积比＝4/1)得白色固体得到式3e化合物，产率：71％；
核磁1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.66(s,2h),7.41(s,1h),6.13(brs,1h),5.45-5.27(m,2h),4.43(s,4h),3.46(dd,j＝13.3,7.0hz,2h),2.02-2.00(m,4h),1.63-1.61(m,4h),1.35-1.24(m,20h),0.88(t,j＝6.8hz,3h)；
核磁13cnmr(101mhz,cdcl3)δ166.60,136.83,136.15,130.11,129.98,129.76,126.37,54.15,40.33,31.90,29.76,29.70,29.63,29.52,29.47,29.31,29.25,27.22,27.04,22.68,14.10；
质谱esi-ms:m/z＝482.3507([m+h]+).
步骤二、所述步骤一得到的式3e化合物(0.1mmol)与boc保护的炔丙胺式4化合物(0.22mmol)溶于四氢呋喃溶剂中得四氢呋喃溶液，将溶有硫酸铜和维生素c的水溶液加入所述四氢呋喃溶液中，室温下反应15～20小时，反应结束后，减压浓缩，柱层析(洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，其体积比为10:1)分离得白色固体。然后将上述固体加入到氯化氢的饱和乙酸乙酯溶液中，室温搅拌反应0.5～1小时，将溶剂浓缩，真空干燥18～24小时，得到式1e化合物阳离子脂质，收率：85％。
核磁1hnmr(400mhz,d2o)δ8.51(s,2h),7.83(s,2h),7.42(s,1h),5.68rs,4h),5.32(s,2h),4.66(s,4h),3.53(brs,16h),3.31(brs,2h),3.21(brs,8h),2.97(brs,8h),1.98(brs,4h),1.57(brs,2h),1.24(brs,22h),0.84(brs,3h)；
核磁13cnmr(101mhz,d2o)δ172.53,167.87,136.21,135.88,135.56,129.97,53.42,49.37,46.83,40.28,39.22,36.93,31.87,29.68,29.48,29.31,27.18,27.11,26.99,22.64,14.04；
质谱hr-ms:524.8855([1/2m+h]+).
<实例6>
含实施例1-5中阳离子脂质式1a-1e化合物的转基因载体的制备
原料包括实施1-5制备的阳离子脂质式1a-1e化合物、二油酰磷脂酰乙醇胺dope(dioleoylphosphotidylethanolamine)、无水氯仿和三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris–hcl)缓冲液。于高温灭菌的烧瓶中将合成的阳离子脂质式1化合物(0.005mmol)与dope以不同摩尔比(1:2，1:4，1:6，1:8)溶于2.5ml无水氯仿中，充分混合溶解后将溶剂室温下减压旋干得到脂质体膜，混合物放入真空干燥箱中干燥(干燥时间12小时，温度25℃)去除残留氯仿，干燥后的脂质体膜与提前预热到70℃，三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris–hcl)缓冲液(10mm,ph7.4)混合，加入缓冲溶液的量使得阳离子脂质的最终浓度为1.0mm。最后将混合物于60℃超声中超声20分钟，置于4℃冰箱内保存备用。
<实例7>
实施例6制备得到的转基因载体，对其进行下述几方面的检测：
(1)转基因载体与puc18-dna复合物的琼脂糖凝胶电泳实验
转基因载体与puc18-dna复合物的制备
室温下，在pe管里分别加入转基因载体、puc18-dna和相应体积的超纯水，使反应液的最终体积保持在20μl，混合均匀，反应液中转基因载体的物质的量浓度分别为1μm，5μm，10μm和20μm，puc18-dna的浓度为9μg/ml。然后将混合均匀的反应液放入37℃恒温水浴中，保温0.5个小时后，加入2μl的10×loadingbuffer上样缓冲液终止反应。
琼脂糖凝胶的制备
称取280mg琼脂糖，加入40ml1×tae(tris-乙酸)缓冲溶液，微波加热使琼脂糖颗粒完全溶解，得到无色透明液体。待温度降至60℃左右，加入2μlgoldviewⅱ核酸显色剂，混合均匀后趁热倒入带有梳子的制胶槽中。冷却40分钟待凝胶完全凝固后，小心拔出梳子，并将带有凝胶的制胶槽放入电泳槽中，加入1×tae电泳缓冲液稍微没过胶面。
复合物的琼脂糖凝胶电泳实验
分别取上述制备的转基因载体与puc18-dna复合物10μl加入凝胶上的加样孔内。盖上电泳盖，电压80v条件下电泳40分钟后停止，取出凝胶在凝胶电泳成相系统中曝光采样。
如图1所示，利用琼脂糖凝胶电泳实验，我们观察了转基因载体与puc18-dna的作用情况。随着烃基链长度的增加，载体对dna的凝聚能力增加。相同的碳链长度，氨基数目越多，凝聚效果越好，含有饱和键的凝聚效果好于含有不饱和键的载体。
(2)转基因载体细胞毒性实验
转基因载体与puc18-dna复合物的制备
室温下，在pe管里分别加入转基因载体、puc18-dna和相应体积的培养基，使反应液的最终体积保持在500μl，反应液中转基因载体的浓度分别为1μm,10μm,15μm,20μm，puc18-dna的浓度为9μg/ml，加入。然后放入37℃恒温水浴中，保温0.5小时。
细胞毒性实验
用胰酶消化收取对数生长期的e1,hela,mg63和hek293细胞将大约每孔7000个细胞种入96孔板中，于37℃含5％co2的培养箱培养24个小时，使细胞的生长至70％-80％的融合。弃去孔内原有培养基，用pbs缓冲液洗1-2次，在每孔中分别加入上述配好的不同浓度的转基因载体与puc18-dna复合物100μl，每个浓度设置五个平行孔；采用不含转基因载体的dmem培养基作为空白对照，采用商业化lipofectamine2000作为阳性对照，不含细胞只有dmem作为空白对照。4小时后将所有培养基吸出，向其中每孔加入200μl含10％胎牛血清的dmem，于培养箱中培养24小时后，向每孔加入10μlmtt溶液，4小时后吸出所有加入液，并加入150μl二甲基亚砜，于摇床上震荡10分钟后用酶标仪测定每孔在490nm处的吸光度值。按如下公式计算细胞存活率(％)＝[a490test-空白]/[a490control-空白]×100％。
如图2所示，经过在e1,hela,mg63和hek293细胞中测定转基因载体的细胞毒性，发现在这四种细胞中的毒性都比较低。细胞的成活率基本都在90％以上。
(3)转基因载体与puc18-dna复合物的粒径及表面电位实验
转基因载体与puc18-dna复合物的制备
室温下，在pe管里分别加入转基因载体、puc18-dna和相应体积的超纯水，使反应液的最终体积保持在50μl，混合均匀，反应液中转基因载体的物质的量浓度分别为10μm，20μm，30μm和40μm，puc18-dna的浓度为9μg/ml。然后将混合均匀的反应液放入37℃恒温水浴中，保温30分钟后稀释到500μl。
粒径以及表面电位
如图3所示，利用动态激光光散射技术，我们研究了转基因载体与dna凝聚后的粒径。形成的凝聚试剂均可与dna形成50—500nm大小的颗粒，表面电位为-30—10mv。
(4)转基因载体与pgl-3dna的复合物体外转染实验
转基因载体与pgl-3dna复合物的制备
室温下，在pe管里加入转基因载体与pgl-3dna，不同浓度的转基因载体，pgl-3dna的浓度为9μg/ml，加入相应体积的dmem，使反应液的最终体积保持在200μl，轻轻吹打混匀，放入37℃恒温水浴中，保温30分钟。
体外转染实验
用胰酶消化收取对数生长期的hepg2细胞，将大约每孔7.0×104-9.0×104个细胞种入24孔细胞培养板，于37℃含5％co2的培养箱培养24个小时，使细胞生长至70％-80％融合。弃去孔内原有培养基，用pbs缓冲液洗1-2次，在每孔中分别加入上述配好的不同浓度的转基因载体与pgl-3dna质粒复合物200μl。4小时后将所有培养基吸出，向其中每孔加入200μl含10％胎牛血清的dmem，于培养箱中培养24小时后，取出24孔板，用pbs洗液洗涤两次。加入120μl细胞裂解液，常温震荡15min，将充分裂解产物转入1.5mlep管，12000rpm离心30s，将离心好的上清液移入新的ep管进行后续检测。取裂解样品20μl加入96孔白板，另外加入100μlluciferaseassayreagent吹打两到三次混匀，放到酶标仪上测定。
按照上述的方法制备转基因载体lipofectamine2000与pgl-3dna的复合物。转基因载体1e与不同比例的dope(物质量比为：1:2，1:4，1:6，1:8)形成阳离子脂质体，不同浓度的阳离子脂质体(6，8，10，14μm)与pgl-3dna复合物加入到e1细胞中进行体外转染实验。
如图4所示，通过细胞转染实验可以得出：在e1细胞中，转基因载体1e与dope的比例为1:6，浓度为10μm时，转染效率最高。
在转基因载体与dope的比例为1:6，浓度为10μm条件下，研究了其它转基因载体在e1,hela,mg63以及hek293细胞中的转染效率。如图5所示，在转基因载体1a-1e中，随着烃基链长度的增加，转染效率增加。此外，与转基因载体lipofectamine2000相比，转基因载体1e在mg63与hek293细胞中的转染效率较高，尤其是在hek293细胞中，转染效率可以达到lipofectamine2000的3倍。
综上所述，本发明中的转基因载体1a-1e的细胞毒性较低，在mg63与hek293细胞中具有较高的转染效率，其制备方法简单、成熟、易于掌控。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。