本发明属生物医用材料领域，具体涉及一种基于酶交联的聚乙二醇类化学水凝胶及其制备方法。
背景技术：
水凝胶因高含水量和良好的生物相容性而成为一类重要的生物医用材料，在诸多领域都极具应用前景。目前，可注射性化学交联水凝胶因其操作便利性、微创性、良好的病灶腔隙匹配性以及凝胶性能的可控性受到广泛关注。可注射性化学交联水凝胶可由两组分或多组分前驱体溶液混合制备得到，前驱体溶液在混合前因良好的流动性可负载生长因子、细胞和药物等，两组分或多组分前驱体溶液一旦混合注射到体内即在原位形成化学交联水凝胶，这一优势使得可注射性化学交联水凝胶可用于组织工程、细胞培养以及药物输送等多个生物医学领域。
聚乙二醇类化学交联水凝胶是可注射性化学交联水凝胶的重要组成部分，其良好的生物相容性使得聚乙二醇类水凝胶在生物医用研究领域占有独特优势。然而，由于线性聚乙二醇链仅含有位于端基的两个功能基团，因此很难直接对聚乙二醇链进行多功能基团修饰，由此限制了线性聚乙二醇类水凝胶的合成与发展。2015年发表在journalofmaterialschemistryb上的一篇文章(cao,l.pet.al.journalofmaterialschemistryb2015,3,(7),1268-1280.)是通过在线性聚乙二醇链的侧链上引入多个醛基功能基团，成功实现线性聚乙二醇链的多功能基团修饰，为合成聚乙二醇类水凝胶奠定了良好基础。但该聚乙二醇的合成过程中涉及到阴离子聚合及后处理反应，整个反应过程复杂，需要严格控制无水无氧条件，并有诸多影响因素，因此设计出一条反应温和的合成功能化聚乙二醇的路线显得尤为重要。同时，将酶交联反应体系引入聚乙二醇类水凝胶的合成中，更有利于方便调控水凝胶的凝胶化时间和力学强度等理化性质。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种基于酶交联的聚乙二醇类水凝胶及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于酶交联的聚乙二醇类化学水凝胶体系的ph值为6.0-8.0，以酚羟基功能化修饰的聚乙二醇类线性聚合物为大单体，以辣根过氧化物酶溶液为催化剂，在酶催化反应底物过氧化氢溶液存在的条件下原位发生酶交联反应形成三维网络结构。
凝胶体系中具体包括如下体积分数的组份：浓度为4-30wt％的酚羟基功能化修饰的聚乙二醇类线性聚合物溶液20％-90％、浓度为0.01-1mg/ml的辣根过氧化物酶溶液5％-40％、浓度为0.02-0.08wt％的过氧化氢溶液5％-40％；
以上三种组分的溶媒均为纯水、注射用水、生理盐水、缓冲溶液、动植物或人体的体液、组织培养液、细胞培养液的任一种；
本发明聚乙二醇类水凝胶中酚羟基功能化修饰的聚乙二醇类线性聚合物平均分子量为5000-100000，优选20000-80000，侧链酚羟基功能基团的修饰率为5-90％，优选5-50％，结构式为：
其中，r为
所述结构式或为：
其中，r为
所述结构式或为：
其中，r为
酚羟基功能化修饰的聚乙二醇类线性聚合物的主链为线性聚乙二醇二丙烯酸酯大单体与二硫苏糖醇、1，4-二巯基-2-丁醇、3，4-二巯基-1-丁醇、2，4-二巯基-1-丁醇、1，4-二巯基-3-甲基-2-丁醇、2，3-二氨基-1，4-二硫醇、2-氨基-1，4-二硫醇或3-氨基-1，5-二硫醇中的任一种形成的交替共聚物，线性聚乙二醇二丙烯酸酯大单体平均分子量范围为200-2000。
聚乙二醇类线性聚合物侧链接有酚羟基功能基团，剩余侧链基团可以是亲水的氨基、羧基、咪唑基、醛基、氰基、硝基、氨基酸、糖基、核酸中的任何一种；也可以是疏水的烷基、固醇、烷氧基、芳香基、芳杂环基、酰胺酯基、卤素原子、三氯甲基、酯基、巯基中的任一种。
本发明的有益效果在于：本发明所制备的聚乙二醇类化学交联水凝胶具有良好的生物相容性、可降解性及凝胶的柔顺性，凝胶化时间可调控在5-450s，成胶速度快，弹性模量可调控在100-10000pa。采用迈克尔加成反应、酯化(或酰胺化)反应结合酶交联反应形成可注射性水凝胶，能够有效提高线性聚乙二醇侧链功能基团的修饰率，解决线性聚乙二醇只能进行端基功能基团修饰的难题，拓宽线性聚乙二醇的应用前景，设计合成更多新型线性聚乙二醇类水凝胶，在组织工程、药物控释、再生医学等领域有广阔的应用前景。
该聚乙二醇类化学交联水凝胶可以用于制备凝胶缓释注射剂，呈溶液状态的前驱体溶液可以包载蛋白质药物，制成凝胶缓释注射剂，经皮下、腔内、腹腔、胸腔、椎管内、瘤内、瘤周、动脉、淋巴结或骨髓内注射给药，凝胶制剂在体内原位成胶之后，包裹的蛋白质药物不仅可以缓慢释放还可维持较高的药物浓度，并能增加药物的敏感性，释药周期可以调控从数小时到数周，对牛血清白蛋白、溶菌酶和胰岛素中的任一种蛋白质具有缓释作用，缓释周期可达100-1000h。
聚乙二醇类化学交联水凝胶也可以用于三维培养人间充质干细胞、大鼠间充质干细胞、软骨细胞、上皮细胞和成纤维细胞中的任一种或多种，维持不同细胞的生物学活力。
聚乙二醇类化学交联水凝胶还可以作为组织工程支架材料，呈溶液状态的前驱体溶液可以包载细胞，通过注射方式将组织工程支架/细胞复合物与组织缺损部位腔隙匹配，凝胶组织工程支架在体内原位成胶之后，包裹的细胞在支架中生长、增殖和分化，存活状态良好。这种负载细胞的可注射性聚乙二醇类化学交联水凝胶有望在组织工程领域对促进组织修复起到一定的效果。
本发明还提供了一种基于酶交联的聚乙二醇类水凝胶制备方法，具体步骤如下：
a、制备线性聚合物1：取聚乙二醇二丙烯酸酯大单体溶解于二甲基亚砜溶剂中，加入小分子单体，完全溶解后加入催化剂进行迈克尔加成反应24-48h；然后，再加入封端剂继续反应4-12h；减压蒸馏除去部分溶剂，不良溶剂沉降产物，真空干燥，透析除去残留的小分子，冷冻干燥得到线性聚合物1投入下一步反应；
所述的聚乙二醇二丙烯酸酯大单体的平均分子量范围为200-2000，所述的小分子单体包括二硫苏糖醇、1，4-二巯基-2-丁醇、3，4-二巯基-1-丁醇、2，4-二巯基-1-丁醇、1，4-二巯基-3甲基-2-丁醇、2，3-二氨基-1，4-二硫醇、2-氨基-1，4-二硫醇或3-氨基-1，5-二硫醇，所述的催化剂为乙醇钠、氢化钠、氨基钠、三乙胺、二异丙基氨基锂或六甲基二硅氨基锂，所述的封端剂为丙烯酰胺、n-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、双丙酮丙烯酰胺、n-苯基丙烯酰胺、n-叔丁基丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酸-2-羟基乙酯或乙烯基吡咯烷酮；
b、制备功能化的线性聚合物2：将上述得到的线性聚合物1、催化剂和脱水剂溶解于无水四氢呋喃中，将用于侧链修饰的小分子按不同修饰比溶解于少量无水四氢呋喃中，通过微量注射泵将溶有小分子的四氢呋喃溶液加入反应体系，反应24-48h，过滤，旋蒸，沉降，真空干燥，透析除去残留的小分子，冷冻干燥得到功能化的线性聚合物2，投入第三步的酶交联反应中；
所述的进行侧链修饰的小分子为对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸、对羟基苯丙酸、3，4-二羟基苯甲酸、3，4-二羟基苯乙酸、3，4-二羟基苯丙酸或对羟基苯氨基甲酰氯，所述的脱水剂为n，n'-二异丙基碳二亚胺、n，n'-二异丙基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述的催化剂为4-二甲氨基吡啶、n-羟基琥珀酰亚胺或n-羟基硫代琥珀酰亚胺。
c、成胶：配制功能化的线性聚合物2的水溶液、过氧化氢水溶液和辣根过氧化物酶水溶液，将三组份溶液按权利要求1所述的体积分数均匀混合，通过酶交联反应获得所述线性聚乙二醇类化学交联水凝胶。
本发明制备方法的有益效果在于：本发明提出的这种基于酶交联的聚乙二醇类水凝胶，是通过聚乙二醇二丙烯酸酯与二硫苏糖醇、1，4-二巯基-2-丁醇、3，4-二巯基-1-丁醇、2，4-二巯基-1-丁醇、1，4-二巯基-3甲基-2-丁醇、2，3-二氨基-1，4-二硫醇、2-氨基-1，4-二硫醇或3-氨基-1，5-二硫醇中的任一种在温和条件下发生迈克尔加成反应，从而在侧链上引入多个功能基团；然后通过酯化(或酰胺化)反应在线性聚乙二醇侧链上修饰酚羟基功能基团，为酶交联提供交联位点；最后，在过氧化氢存在的条件下，辣根过氧化物酶催化酚羟基功能基团之间的交联制备合成聚乙二醇类化学交联水凝胶；混合前两组分或多组分前驱体呈可流动的溶液状态，混合后呈现凝胶状态，所制备的聚乙二醇类化学交联水凝胶具有可注射性，其两组分或多组分前驱体呈溶液状态，混合注射进入体内后，在热血动物生理条件下(即ph值约为7且温度约为37℃)能够形成原位水凝胶，从而使凝胶制剂或者组织工程凝胶材料的制备过程简单实用，实际操作和应用非常方便。
附图说明
图1为本发明中酶交联水凝胶形成机理图；
图2为本发明实施例14中侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2a的16wt％溶液、0.05mg/ml辣根过氧化物酶溶液和不同浓度过氧化氢溶液混合形成的聚乙二醇类化学交联水凝胶的弹性模量和粘性模量随时间变化图；
图3为本发明中线性聚乙二醇和功能化后的线性聚乙二醇的细胞毒性实验结果；
图4为牛血清白蛋白从本发明聚乙二醇类水凝胶中的释放曲线；
图5为人间充质干细胞在本发明聚乙二醇类水凝胶中的三维培养结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg400da)和1，4-二巯基-2-丁醇，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2ml三乙胺溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应24h后，加入0.40gn-异丙基丙烯酰胺封端继续反应4h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1a。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1a的数均与重均分子量(mn，mw)分别为5500和6800，分子量分布系数(mw/mn)为1.24。
实施例2
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg700da)和二硫苏糖醇(dtt)，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2ml三乙胺溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应24h后，加入0.40g丙烯酰胺封端继续反应4h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1bpeg700da-dtt。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1bpeg700da-dtt的数均与重均分子量(mn，mw)分别为58900和81300，分子量分布系数(mw/mn)为1.38。
实施例3
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg1500da)和3，4-二巯基-1-丁醇，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2g乙醇钠溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应48h后，加入0.40gn-异丙基丙烯酰胺封端继续反应8h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1c。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1c的数均与重均分子量(mn，mw)分别为85000和125000，分子量分布系数(mw/mn)为1.48。
实施例4
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg2000da)和2，4-二巯基-1-丁醇，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2g氢化钠溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应36h后，加入0.40gn-异丙基丙烯酰胺封端继续反应4h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1d。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1d的数均与重均分子量(mn，mw)分别为95000和141000，分子量分布系数(mw/mn)为1.49。
实施例5
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg700da)和1，4-二巯基-3甲基-2-丁醇，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2ml三乙胺溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应24h后，加入0.40g甲基丙烯酰胺封端继续反应12h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1e。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1e的数均与重均分子量(mn，mw)分别为23000和31000，分子量分布系数(mw/mn)为1.35。
实施例6
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg700da)和2，3-二氨基-1，4-二硫醇，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2g氨基钠溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应24h后，加入0.40g双丙酮丙烯酰胺封端继续反应4h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1f。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1f的数均与重均分子量(mn，mw)分别为42000和57500，分子量分布系数(mw/mn)为1.37。
实施例7
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg700da)和2-氨基-1，4-二硫醇，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2ml三乙胺溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应24h后，加入0.40gn-异丙基丙烯酰胺封端继续反应4h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1g。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1g的数均与重均分子量(mn，mw)分别为38000和49000，分子量分布系数(mw/mn)为1.29。
实施例8
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg1000da)和3-氨基-1，5-二硫醇，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2g二异丙基氨基锂溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应24h后，加入0.40gn-苯基丙烯酰胺封端继续反应4h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1h。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1h的数均与重均分子量(mn，mw)分别为37600和50000，分子量分布系数(mw/mn)为1.33。
实施例9
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg1250da)和二硫苏糖醇(dtt)，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2ml三乙胺溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应28h后，加入0.40gn-叔丁基丙烯酰胺封端继续反应4h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1i。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1i的数均与重均分子量(mn，mw)分别为45000和60000，分子量分布系数(mw/mn)为1.34。
实施例10
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg1750da)和二硫苏糖醇(dtt)，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2g六甲基二硅氨基锂溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应24h后，加入0.40g二甲基丙烯酰胺封端继续反应4h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1j。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1j的数均与重均分子量(mn，mw)分别为43000和56700，分子量分布系数(mw/mn)为1.32。
实施例11
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg400da)和3-氨基-1，5-二硫醇，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2ml三乙胺溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应26h后，加入0.40g丙烯酸封端继续反应4h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1k。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1k的数均与重均分子量(mn，mw)分别为12500和16300，分子量分布系数(mw/mn)为1.31。
实施例12
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg1800da)和二硫苏糖醇(dtt)，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2g乙醇钠溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应24h后，加入0.40g甲基丙烯酸-2-羟基乙酯封端继续反应10h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1l。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1l的数均与重均分子量(mn，mw)分别为40400和55000，分子量分布系数(mw/mn)为1.36。
实施例13
在1l三口烧瓶中先加入摩尔比为1:1的聚乙二醇二丙烯酸酯(peg700da)和3，4-二巯基-1-丁醇，再加入400ml二甲基亚砜，磁子搅拌至完全溶解；随后量取0.2ml三乙胺溶于10ml二甲基亚砜中，通过微量注射泵缓慢注射到上述反应体系中，室温下催化进行迈克尔加成反应。体系在室温下反应28h后，加入0.40g乙烯基吡咯烷酮封端继续反应4h。反应完毕后，减压蒸馏除去大部分二甲基亚砜，粗产物在大量的甲苯中沉降；在-20℃下沉降24h后，小心倾倒上层的甲苯溶液，真空干燥24h得到线性聚合物1m。采用聚苯乙烯作为标样，通过凝胶渗透色谱仪测定所述线性聚合物1m的数均与重均分子量(mn，mw)分别为39400和54400，分子量分布系数(mw/mn)为1.38。
实施例14
在100ml茄形瓶中先依次加入摩尔比为7.1:1:0.9:0.2的实施例2中线性聚合物1bpeg700da-dtt、对羟基苯丙酸、n，n-二环己基碳二亚胺(dcc)和4-(二甲氨基)吡啶(dmap)，在氩气氛围保护下抽换气三次，再加入60ml无水四氢呋喃，磁子搅拌至完全溶解，并在氩气氛围保护下室温反应24h。之后加入数滴水将过量的dcc转化为不溶的n，n-二环己基脲盐(dcu)使反应终止，砂芯漏斗过滤除去dcu，滤液旋蒸除去约10ml四氢呋喃，加入大量冷乙醚-20℃下沉降过夜。分离除去上层乙醚溶液，真空干燥箱48h后得到粗产物。初产物透析两天后，冷冻干燥得到最终产物侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2a。此线性聚合物溶于水，并对其进行核磁表征，计算得到该线性聚合物的功能基团修饰率为13.0％。
实施例15
在100ml茄形瓶中先依次加入摩尔比为20.4:1:0.3:1.1的实施例3中线性聚合物1c、对羟基苯甲酸、n，n'-二异丙基碳二亚胺和4-(二甲氨基)吡啶(dmap)，在氩气氛围保护下抽换气三次，再加入60ml无水四氢呋喃，磁子搅拌至完全溶解，并在氩气氛围保护下室温反应30h。滤液旋蒸除去约10ml四氢呋喃，加入大量冷乙醚-20℃下沉降过夜。分离除去上层乙醚溶液，真空干燥箱48h后得到粗产物。初产物透析两天后，冷冻干燥得到最终产物侧链由对羟基苯甲酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2b。此线性聚合物溶于水，对其进行核磁表征，计算得到该线性聚合物的功能基团修饰率为4.8％。
实施例16
在100ml茄形瓶中先依次加入摩尔比为0.58:1:0.9:0.2的实施例2中线性聚合物1bpeg700da-dtt、对羟基苯丙酸、n，n-二环己基碳二亚胺(dcc)和4-(二甲氨基)吡啶(dmap)，在氩气氛围保护下抽换气三次，再加入60ml无水四氢呋喃，磁子搅拌至完全溶解，并在氩气氛围保护下室温反应24h。之后加入数滴水将过量的dcc转化为不溶的n，n-二环己基脲盐(dcu)使反应终止，砂芯漏斗过滤除去dcu，滤液旋蒸除去约10ml四氢呋喃，加入大量冷乙醚-80℃下沉降过夜。分离除去上层乙醚溶液，真空干燥箱48h后得到粗产物。初产物透析两天后，冷冻干燥得到最终产物侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2c。此线性聚合物不溶于水，对其进行核磁表征，计算得到该线性聚合物的功能基团修饰率为90.0％。
实施例17
在100ml茄形瓶中先依次加入摩尔比为8.5:1:0.9:0.2的实施例4中线性聚合物1d、对羟基苯乙酸、n，n-二环己基碳二亚胺(dcc)和n-羟基琥珀酰亚胺，在氩气氛围保护下抽换气三次，再加入60ml无水四氢呋喃，磁子搅拌至完全溶解，并在氩气氛围保护下室温反应28h。之后加入数滴水将过量的dcc转化为不溶的n，n-二环己基脲盐(dcu)使反应终止，砂芯漏斗过滤除去dcu，滤液旋蒸除去约10ml四氢呋喃，加入大量冷乙醚-20℃下沉降过夜。分离除去上层乙醚溶液，真空干燥箱48h后得到粗产物。初产物透析两天后，冷冻干燥得到最终产物侧链由对羟基苯乙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2d。此线性聚合物溶于水，对其进行核磁表征，计算得到该线性聚合物的功能基团修饰率为10.2％。
实施例18
在100ml茄形瓶中先依次加入摩尔比为10.2:1:0.9:0.2的实施例5中线性聚合物1e、3，4-二羟基苯甲酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-(二甲氨基)吡啶(dmap)，在氩气氛围保护下抽换气三次，再加入60ml无水四氢呋喃，磁子搅拌至完全溶解，并在氩气氛围保护下室温反应48h。滤液旋蒸除去约10ml四氢呋喃，加入大量冷乙醚-80℃下沉降过夜。分离除去上层乙醚溶液，真空干燥箱48h后得到粗产物。初产物透析两天后，冷冻干燥得到最终产物侧链由3，4-二羟基苯甲酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2e。此线性聚合物溶于水，对其进行核磁表征，计算得到该线性聚合物的功能基团修饰率为8.7％。
实施例19
在100ml茄形瓶中先依次加入摩尔比为7.1:1:0.9:0.2的实施例7中线性聚合物1g、对羟基苯丙酸、n，n-二环己基碳二亚胺(dcc)和n-羟基琥珀酰亚胺，在氩气氛围保护下抽换气三次，再加入60ml无水四氢呋喃，磁子搅拌至完全溶解，并在氩气氛围保护下室温反应48h。之后加入数滴水将过量的dcc转化为不溶的n，n-二环己基脲盐(dcu)使反应终止，砂芯漏斗过滤除去dcu，滤液旋蒸除去约10ml四氢呋喃，加入大量冷乙醚-80℃下沉降过夜。分离除去上层乙醚溶液，真空干燥箱48h后得到粗产物。初产物透析两天后，冷冻干燥得到最终产物侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2f。此线性聚合物溶于水，对其进行核磁表征，计算得到该线性聚合物的功能基团修饰率为13.2％。
实施例20
在100ml茄形瓶中先依次加入摩尔比为5.5:1:1.1:0.3的实施例8中线性聚合物1h、3，4-二羟基苯乙酸、n，n-二环己基碳二亚胺(dcc)和n-羟基硫代琥珀酰亚胺，在氩气氛围保护下抽换气三次，再加入60ml无水四氢呋喃，磁子搅拌至完全溶解，并在氩气氛围保护下室温反应48h。之后加入数滴水将过量的dcc转化为不溶的n，n-二环己基脲盐(dcu)使反应终止，砂芯漏斗过滤除去dcu，滤液旋蒸除去约10ml四氢呋喃，加入大量冷乙醚-20℃下沉降过夜。分离除去上层乙醚溶液，真空干燥箱48h后得到粗产物。初产物透析两天后，冷冻干燥得到最终产物侧链由3，4-二羟基苯乙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2g。此线性聚合物溶于水，对其进行核磁表征，计算得到该线性聚合物的功能基团修饰率为16.7％。
实施例21
在100ml茄形瓶中先依次加入摩尔比为7.1:1:0.9:0.2的实施例10中线性聚合物1j、3，4-二羟基苯丙酸、n，n'-二异丙基碳二亚胺和4-(二甲氨基)吡啶(dmap)，在氩气氛围保护下抽换气三次，再加入60ml无水四氢呋喃，磁子搅拌至完全溶解，并在氩气氛围保护下室温反应24h。滤液旋蒸除去约10ml四氢呋喃，加入大量冷乙醚-80℃下沉降过夜。分离除去上层乙醚溶液，真空干燥箱48h后得到粗产物。初产物透析两天后，冷冻干燥得到最终产物侧链由3，4-二羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2h。此线性聚合物溶于水，对其进行核磁表征，计算得到该线性聚合物的功能基团修饰率为12.9％。
实施例22
在100ml茄形瓶中先依次加入摩尔比为5.5:1:1.1:0.3的实施例12中线性聚合物1l、对羟基苯氨基甲酰氯、n，n-二环己基碳二亚胺(dcc)和n-羟基琥珀酰亚胺，在氩气氛围保护下抽换气三次，再加入60ml无水四氢呋喃，磁子搅拌至完全溶解，并在氩气氛围保护下室温反应40h。之后加入数滴水将过量的dcc转化为不溶的n，n-二环己基脲盐(dcu)使反应终止，砂芯漏斗过滤除去dcu，滤液旋蒸除去约10ml四氢呋喃，加入大量冷乙醚-80℃下沉降过夜。分离除去上层乙醚溶液，真空干燥箱48h后得到粗产物。初产物透析两天后，冷冻干燥得到最终产物侧链由对羟基苯氨基甲酰氯修饰的聚乙二醇类线性聚合物2i。此线性聚合物溶于水，对其进行核磁表征，计算得到该线性聚合物的功能基团修饰率为17.5％。
实施例23
将实施例14中的侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2a加入去离子水，配制成重量百分比浓度为16wt％的样品，通过磁力搅拌，使得聚合物发生溶解制备相应的水溶液。用去离子水配置浓度为0.05mg/ml的辣根过氧化物酶溶液和浓度为0.06wt％的过氧化氢溶液，将三组份按酚羟基功能化修饰的聚乙二醇类线性聚合物溶液50％、辣根过氧化物酶溶液25％、过氧化氢溶液25％的体积分数混合后得到聚乙二醇化学交联水凝胶。
实施例24
将实施例17中的侧链由对羟基苯乙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2d加入去离子水，配制成重量百分比浓度为4wt％的样品，通过磁力搅拌，使得聚合物发生溶解制备相应的水溶液。用去离子水配置浓度为1mg/ml的辣根过氧化物酶溶液和浓度为0.08wt％的过氧化氢溶液，将三组份按酚羟基功能化修饰的聚乙二醇类线性聚合物溶液90％、辣根过氧化物酶溶液5％、过氧化氢溶液5％的体积分数混合后得到聚乙二醇化学交联水凝胶。
实施例25
将实施例18中的侧链由3，4-二羟基苯甲酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2e加入去离子水，配制成重量百分比浓度为24wt％的样品，通过磁力搅拌，使得聚合物发生溶解制备相应的水溶液。用去离子水配置浓度为0.01mg/ml的辣根过氧化物酶溶液和浓度为0.08wt％的过氧化氢溶液，将三组份按酚羟基功能化修饰的聚乙二醇类线性聚合物溶液60％、辣根过氧化物酶溶液10％、过氧化氢溶液30％的体积分数混合后得到聚乙二醇化学交联水凝胶。
实施例26
将实施例20中的侧链由3，4-二羟基苯乙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2g加入去离子水，配制成重量百分比浓度为30wt％的样品，通过磁力搅拌，使得聚合物发生溶解制备相应的水溶液。用去离子水配置浓度为0.01mg/ml的辣根过氧化物酶溶液和浓度为0.02wt％的过氧化氢溶液，将三组份按酚羟基功能化修饰的聚乙二醇类线性聚合物溶液20％、辣根过氧化物酶溶液40％、过氧化氢溶液40％的体积分数混合后得到聚乙二醇化学交联水凝胶。
实施例27
将实施例21中的侧链由3，4-二羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2h加入去离子水，配制成重量百分比浓度为15wt％的样品，通过磁力搅拌，使得聚合物发生溶解制备相应的水溶液。用去离子水配置浓度为0.05mg/ml的辣根过氧化物酶溶液和浓度为0.04wt％的过氧化氢溶液，将三组份按酚羟基功能化修饰的聚乙二醇类线性聚合物溶液70％、辣根过氧化物酶溶液15％、过氧化氢溶液15％的体积分数混合后得到聚乙二醇化学交联水凝胶。
实施例28
将实施例22中的侧链由对羟基苯氨基甲酰氯修饰的聚乙二醇类线性聚合物2i加入去离子水，配制成重量百分比浓度为10wt％的样品，通过磁力搅拌，使得聚合物发生溶解制备相应的水溶液。用去离子水配置浓度为0.05mg/ml的辣根过氧化物酶溶液和浓度为0.04wt％的过氧化氢溶液，将三组份按酚羟基功能化修饰的聚乙二醇类线性聚合物溶液50％、辣根过氧化物酶溶液20％、过氧化氢溶液30％的体积分数混合后得到聚乙二醇化学交联水凝胶。
实施例29
用倒管法测定16wt％的实施例14中的侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2a溶液、0.06wt％的过氧化氢溶液和不同浓度辣根过氧化物酶溶液混合形成的聚乙二醇类化学交联水凝胶的凝胶化时间，即聚合物溶液和过氧化氢溶液的浓度一定时，与不同浓度辣根过氧化物酶溶液混合形成的凝胶样品其凝胶化时间变化范围为60-300s。
实施例30
用倒管法测定24wt％的实施例21中的侧链3，4-二羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2h溶液、0.08wt％的过氧化氢溶液和不同浓度辣根过氧化物酶溶液混合形成的聚乙二醇类化学交联水凝胶的凝胶化时间，即聚合物溶液和过氧化氢溶液的浓度一定时，与不同浓度辣根过氧化物酶溶液混合形成的凝胶样品其凝胶化时间变化范围为5-450s。
实施例31
用动态流变仪测定实施例14中16wt％的侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2a溶液、0.05mg/ml辣根过氧化物酶溶液和不同浓度过氧化氢溶液混合形成的聚乙二醇类化学交联水凝胶的弹性模量和粘性模量随时间变化，即聚合物溶液和辣根过氧化物酶溶液的浓度一定时，与不同浓度过氧化氢溶液混合形成的凝胶样品其弹性模量和粘性模量随时间的变化图，结果如图2，图中过氧化氢浓度值为混合之后浓度，水凝胶弹性模量范围在600-3500pa。
实施例32
用动态流变仪测定实施例19中25wt％的侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2f溶液、0.05mg/ml辣根过氧化物酶溶液和不同浓度过氧化氢溶液混合形成的聚乙二醇类化学交联水凝胶的弹性模量和粘性模量随时间变化，即聚合物溶液和辣根过氧化物酶溶液的浓度一定时，与不同浓度过氧化氢溶液混合形成的凝胶样品其弹性模量和粘性模量随时间的变化图，水凝胶弹性模量范围在100-10000pa。
实施例33
研究了实施例2中的线性聚合物1b以及实施例14中的侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2a材料的细胞毒性，将两种聚合物分别配置成0、0.25、0.5、1、2、4mg/ml一系列浓度梯度的培养基溶液，将这些溶液用0.22μm过滤头过滤灭菌处理，再实验考察其对人间充质干细胞活力的影响。首先培养过表达lifeact-egfp人间充质干细胞，扩增到100万～300万个。在96孔板上种细胞，细胞密度为3000个/孔，用cck-8试剂盒检测24h后细胞的活力情况，结果如图3。由图3可知，24h后细胞活力大部分维持在100％左右。
实施例34
研究了实施例8中的线性聚合物1h以及实施例20中的侧链由3，4-二羟基苯乙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2g材料的细胞毒性，将两种聚合物分别配置成0、0.25、0.5、1、2、4mg/ml一系列浓度梯度的培养基溶液，将这些溶液用0.22μm过滤头过滤灭菌处理，再实验考察其对大鼠间充质干细胞活力的影响。首先培养过表达lifeact-egfp大鼠间充质干细胞，扩增到100万～300万个。在96孔板上种细胞，细胞密度为3000个/孔，用cck-8试剂盒检测24h后细胞的活力大部分维持在90％以上。
实施例35
取实施例14中16wt％的侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2a溶液，加入牛血清白蛋白粉末分别配置成牛血清白蛋白浓度为4mg/ml和8mg/ml的聚合物溶液，分别取0.25g上述含牛血清白蛋白的聚合物溶液于试管中，加入0.05mg/ml辣根过氧化物酶溶液和0.07wt％过氧化氢溶液制成载药凝胶，加5ml释放介质pbs。定期取点，将样品稀释后用microbca试剂盒测相应的牛血清白蛋白含量。所得释放曲线如图4所示，缓释周期可达550h。
实施例36
取实施例18中4wt％的侧链由3，4-二羟基苯甲酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2e溶液，加入牛血清白蛋白粉末分别配置成牛血清白蛋白浓度为4mg/ml和8mg/ml的聚合物溶液，分别取0.25g上述含牛血清白蛋白的聚合物溶液于试管中，加入0.05mg/ml辣根过氧化物酶溶液和0.04wt％过氧化氢溶液制成载药凝胶，加5ml释放介质pbs。定期取点，将样品稀释后用microbca试剂盒测相应的牛血清白蛋白含量，缓释周期可达100h。
实施例37
取实施例20中30wt％的侧链由3，4-二羟基苯乙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2g溶液，加入牛血清白蛋白粉末分别配置成牛血清白蛋白浓度为5mg/ml和10mg/ml的聚合物溶液，分别取0.25g上述含牛血清白蛋白的聚合物溶液于试管中，加入0.05mg/ml辣根过氧化物酶溶液和0.08wt％过氧化氢溶液制成载药凝胶，加5ml释放介质pbs。定期取点，将样品稀释后用microbca试剂盒测相应的牛血清白蛋白含量，缓释周期可达1000h。
实施例38
取实施例22中20wt％的侧链由对羟基苯氨基甲酰氯修饰的聚乙二醇类线性聚合物2i溶液，加入溶菌酶粉末分别配置成溶菌酶浓度为10mg/ml和20mg/ml的聚合物溶液，分别取0.25g上述含溶菌酶的聚合物溶液于试管中，加入0.05mg/ml辣根过氧化物酶溶液和0.06wt％过氧化氢溶液制成载药凝胶，加5ml释放介质pbs。定期取点，将样品稀释后用microbca试剂盒测相应的溶菌酶含量，缓释周期可达400h。
实施例39
取实施例14中30wt％的侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2a溶液，加入胰岛素粉末分别配置成胰岛素浓度为4mg/ml和8mg/ml的聚合物溶液，分别取0.25g上述含胰岛素的聚合物溶液于试管中，加入0.05mg/ml辣根过氧化物酶溶液和0.08wt％过氧化氢溶液制成载药凝胶，加5ml释放介质pbs。定期取点，将样品稀释后用microbca试剂盒测相应的胰岛素含量，缓释周期可达500h。
实施例40
研究了实施例14中的侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2a溶液、0.05mg/ml辣根过氧化物酶溶液和0.06wt％过氧化氢溶液混合形成的聚乙二醇类化学交联水凝胶三维培养人间充质干细胞的情况。制备0.5ml水凝胶，用于包载过表达lifeact-egfp人间充质干细胞，细胞密度为500万个/ml，通过激光共聚焦显微镜动态追踪活细胞，激光器激发波长为488nm，高压80～110v，激光功率为5～10w，观察24h、48h和72h不同时间点细胞的形态和活力状态，结果如图5。由图5可知，随时间增加细胞数量以及荧光强度均增加，表示细胞活力增加。
实施例41
研究了实施例17中的侧链由对羟基苯乙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2d溶液、0.08mg/ml辣根过氧化物酶溶液和0.06wt％过氧化氢溶液混合形成的聚乙二醇类化学交联水凝胶三维培养大鼠间充质干细胞的情况。制备0.5ml水凝胶，用于包载过表达lifeact-egfp大鼠间充质干细胞，细胞密度为500万个/ml，通过激光共聚焦显微镜动态追踪活细胞，激光器激发波长为488nm，高压80～110v，激光功率为5～10w，观察24h、48h和72h不同时间点细胞的形态和活力状态，随时间增加细胞数量以及荧光强度均增加，表示细胞活力增加。
实施例42
研究了实施例19中的侧链由对羟基苯丙酸修饰的聚乙二醇类线性聚合物2f溶液、0.04mg/ml辣根过氧化物酶溶液和0.08wt％过氧化氢溶液混合形成的聚乙二醇类化学交联水凝胶三维培养人间充质干细胞和大鼠间充质干细胞的情况。制备0.5ml水凝胶，用于包载过表达lifeact-egfp人间充质干细胞和大鼠间充质干细胞，细胞密度为500万个/ml，通过激光共聚焦显微镜动态追踪活细胞，激光器激发波长为488nm，高压80～110v，激光功率为5～10w，观察24h、48h和72h不同时间点细胞的形态和活力状态，随时间增加细胞数量以及荧光强度均增加，表示细胞活力增加。
上述实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。