本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法。
背景技术：
：膀胱癌(bladdercancer，bc)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，占泌尿系肿瘤的首位，其发病率和复发率呈逐年增加的趋势。据统计，我国每年约有145000例患者死于膀胱肿瘤，其中男性发病率为女性的3～4倍。在来源于上皮组织的膀胱癌中，约90％为移行上皮癌；非上皮性膀胱肿瘤较少见，主要包括未分化癌、鳞状细胞癌、腺癌，根据细胞的分化程度可将其分为3级。浅表性膀胱癌早期诊断通常有较好的预后，然而，膀胱癌的复发率为60％～70％，居所有实体瘤的首位，其中11％的复发患者会发展为浸润性膀胱癌，患者术后通常需每年进行3～4次膀胱镜检查。早期发现膀胱癌可以增加手术保留膀胱的机会并提高患者总体生存率，因此，如何早期发现膀胱肿瘤以及术后如何早期检测到膀胱肿瘤的复发具有非常重要的临床意义。传统的膀胱癌检查是膀胱镜检查和细胞学活检，但膀胱镜检查属于有创检查，费用高且会给患者带来一定痛苦，其结果可能会受操作者主观判断而带来一定的误差；而细胞学活检则存在灵敏度低的缺陷(34％左右)。因此无创检测，高灵敏高特异性是未来膀胱癌检测和监控手段发展的方向。膀胱癌无创检测的关键在于寻找高灵敏高特异性生物标记物，目前这也是膀胱癌研究的一大热点。中国专利(cn104141009b)公开了一种早期膀胱癌的多靶标检测方法，通过甲基化特异性荧光定量pcr对eomes、gdf15、nid2、pcdh17、pou4f2、tcf21、znf154这七个标志物基因进行检测。其中，nid2的检测灵敏度仅为23.33％。通过检测多个标志物基因的甲基化水平，虽然可以有效提高对膀胱癌检测的灵敏度，但是由于做甲基化特异性荧光定量pcr所用试剂、仪器都较为昂贵，检测费用较高，无疑增加膀胱癌患者的就诊负担。因此，寻找灵敏度、特异性高，无需多个标志物同时检测，可降低检测费用的检测膀胱的方法或产品，是众多膀胱癌患者所亟需的。技术实现要素：本发明主要目的是，提供了一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明目的之一，提供一种用于早期膀胱癌检测的引物及探针，所述引物序列如下：nid2的正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示；所述荧光探针序列为seqidno.3，探针5′端标记fam，3′端标记mgb。本发明目的之二，提供所述引物及探针在制备用于早期膀胱癌检测的试剂盒的应用。本发明目的之三，提供一种试剂盒，其包括以上所述的引物及探针；此外还包括检测gapdh的引物及探针，pcrmastermix，裂解液，蛋白酶k，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddh2o。本发明目的之四，提供一种上述试剂盒的使用方法，步骤如下：(1)样本中基因组dna的提取：取患者尿沉淀细胞，利用裂解液，蛋白酶k，漂洗液和ddh2o提取，得基因组dna溶液；(2)dna甲基化修饰：取步骤(1)提取得到的基因组dna溶液用亚硫酸氢盐溶液进行修饰，得到甲基化修饰后的dna；(3)将步骤(2)修饰后的dna进行pcr扩增。本发明目的之五，提供所述的试剂盒在制备检测早期膀胱癌试剂中的应用。本发明目的之六，提供所述试剂盒在制备检测nid2甲基化试剂中的应用。本发明取得的有益效果：(1)本发明所用引物专一性强，采用本发明引物进行扩增，扩增条件易于摸索，特异性强，优于其它引物。(2)本发明所用试剂盒检测灵敏性、特异性强，高于现有技术中以nid2为标记物检测膀胱癌的灵敏性。(3)本发明设计引物通过检测单个基因(nid2)的甲基化程度进行膀胱癌的诊断，与采用多个标志物进行诊断的方法相比，可以大量减少检测所需工作量，并且可以降低检测成本，从而可以有助于减少患者的诊疗费用。(4)本发明试剂盒不仅可以发现膀胱癌，也可以发现癌前腺瘤，为通过摘除癌前腺瘤而预防膀胱癌提供了可能性；本发明试剂盒可以同时发现左右两侧膀胱肿瘤，减少检测盲区和漏诊。(5)本发明检测方法完全无创，仅需50ml尿液便可完成检测，同时可使无症状人群接受度高。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。正如
背景技术：
所述，寻找灵敏度、特异性高，无需多个标志物同时检测，可降低检测费用的检测膀胱的方法或产品，是众多膀胱癌患者所亟需的。为了解决这个问题，本发明目的之一，提供一种用于早期膀胱癌检测的引物及探针，所述引物序列如下：nid2的正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.3所示；所述荧光探针序列为seqidno.4，探针5′端标记fam，3′端标记mgb。本发明目的之二，提供所述引物及探针在制备用于早期膀胱癌检测的试剂盒的应用。本发明目的之三，提供一种试剂盒，其包括以上所述的引物及探针；此外还包括检测gapdh的正向引物及探针，pcrmastermix，裂解液，蛋白酶k，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddh2o。检测gapdh的正向引物及探针可采用本领域内已知的引物及探针即可。本发明目的之四，提供一种上述试剂盒的使用方法，步骤如下：(1)样本中基因组dna的提取：取患者尿沉淀细胞，利用裂解液、蛋白酶k、漂洗液和ddh2o提取，得基因组dna溶液；(2)dna甲基化修饰：取步骤(1)提取得到的基因组dna溶液用亚硫酸氢盐溶液进行修饰，得到甲基化修饰后的dna；(3)将步骤(2)修饰后的dna进行pcr扩增。进一步，步骤(1)所述样本为尿沉淀细胞。进一步，pcr反应液为：pcrmastermix20μl，引物及探针3μl，总量/人份233μl。进一步，pcr反应条件为：本发明目的之五，提供所述的试剂盒在制备检测早期膀胱癌试剂中的应用。本发明目的之六，提供所述试剂盒在制备检测nid2甲基化试剂中的应用。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。实施例1用于检测膀胱癌尿沉淀细胞甲基化水平的引物和探针设计本发明根据美国国立生物技术信息中心(ncbi)公开的人类全基因组序列nid2基因序列，设计多组引物及探针，引物由takara(宝生物工程有限公司)合成，探针由lifetechnologies合成。经筛选获得特异性和灵敏度效果最优的引物序列如下:nid2正向引物序列为如seqidno.1所示(5’-ggttcgtttttttttagggcg-3’)，反向引物序列为seqidno.2(5’-cctaccctaaaatcccgaacg-3’)，荧光探针序列为seqidno.3(5’-fam-ccctcgaccgcttcgctcca-mgb-3’)；荧光探针seqidno:a3的5′端标记fam(荧光报告基团)，3′端标记mgb(荧光淬灭基团)。本发明筛选过程中所用其它引物及探针如下：第一组引物及探针：nid2正向引物序列为如seqidno.4所示(5’-gtataaaggttcgtttttttttagggc-3’)，反向引物序列为seqidno.5(5’-ctcctaactctaaaaacctaaccatcg-3’)，荧光探针序列为seqidno.6(5’-fam-tggagcgaagcggtcgaggg-mgb-3’)。第二组引物及探针：nid2正向引物序列为如seqidno.7所示(5’-gcggtttttaaggagttttattttc-3’)，反向引物序列为、seqidno.8(5’-ctacgaaattccctttacgc-3’)，探针如序列seqidno.3所示。第三组引物及探针：nid2正向引物序列为如seqidno.9所示(5’-tcggtataggattcggtttttgtcg-3’)，反向引物序列为seqidno.10(5’-cactcaaaacttccccaaaaaaacgc-3’)，探针如序列seqidno.3所示。实施例2一种试剂盒所述试剂盒包括nid2正向引物序列为如seqidno.1所示，反向引物序列为seqidno.2，荧光探针序列为seqidno.3，探针5′端标记fam，3′端标记mgb；此外还包括检测gapdh的正向引物及探针，pcrmastermix，裂解液，蛋白酶k，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddh2o；检测gapdh的正向引物及探针可采用本领域内已知的引物及探针即可。实施例3所述试剂盒的使用方法(1)尿沉淀细胞基因组dna的提取：取患者尿沉淀细胞，利用裂解液、蛋白酶k、漂洗液和ddh2o提取，得基因组dna溶液；具体步骤为：吸取200μl尿液样本，置于1.5ml离心管中，加入1ml裂解液1，然后持续涡旋振荡混匀1min，然后将1.5ml离心管置于70℃水浴5min。将1.5ml离心管从水浴锅内取出，12,000rpm离心5min，缓慢吸取300μl上清液至新的1.5ml离心管中。向新的1.5ml离心管中依次加入200μl裂解液2和20μl蛋白酶k，涡旋混匀。将新的1.5ml离心管置于70℃水浴10min。添加200μl异丙醇，涡旋混匀。将上一步所得溶液全部加入一个吸附柱中(将吸附柱套入收集管中)，12,000rpm离心30sec，弃废液。向吸附柱中加入600μl漂洗液，12,000rpm离心30sec，弃废液。12,000rpm离心2min，弃废液；将吸附柱室温静置2min，以彻底挥发吸附柱中残留的漂洗液。将吸附柱转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl洗脱液，室温静置2min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。(2)dna甲基化修饰：取步骤(1)提取得到的基因组dna溶液用亚硫酸氢盐溶液进行修饰，得到甲基化修饰后的dna；具体步骤为：将步骤(1)提取的dna全部转移至0.2ml离心管中，添加150μl亚硫酸氢盐溶液；通过轻弹离心管或移液器轻柔吹打操作混匀后短暂离心。将离心管放置于温度循环变温器中并按照以下条件设置：①98℃10min②64℃1.5h③4℃(≦20h)向吸附柱中加入500μl结合液，再将上一步的混合液转移至吸附柱中，盖上管盖并颠倒混匀，12,000rpm离心30sec，弃废液。向吸附柱中加入600μl漂洗液，12,000rpm离心30sec，弃废液。12,000rpm离心2min，弃废液；将吸附柱室温静置2min，以彻底挥发吸附柱中残留的漂洗液。将吸附柱转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μl洗脱液，室温静置2min，12,000rpm离心2min后将溶液收集到离心管中。(3)将步骤(2)修饰后的dna进行pcr扩增。按照下列表2配置pcr反应液：表1pcr反应液充分混匀后，按每管23μl体积分装于pcr八联管中，并做好标记后转移至样本处理区。将待检bisdna(甲基化转化后的dna)样本，按每孔2μl的量加入到分装好的pcr八联管中，压紧管盖，并短暂离心，将管壁液体离心至管底。将pcr八联管放置在仪器样本槽的相应位置，并记录好摆放次序。仪器检测通道选择：reporterdye1：fam，quencherdye1：none；reporterdye2(gapdh)：cy5，quencherdye2：none；passivereference：none。对应检测孔的设定：在扩增反应开始前，将待检样本和质控品设定为“unknown”。按以下条件设置pcr反应，如表2所示.表2试验例1对20个膀胱癌患者(编号为1-20)和20个正常人的尿液(21-40)和5个尿道炎患者(41-45)尿液dna样本进行检测。膀胱癌患者样本来自于中山市人民医院泌尿科，正常人样本来自于自愿者尿液样本。按实施例3方法进行检测，各样本的详细检测结果的ct值见表3。表3各样本荧光定量pcr检测结果的ct值(2)根据表3，按照如下公式计算得到灵敏度和特异性：灵敏度＝检测结果为阳性的膀胱癌样本数/总的膀胱癌样本数；特异性＝检测结果为阴性的非膀胱癌样本数/总的非膀胱癌样本数；结果如表4所示。表4本发明试剂盒检测膀胱癌的特异性和灵敏度45例样本检测结果灵敏度50％特异性100％由表3、表4检测结果中可以看出，nid2靶基因在膀胱癌样本中高度扩增，而正常样本中扩增极少，由此证明本发明试剂盒能快速、准确的检测膀胱癌。本发明试剂盒灵敏度高达50％，特异性为100％。由此看出本发明试剂盒不仅是快速、高效的，而且其结果的判读非常明确、直观，结果可靠。试验例2以本发明试验例1所述的样本进行检测，采用上述第一至三组引物及探针进行膀胱癌的检测，检测结果如下表5所示。表5第一组至第三组引物特异性和灵敏度检测结果第一组引物第二组引物第三组引物灵敏度30％25％20％特异性100％100％100％最后说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。sequencelisting<110>安徽达健医学科技有限公司<120>一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法<130><160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<400>1ggttcgtttttttttagggcg21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2cctaccctaaaatcccgaacg21<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ccctcgaccgcttcgctcca20<210>4<211>27<212>dna<213>人工序列<400>4gtataaaggttcgtttttttttagggc27<210>5<211>27<212>dna<213>人工序列<400>5ctcctaactctaaaaacctaaccatcg27<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6tggagcgaagcggtcgaggg20<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列<400>7gcggtttttaaggagttttattttc25<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8ctacgaaattccctttacgc20<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<400>9tcggtataggattcggtttttgtcg25<210>10<211>26<212>dna<213>人工序列<400>10cactcaaaacttccccaaaaaaacgc26当前第1页12