本发明涉及药物制剂领域与高分子化学领域，具体为一种生物可降解的氧化还原敏感型聚合物，其在水溶液中由于亲疏水作用自发形成两亲性纳米胶束，在肿瘤部位可以响应性释放出药物。本发明公开了该聚合物胶束的制备以及作为抗癌药物载体的应用，可以有效提高难溶性药物的水溶性。
背景技术
由于很多抗癌药物水溶性差、对正常组织的毒性大，限制了其应用，随着纳米技术的迅速发展，已经有很多纳米药物上市，其中纳米载体以脂质体与纳米胶束为主。纳米胶束通过亲疏水作用力将疏水性药物包载在其疏水性内核中，亲水性外壳则提高了其水溶性和稳定性。除此之外，通过改变和修饰纳米胶束的亲水端与疏水端，可以提高药物的免疫原性、实现智能性释放、提高靶向性等。聚乙二醇是一种优良的亲水性聚合物，作为隐身材料使用广泛，但是研究发现，聚乙二醇在体内带来长循环的优势的同时，也带来了累积毒性。因此利用人体中本身含有的、生物相容性好的材料作为亲水端，针对肿瘤组织的ph条件、酶系统等敏感的连接键来将亲水性材料与疏水性材料连接，通过肿瘤部位增强的渗透和滞留效应(enhancedpermeationandretention,epr)在肿瘤部位响应性断裂，释放出药物，以达到在提高疏水性药物的水溶性的同时提高药物的疗效，具有实际的意义。
藤黄酸(gambogicacid,ga,c38h44o8)是一种具有抗肿瘤作用的主要活性化合物之一，作为中药藤黄中的提取物，其应用已有数千年。ga已被证明在许多肿瘤类型中均具有抗肿瘤作用，成为近年来天然产物抗肿瘤研究的热点，由于其毒副作用较大、水溶性差、选择性低，限制了目前其抗肿瘤的临床研究。
谷胱甘肽(glutathione,gsh)是人体内自然存在的三肽，肿瘤组织及细胞中谷胱甘肽含量高，但癌症患者的正常细胞与健康人群相比，谷胱甘肽含量较低，由于肿瘤细胞中gsh含量高常对化疗产生耐药性，一些研究人员试图利用如丁硫氨酸硫酸亚胺(bso)等消耗gsh的药物，来降低癌细胞中gsh的含量。但使用bso的作用有限且没有针对性，药物也会同时降低正常细胞中gsh的含量，从而使得因放化疗带来的副作用进一步恶化。肿瘤部位高浓度的谷胱甘肽可以还原二硫键，而正常组织及血管谷胱甘肽浓度低，二硫键可以稳定存在，并且高浓度的谷胱甘肽在还原二硫键后自身也会被氧化，从而被消耗掉。
透明质酸(hyaluronan,ha)是一种阴离子性的、可生物降解的天然多糖，是结缔组织的主要细胞外基质。ha具有以下特点：1)ha具有生物相容性，且是人体中本就存在的物质；2)ha分子量高，且为接枝聚合物，可以形成接枝胶束，相比嵌段聚合物胶束，可以提高载药量与包封率；3)在多种癌细胞中，透明质酸酶水平都会升高，其可轻易降解ha为低分子量片段，以实现癌细胞内吞后的酶应答释放；4)亲水性高分子ha最近被用作聚乙二醇(peg)光栅的更安全的替代品，以延长纳米粒子的血液循环时间；(5)ha可提的生理稳定性和生物相容性。
维生素e琥珀酸酯(vitaminesuccinate,ves,c33h54o5)，是一种维生素e族成员，广泛应用于保健食品中。其不仅具有稳定性好、不易吸潮、不易染菌的生产保存性能，还具有抑制多种肿瘤细胞生长的功能。由于其疏水性强、对正常细胞的生长无影响，可作为优良的疏水性材料。
因此，利用肿瘤部位特殊的生理环境，响应性释放药物，并用一种可代替聚乙二醇、可生物降解的材料制备纳米胶束显得尤为重要。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种智能响应性释放药物的高分子聚合物前药，将透明质酸与维生素e琥珀酸酯通过共价键连接到二硫键上，制备成具有氧化还原响应性能的聚合物，在水中可以通过亲疏水作用力自发形成纳米胶束，具有生物降解性好、毒副作用小、响应性好等优点。
本发明的目的之二是以透明质酸-s-s-维生素e琥珀酸酯聚合物作为药物载体，实现多种药物负载，提高药物的水溶性，同时由于肿瘤组织及肿瘤细胞内还原性谷胱甘肽含量高，可以水解断裂二硫键，不仅可以靶向肿瘤组织，还可以减少对正常细胞的毒副作用。
本发明采用的技术方案为：一种生物可降解的氧化还原敏感型聚合物，所述的生物可降解的氧化还原敏感型聚合物是具有核壳结构，外壳为透明质酸，内壳为维生素e琥珀酸酯，具备谷胱甘肽还原响应性能的透明质酸-s-s-维生素e琥珀酸酯聚合物。
优选的，上述的一种生物可降解的氧化还原敏感型聚合物，透明质酸平均分子量为3.5kda。
一种生物可降解的氧化还原敏感型聚合物的制备方法，包括如下步骤：将维生素e琥珀酸酯与胱胺二盐酸盐反应，得维生素e琥珀酸酯衍生物；再将维生素e琥珀酸酯衍生物与透明质酸反应，得透明质酸-s-s-维生素e琥珀酸酯聚合物。具体为：
1)取维生素e琥珀酸酯溶于二氯甲烷中，搅拌至全溶，冰浴下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)与1-羟基苯并三唑(hobt)，室温避光搅拌过夜，于所得反应溶液中加入胱胺二盐酸盐，另加入甲醇助溶，用三乙胺调节ph为7-8，搅拌24h，所得产物用nahco3水溶液洗涤，有机层加入无水硫酸镁干燥，过滤，减压旋蒸除去二氯甲烷，真空干燥，得维生素e琥珀酸酯衍生物。
2)将适量透明质酸(m3.5kda)溶于pbs缓冲溶液中，搅拌12h，冰浴下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，避光搅拌4h，得无色透明粘稠状液体；将维生素e琥珀酸酯衍生物溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，冰浴下逐滴加入到无色透明粘稠状液体中，搅拌24h，所得反应液透析，冻干，得透明质酸-s-s-维生素e琥珀酸酯聚合物。
优选的，所述透析，透析袋分子量为3.5kda，透析介质为蒸馏水。
上述的生物可降解的氧化还原敏感型聚合物作为药物载体在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。将药物和上述的透明质酸-s-s-维生素e琥珀酸酯聚合物混合制备载药纳米胶束。包括如下步骤：将药物与透明质酸-s-s-维生素e琥珀酸酯聚合物共溶于二氯甲烷中，旋蒸除去二氯甲烷，再加入适量蒸馏水，先60-70℃水浴加热2-8h；再于冰浴，超声功率45-315w下超声处理，过滤，得载药纳米胶束。
优选的，药物与透明质酸-s-s-维生素e琥珀酸酯聚合物的质量比为1:(1-10)。
优选的，所述的药物选自喜树碱、藤黄酸、阿霉素、藤黄酸、姜黄素、阿法替尼、吉非替尼、伊马替尼、柔红霉素、尼莫地平、环孢素a和长春酰胺。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的聚合物在水溶液中可自组装形成胶束，提高抗肿瘤药物的水溶性，通过二硫键链接，释放响应性能好，增强了抗肿瘤药物的靶向性，同时大大延长了抗肿瘤药物在肿瘤的停留时间，临界胶束浓度测试说明该聚合物药物连接物容易形成胶束，细胞实验表明其对肝癌有很好的抑制作用。该聚合物药物连接物具有靶向智能释放药物的功能，粒径在100nm左右，有助于纳米粒子在肿瘤部位的穿透，而响应性断裂后，药物释放。本发明通过采用透明质酸聚合物靶向药物输送技术，肿瘤部位高浓度的谷胱甘肽作为靶点，设计研制了ha-ss-ves聚合物药物输送系统，增加藤黄酸靶向治疗作用、降低毒副作用、从而提高生物利用度。
本发明提供的聚合物胶束具有核-壳结构，亲水端即外壳为透明质酸，疏水端即内核为维生素e琥珀酸酯。本发明将透明质酸与维生素e琥珀酸酯通过二硫键做连接桥，制备成具有氧化还原响应性能的聚合物，在水中可以通过亲疏水作用力自发形成纳米胶束，具有生物降解性好、毒副作用小、响应性好等优点。聚合物胶束通过谷胱甘肽还原，可以在肿瘤部位及肿瘤细胞靶向释药以及实现药物蓄积，减少对正常组织的毒副作用、提高抗肿瘤作用。本发明的聚合物利用人体存在的透明质酸及天然维生素e琥珀酸酯在水中形成纳米胶束，可实现多种药物负载，在医药学领域具有很好的应用前景。
附图说明
图1a为实施例2制备的载药纳米胶束的粒径分布图。
图1b为实施例2制备的载药纳米胶束的zeta电位图。
图2为实施例2制备的载药纳米胶束的tem图。
图3为实施例2制备的载药纳米胶束在不同浓度的谷胱甘肽下药物释放的变化曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1透明质酸-s-s-维生素e琥珀酸酯聚合物(ha-ss-ves)制备
(一)制备方法
1、取维生素e琥珀酸酯(1.06g,2mmol)溶于50ml二氯甲烷中，在250ml圆底烧瓶中搅拌至全溶，冰浴下加入edc(13mmol)与hobt(13mmol)，室温避光搅拌过夜。于所得反应溶液中加入胱胺二盐酸盐(1.35g，6mmol)，另加入10ml甲醇助溶，加入三乙胺调节ph至7-8，搅拌24h，所得产物用1mol/l的nahco3水溶液洗涤，有机层加入无水硫酸镁干燥，过滤，40℃减压旋蒸除去二氯甲烷，真空干燥，得0.944g维生素e琥珀酸酯衍生物，产率71.1％。ms(esi)m/z(％):665.4[m+h]+；ir(kbr,cm-1)：3435，2922，2862，2369，1647，1749，1145，920。1hnmr(400mhz,chcl3):δ7.57(s,h),3.3-3.5(m,2h),2.9-3.2(m,2h),2.5(dt,1h),2.4-2.5(m,3h),2.1-2.3(m,9h),1.5-1.7(m,4h),1.0-1.4(m,17h),0.5-0.9(m,12h)。
2、将5g透明质酸(m3.5kda,0.5mmol)溶于20mlpbs缓冲溶液中，水合12h，冰浴下加入edc(13mmol)与nhs(13mmol)，避光搅拌过夜，得无色透明粘稠状液体。将1mmol维生素e琥珀酸酯衍生物溶于20mldmf中，冰浴下逐滴加入到无色透明粘稠状液体中，搅拌24h，将反应后溶液滴加至大量冰水中，收集沉淀，用水溶解后，透析两天(透析袋分子量为3.5kda，透析介质为蒸馏水)除去小分子药物及杂质，冻干，得白色晶莹状固体，即为透明质酸-s-s-维生素e琥珀酸酯聚合物(ha-ss-ves)。ir(kbr,cm-1):3442，2974，2926，2845，2574，1716，1640，1263，1172，1101，1039，947，813；相比单独透明质酸，产物一维h谱中出现化合物的化学位移，有1hnmr(dmso)δ7.46-7.60(m,2h)，1.5-1.7(m,4h),1.0-1.4(m,17h),0.5-0.9(m,12h)，可证明聚合物的合成成功。
实施例2ha-ss-ves载药纳米胶束
(一)载药纳米胶束的制备
取20mg藤黄酸和50mg聚合物ha-ss-ves，置于250ml茄形瓶中，加入10ml二氯甲烷进行溶解。40℃减压旋蒸除去二氯甲烷，得黄色药物薄膜，后加入50ml蒸馏水，在65℃水浴中水化4h，振荡摇匀。于冰浴中探头超声处理(超声波细胞破碎仪)3次，每次2min，超声功率为225w，过0.45μm微孔滤膜，即得ha-ss-ves聚合物载藤黄酸的载药纳米胶束溶液。
(二)载药纳米胶束水浴时间的考察
按(一)所述制备方法，改变水浴时间，在65℃水浴中，分别水化2、4、6、8h，以粒径、pdi与包封率为主要考察参数，结果如表1所示。水化时间由2h增加到8h时，纳米粒的粒径、包封率没有明显的差异，考虑节约时间，选择水化时间为2h。水化2h的纳米粒粒径为154.5nm，包封率为90.49％。
表1
(三)载药纳米胶束超声功率的考察
按(一)所述制备方法，改变超声功率大小，超声功率分别为45w、135w、225w、315w，其中功率为5％(45w)、15％(135w)的溶液超声后即有大量的沉淀产生，说明形成的纳米粒较少，大部分药物未被包载发生沉降。由表2可见，25％功率制得纳米粒溶液，粒径及pdi均比35％功率制得的纳米粒大。对于包封率，超声功率为35％时包封率最高，为90.65％，故选择超声功率为35％即315w。
表2
(四)载药纳米胶束药质比的考察
按(一)所述制备方法，改变藤黄酸与聚合物ha-ss-ves的质量比(m/m)，分别为1:10；1:5；1:2；1:1.25；1:1。以粒径、pdi与包封率为主要考察参数，结果如表3，由表3可见，藤黄酸与聚合物ha-ss-ves的质量比由1:10增加到1:1.25，包封率均较高。继续增加藤黄酸的量至比例为1:1，包封率下降，表明达到聚合物ha-ss-ves最大包裹藤黄酸的量。最终选择药物与聚合物ha-ss-ves的质量比为1:1.25。
表3
(五)按最优处方制备载药纳米胶束
取40mg藤黄酸和50mg聚合物ha-ss-ves，置于250ml茄形瓶中，加入10ml二氯甲烷进行溶解。40℃减压旋蒸除去二氯甲烷，得黄色药物薄膜，后加入50ml蒸馏水，在65℃水浴中水化2h，振荡摇匀。于冰浴中探头超声处理(超声波细胞破碎仪)3次，每次2min，超声功率为315w，过0.45μm微孔滤膜，即得ha-ss-ves聚合物载藤黄酸的载药纳米胶束溶液，如图1a及图1b所示，粒径为95.71nm，pdi为0.247，电位为-31.7mv，表明载药胶束粒径较小，可以进入肿瘤部位，穿透性良好，电位绝对值大于20，表明载药胶束稳定性好。
(六)载药纳米胶束tem观察
按上述(五)制备载药胶束，采用tem(透射电子显微镜)观察载药胶束的形态。将制得的载药纳米胶束溶液稀释5倍，吸取10μl滴加到200目的铜网上，自然晾干，再用0.2％的磷钨酸进行染色，晾干后，使用透射电镜进行观察纳米粒的形态，如图2所示，载药纳米胶束成均一球状，粒径小于100nm，形态良好。
(七)载药纳米胶束的谷胱甘肽敏感释放度考察
按上述(五)制备载药胶束，取1ml载药胶束，转移到透析袋(mwco，3.5kda)中，以10mlpbs(ph7.4)、0.1％(w/v)sds及gsh(0mm，2mm，10mm，40mm)为释放介质，释放时间为48h，温度为37℃，同时以不含gsh的透析液组作为对照，在不同时间间隔内取1ml透析液进行高效液相色谱分析，同时补充1ml相应的新鲜缓冲液以恢复体积。以高效液相色谱法检测释放药物浓度，结果如图3。由图3可见，在0mm及2μm浓度的谷胱甘肽下，共聚物几乎不断裂，释放量少，说明其在低浓度谷胱甘肽含量下可以保持一定的稳定性，而在10mm及40mm的谷胱甘肽浓度下，释放迅速。在40mm的谷胱甘肽浓度下，10h即可达到65％左右的释放量，说明其具有优良的响应性能。