一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物环氧合酶2活性抑制的方法与流程

本发明属于海洋药物、酶工程学及天然产物分析技术领域，尤其涉及一种快速筛选天然产物中cox-2抑制剂的方法，具体地说，涉及利用固定化酶技术与色谱、质谱联用技术从天然产物提取物中快速筛选cox-2酶抑制剂的方法。

背景技术

cox是一种催化aa生成pgs的血红素酶。许多组织中存在的pgs会引起炎症和疼痛。aa产生的pgs主要由cox-2酶催化，这是一种诱导型的cox同工酶，在炎症和肿瘤形成中起重要作用。cox-2酶还可以作用于中枢神经引起痛觉过敏，并与肾病的发生有关。由于选择性地抑制cox-2酶不仅避免了与cox-1酶抑制相关的主要副作用，而且保留了经典的非甾体抗炎药物的所有优点，因此该酶已成为发现和发展抗炎或抗肿瘤药物的重要药物靶点。

在过去的几十年中，发现cox-2选择性抑制剂的技术，包括hplc、lc-ms、超滤lc-ms、虚拟筛选方法、生物分析等，得到了越来越多的报道。其中一些方法使用培养的细胞系，不仅耗时，还需要特殊的实验技能。由于使用纯化或重组酶的检测比基于细胞的检测更简单、更方便和更省时，所以最近扩大了用于筛选cox-2选择性抑制剂的商业化纯化或重组cox-2的用途。然而，在商业上提供的cox-2仍然非常昂贵，而且成本可能是限制体外检测方法进一步应用于筛选cox-2选择性抑制剂的核心瓶颈。用固定化的cox-2代替游离的cox-2是克服游离酶在体外筛选cox-2选择性抑制剂的成本高、不可回收等缺点的关键。

与游离酶相比，固定化酶具有许多优点，包括可重复利用性、长时间储存、低成本、更适宜的ph和温度等。固定化酶的稳定性随着多点或多亚基固定化的发生而增加。此外，固定化酶的选择性和特异性在不同的实验条件下也有很大的差异。为了通过固定化来改善酶的性质，需要开发新的固定化系统(如新材料、改进的应用、可视化技术等)，以及对酶与活性固体相互作用机理的深入了解。基于靶配体结合作用的亲和固定化技术的应用已经逐渐成熟。固定化最简单、最温和的耦合方法之一是通过ga与水不溶性载体共价结合，在水缓冲液中进行反应，因为该缓冲液提供了接近生理ph、离子强度和温度的条件。

海洋药物，因其特殊的生长环境，如高盐、高压、寡营养盐、低温，但相对恒温（火山口附近有高温、极地地区还有超低温）以及有限的光照和缺氧等，以及生物的多样性，其次生代谢产物与陆源生物有极大不同，其中不乏结构新颖、功能独特的天然活性成份。然而，传统海洋天然产物化学研究方法存在活性物质发现效率低、操作繁琐、样品制备困难、常见化合物重复分离和制备以及评价方法耗时耗力等问题，制约了海洋天然产物中有效成分的快速筛选。因此，发展适用于海洋天然产物活性物质快速发现的新方法势在必行。

aa（arachidonicacid）：花生四烯酸；

aps（aminopropyltrimethoxysilane）：氨丙基三甲基硅烷；

cox（cyclooxygenase）：环氧合酶；

cox-2（cyclooxygenase-2）：环氧合酶2；

dmso（dimethylsulfoxide）：二甲基亚砜；

eic（extractedionchromatography）：提取离子色谱图；

fesem（field-emissionscanningelectronmicroscope）：场发射扫描电子显微镜；

hplc-it-ms（highperfomanceliquidchromatography）：高效液相色谱；

hplc-it-ms（highperfomanceliquidchromatography-iontrap-massspectrometry）：高效液相色谱离子阱质谱法；

lc-ms（liquidchromatography-massspectrometry）液相色谱质谱法；

pbs（phosphatebuffersaline）：磷酸缓冲液；

pgs（prostaglandins）：前列腺素类化合物；

pge2（prostaglandine2）：前列腺素e2。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述技术问题，克服海洋天然产物筛选过程中现有技术存在的缺点和不足，提供一种快速评价天然产物中cox-2酶活性抑制的方法，可用于筛选海洋天然产物提取物具有抗炎抗肿瘤作用的cox-2的亲和抑制剂。

本发明海洋天然产物对cox-2酶体外抑制作用的评价是指海洋天然产物提取物与固定化cox-2酶进行孵化和结合后，酶催化底物aa能力下降，使产物pge2的生成量减少，通过计算pge2的浓度变化来判断海洋天然产物对cox-2酶的抑制率，包括以下步骤：

cox-2酶抑制剂是海洋天然产物提取物；

步骤一：对sio2微球进行活化，并用硅烷偶联剂在微球表面实现氨基化功能基团的修饰。利用表面氨基修饰的aps-si微球作为载体，通过ga交联剂与cox-2酶之间的共价结合作用进行固定化。

步骤二：利用hplc-it-ms联用技术测定固定化cox-2酶的酶活力。

步骤三：以hplc-it-ms联用技术为检测手段建立抑制剂对固定化cox-2酶抑制活性的评价体系。

步骤四：利用步骤三建立的活性抑制评价体系，筛选cox-2的天然产物抑制剂。

步骤五：对天然产物的固定化cox-2酶抑制效果进行评价。

步骤六：对固定化酶在海洋药物复杂体系中的可重复利用性进行考察。

本发明的一种基于固定化酶的快速评价海洋天然产物cox-2酶活性抑制的方法，步骤一中sio2微球的活化试剂为hcl。硅烷偶联剂为aps。

步骤一中固定化方法为ga共价结合固定法。交联剂ga用量为0.013%-0.5%（w/w）。所用cox-2酶为商业购置的人重组蛋白酶，浓度为5-30u。固定化ph为6.0-8.0，固定化温度为10-37℃，固定化时间为4-24h。

步骤二中底物aa浓度为1.5-10mg/l，固定化酶用量为0.4-2u，反应时长为2-50min。

步骤三中采用hplc-it-ms进行检测，以indomethacin和celecoxib作为阳性对照品，以rutin作为阴性对照品验证筛选模型。

步骤四中评价体系应用于海洋天然产物粗提物中进行抑制效果分析，筛选出对cox-2酶有效抑制的海洋生物粗提物。

柄海鞘和黄海葵作为潜在的海洋天然产物对cox-2酶有不同的抑制效果。

固定化酶的制备方法中，cox-2酶通过席夫碱反应以共价键合的形式固定于表面氨基修饰的aps-si微球表面。

本发明的另一个目的是提供用上述方法制备的固定化cox-2酶并运用于潜在抑制剂筛选，通过该方法制备的固定化酶在4℃的保存稳定性较游离酶有很大提高，且通过离心可以快速方便的回收再利用。随后利用固定化cox-2酶对不同的海洋天然产物粗提物进行潜在抑制剂的筛选，并在所建评价体系条件下测试固定化cox-2酶在实际筛选过程中的重复利用性。结果发现，再重复使用5次后，固定化酶仍能保持80%的酶活力。

本发明的有益效果：

（1）固定化cox-2酶的制备方法为席夫碱共价结合法，条件温和，简单有效，采用的载体为表面氨基修饰的aps-si微球，具有很高的潜在研究价值。

（2）固定化酶在海洋生物复杂基质中进行实际样品筛选，重复使用5次仍就能保持80%以上的酶活力，且可以通过离心快速方便的进行回收再利用。

（3）利用固定化cox-2酶对海洋天然产物粗提物进行了潜在抑制剂筛选，发现黄海葵和柄海鞘均与cox-2酶有亲和结合能力，可成为潜在的天然药物来源。

本发明采用共价结合法对cox-2酶进行固定化，通过海洋天然产物中的抗肿瘤活性成分与固定化靶酶cox-2发生特异性亲和抑制的作用，对海洋药物进行活性抑制评价；同时，用阳性药物和阴性药物对评价模型做了验证，最终筛选出柄海鞘和黄海葵提取物与cox-2酶具有亲和抑制作用。该固定化靶酶亲和抑制评价模型可为海洋天然产物中筛选药物先导化合物提供可选择的工具。

附图说明

图1：活化硅胶的fesem照片；

图2：氨基化硅胶的fesem照片；

图3：固定化酶的fesem照片；

图4：固定化酶催化产物pge2的一级质谱图；

图5：固定化酶催化产物pge2的二级质谱图；

图6：pge2子离子333的eic图；

图7：游离酶和固定化cox-2酶酶活对比图；

图8：固定化酶与游离酶储存稳定性对比图；

图9：阳性抑制剂芦丁对固定化cox-2抑制作用效果对比图（虚线为阳性对照、实线为对照品）；

图10：阳性抑制剂塞来昔布对固定化cox-2抑制作用效果对比图（虚线为阳性对照、实线为对照品）；

图11：阳性抑制剂塞来昔布对固定化cox-2抑制作用效果对比图（虚线为阳性对照、实线为对照品）；

图12：海洋天然产物柄海鞘粗提物对cox-2的抑制作用效果对比图（虚线为阳性对照、实线为对照品）；

图13：海洋天然产物黄海葵粗提物对cox-2的抑制作用效果对比图（虚线为阳性对照、实线为对照品）；

图14：复杂体系下实际筛选中固定化酶的重复利用率。

具体实施方式

实施例1表面氨基修饰sio2微球的制备

（1）硅胶的活化：取2.0g硅胶用5%hcl煮沸45min以去除表面吸附的有机物，然后用超纯水清洗干净，于80℃条件下烘干24h。

（2）氨基修饰sio2微球（aps-si）的制备：将0.50g活化sio2载体置于20ml含5%的硅烷化试剂aps的甲苯溶液中，90℃回流24h。将键合了aps的sio2用丙酮洗涤数次以去除未反应的硅烷化试剂，于室温下挥发掉多余丙酮后，置于烘箱中110℃干燥6h，储存备用。

（3）取少量活化sio2、aps-si粉末粘附于样品托上，然后将其置于离子溅射仪中进行镀金处理。镀金结束后，将其转移至fesem样品池内，设置电压为5kv，对样品表面形态特征进行fesem表征，从图1可以看出活化sio2样品表面凹凸不平，而图2键合了aps的sio2表面趋于平整。

实施例2表面氨基修饰的aps-si固定cox-2酶的制备

（1）按照实施例1制备表面氨基修饰的aps-si。

（2）pbs的配制：称取4.56gk2hpo4溶于200ml超纯水中为a液，称取2.72gkh2po4溶于200ml超纯水中为b液，a与b以80.2:19.8的体积比混合既得浓度为0.1mol/l，ph7.4的pbs缓冲液。

（3）精密称取0.050gaps-si置于2.0mlpbs缓冲溶液中使其充分溶胀，然后加入10µl浓度为50%（w/w）的ga溶液，28℃条件下恒温震荡6h，之后用超纯水洗涤，直至清洗液中无ga为止，抽滤至干。在交联后的硅胶载体中加入1mlpbs缓冲液和20ucox-2溶液（20µl），于20℃震荡固定24h，反应完成后依次用3.5%nacl溶液、超纯水和pbs缓冲液分别离心洗涤3次（75sec，1.2×10⁴rpm），并用pbs缓冲液定容至1.0ml于4℃保存备用。

（4）取少量固定化酶粘附于样品托上，然后将其置于离子溅射仪中进行镀金处理。镀金结束后，将其转移至fesem样品池内，设置电压为5kv，对样品表面形态特征进行fesem表征，从图3可以看出键合cox-2酶的硅胶表面出现了片状物质。

实施例3固定化cox-2酶与游离酶活力的测定。

（1）左旋肾上腺素溶液配制：称取一定量的左旋肾上腺素置于棕色容量瓶中，加入tris-hcl后用少量hcl溶解，最后加入tris-hcl至刻度使终浓度为40mmol/l。

血红素溶液配制：称取一定量的血红素置于棕色容量瓶中，加入dmso配制成浓度为1mmol/l的血红素溶液，并用tris-hcl稀释到100μmol/l。

（2）取200µl固定化cox-2酶溶液加入2µl的血红素和10µl的左旋肾上腺素并混匀，在室温下（20℃）温孵2min。之后，将20µlaa加入到缓冲液中使其终浓度为2mg/l，37℃金属浴中反应30min。反应结束后，将溶液离心75sec（1.2×10⁴rpm）后，取上清液于室温静置30min，使pge2充分生成，再用750µl乙酸乙酯萃取两次。固定化酶用0.5mlpbs洗涤离心后（1.2×10⁴rpm，75sec），上清液同样用750µl乙酸乙酯萃取两次并重复洗涤过程一次，合并6次有机相氮吹干，再用100µl甲醇复溶备用。固定化酶的活力（u/g）是指每克载体固定酶以后所具有的活力（以一定量载体固定酶以后，产物pge2的生成量对应的峰面积为参考）取20u（20µl）游离酶，加入180µlpbs，按照固定化酶活力测定方法进行反应，随后用750µl乙酸乙酯萃取两次得到pge2，并氮吹干100µl甲醇复溶，游离酶无需重复洗涤萃取。（3）高效液相色谱质谱分析条件：

hplc分离条件：使用agilentporoshell120c18色谱柱(3.0×100mm，2.7µm，美国agilent公司)；流动相a为超纯水溶液，b为乙腈。二元等度淋洗：0–7min，35%–35%b；停止时间：7min；流速：0.4ml/min；进样体积为10μl；柱温：25℃。

ms检测条件：选用esi离子源，负离子电离模式，雾化气压力为35psi；干燥气（n2）流速为11l/min；干燥气温度为325℃；碰撞电压1.0v。全扫描（scan）m/z范围为100～500，目标离子m/z为351；mrm模式下得到三个子离子分别为m/z270，315和333，并以m/z333为定量离子。

（4）附图4、5、6为产物pge2的一级、二级质谱图和子离子333的提取离子色谱图。pge2在esi^-模式下的一级质谱图示于图4，可以看出pge2在esi^-模式条件下易失去1个h，形成准分子离子[m-h]^–峰（基峰）351，且[m-h]^–峰稳定性较好，一级质谱图上未见明显的碎片峰，因此选择m/z351作为定性离子。在一级质谱分析的基础上，以准分子离子[m-h]^–峰为母离子，对pge2进行了esi–ms²分析，得到m/z271，315和333的子离子峰（见图5）。其中，m/z333为基峰，推测为准分子离子m/z351失去碎片-h2o形成[m-h-18]^–子离子峰，由于m/z333子离子峰丰度高，稳定性好，故选其为定量离子用于pge2定量分析（见图6）。推测m/z315为母离子丢失中性碎片–2h2o形成的[m-h-36]^–子离子峰。而m/z271的子离子峰则是在315基础上再失去碎片-coo形成的子离子峰。

（5）附图7为按照实施例2制备固定化酶后，采用实施例3中酶活测定方法得到的固定化cox-2酶与游离酶酶活力对比图。可以看出，固定化酶的酶活与游离酶的酶活相当，可见固定化未影响到cox-2酶的活力。

实施例4固定化酶储存稳定性研究

（1）按照实施例2制备固定化酶。按照实施例3测定固定化酶酶活力。

（2）将游离和固定化cox-2酶置于pbs中，在4℃冰箱中湿态保存，每隔一段时间测定其活力，整个过程长达40天，结果见附图8。从图8中可以看出，游离酶在前10天就损失了66%的相对活力，并在第20天基本维持这一酶活。固定化酶在前5天的储存中没有明显的损失，到第10天酶活仍旧维持在95%(rsd﹤3.08%,n=3)。随着储存时间的增长，固定化酶的酶活也在逐渐下降。经过了40天的储存过程，固定化酶下降至60%以下。总体而言，固定化酶有较好的储存稳定性，可以保证实验的方便性并降低了实验成本。

实施例5筛选模型的方法专属性研究

（1）按照实施例2制备固定化酶。按照实施例3pge2的分析方法用于方法专属性考察。

（2）取适量celecoxib、indomethacin和rutin标准品，用dmso溶解配制成5mg/ml、10mg/ml和25mg/ml的储备液，使用前用pbs稀释至所需浓度。

（3）取200µl固定化cox-2酶静置后，取出34µl上清液弃掉。在溶液中加入2µl的血红素和10µl的左旋肾上腺素并混匀，在室温下（20℃）温孵2min。随后，在缓冲液中加入2µl抑制剂于37℃金属浴中反应30min，反应过程中每10min摇晃振荡一次。之后，将20µlaa加入到缓冲液中使其终浓度为2mg/l，37℃金属浴中反应30min。反应结束后，将溶液离心75sec（1.2×10⁴rpm）后，取上清液于室温静置30min，使pge2充分生成，再用750µl乙酸乙酯萃取两次。固定化酶用0.5mlpbs洗涤离心后（1.2×10⁴rpm，75sec），上清液同样用750µl乙酸乙酯萃取两次并重复洗涤过程一次，合并6次有机相氮吹干，再用100µl甲醇复溶备用。固定化酶的活力（u/g）是指每克载体固定酶以后所具有的活力（以一定量载体固定酶以后，产物pge2的生成量对应的峰面积为参考）；以最佳条件下的固定化酶的酶活力为100%，其余条件下同样固定化酶量与最佳条件下酶活力之比作为相对酶活力值。样品中pge2的生成量用asample表示。抑制剂实验阳性对照用2µldmso取代抑制剂溶液，其生成pge2的量用apositive表示。空白对照在阳性对照的基础上用未键合cox-2酶的aps-si载体代替固定化酶溶液，其生成pge2的量用ablank表示。抑制剂对固定化cox-2酶抑制率用下式计算：抑制率（%）=（apositive-asample）/（apositive-ablank）。

式中，

apositive：用dmso代替样品溶液时pge2的峰面积，

asample：添加样品溶液时pge2的峰面积，

ablank：未添加样品和酶时pge2的峰面积

所有实验重复三次并计算平均值和标准偏差。

（4）选取对固定化cox-2酶无抑制作用的rutin代替抑制剂celecoxib和indomethacin用于考察方法的专属性。按照cox-2酶活性抑制剂检测方法，以rutin作为抑制剂得到pge2子离子峰m/z333的eic（附图9），与celecoxib（附图10）和indomethacin（附图11）的eic相比较。从图9中可以看出，rutin参与了酶活检测后得到的pge2较阳性对照没有任何变化，说明对固定化cox-2酶没有抑制作用；而从图10和图11中可以看出，加入celecoxib和indomethacin这两种化合物的酶活反应中，m/z333的色谱峰明显低于阳性对照的色谱峰，说明两者均对cox-2酶有明显的抑制作用。

实施例6天然产物粗提物对固定化cox-2酶抑制活性的评价

（1）照实施例2制备固定化酶。按照实施例3pge2的分析方法用于抑制作用评价。按照实施例5进行酶活抑制实验。

（2）柄海鞘和黄海葵样品采回后，清水洗净、晾干表面水分，置于烘箱中55℃鼓风干燥8h，然后置于真空干燥箱中继续55℃干燥8h至干。干燥后的柄海鞘和黄海葵样品于密闭避光处常温贮藏。

（3）将柄海鞘干燥样品切片、粉碎，制备成干粉，并过40目筛，混合均匀后，封装于样品瓶中。准确称取1.00g柄海鞘干粉样品置于100ml具塞锥形瓶中，加入50ml提取溶剂（无水乙醇或超纯水）于60℃水浴提取30min，将提取液转移至离心管中6000rpm离心10min后取出上清液，重复上述提取过程一次并合并两次的提取液。将柄海鞘乙醇提取液旋蒸干后称重，随后加入一定量dmso溶解使其浓度为1mg/ml，并过0.22μm滤膜后作为供试品溶液备用。柄海鞘的水提液-80℃冷冻后放入冻干机中冷冻干燥24h。称取1mg冻干样品置于pe管中，加入1mldmso超声溶解，取上清液过0.22μm微孔滤膜后作为供试品溶液备用。以同样的方法对黄海葵样品的处理。

（4）黄海葵与柄海鞘均对固定化酶有抑制作用，其抑制率计算公式参照实施例5，结果分别为53.57%和34.31%，质谱图如附图12和附图13。

实施例7固定化酶cox-2酶复杂体系中的可重复利用性

（1）照实施例2制备固定化酶。按照实施例3测定固定化酶酶活力。

（2）海洋真菌链格孢菌alternariaalternatastrainbples12(qrf377)的浸膏制备过程如下：取2倍体积的乙酸乙酯对真菌的发酵液进行萃取，移取有机相后再萃取一次，合并萃取液后旋蒸浓缩，并称取浸膏的质量，保存于4℃冰箱中菌液的浸膏使用前用dmso稀释至1mg/ml，过0.22μm微孔滤膜后作为供试品溶液。

（3）以对pge2的生成无影响的qrf377发酵液的提取物作为抑制剂考察固定化cox-2酶在复杂体系中的重复利用性。将1mlpbs加入到固定化cox-2酶离心清洗。然后弃掉上清液在剩余物中加入166µlpbs并再次对固定化酶的活性进行检测。重复上述过程5次，考察固定化酶的重复利用率。结果表明（附图14），qrf377发酵液的提取物对固定化酶的酶活基本没有影响，固定化cox-2酶使用5次后仍有接近80%的酶活力。

实施例仅说明本发明的技术方案，而非对其进行任何限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。