专利名称：一种海洋链霉菌卤化酶基因及其产物，以及其修饰产物的生物合成基因簇的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是海洋链霉菌卤化酶基因及其产物，另外还涉及卤化酶修饰产物的生物合成基因簇。
背景技术：
海洋链霉菌i^treptomyces xinghaiensis)是大连理工大学分离鉴定的一个海洋链霉菌新种(一株具有广谱抗菌活性的海洋链霉菌S187，中国发明专利200710158478. 7)， 该菌种具有良好的抗耐药金黄色葡萄球菌MRSA菌株活性，同时对绿脓假单胞菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌以及白色念珠菌等也具有较好的活性，而其抗绿脓假单胞菌活性在所分离的所有菌株中比较突出。海洋链霉菌的16S rDNA序列与两个亲缘关系较近的标准菌种5 flavofuscus NRRL Β_8036 Π5 albiaxialis DSM 41799τ 同源性分别为 98. 1% 和 97. 5%， 但基因组DNA-DNA杂交分析显示该菌种与两个标准菌种的相关性只有31. 4%和46. 9%。对海洋链霉菌进行深入研究，发现了一个卤化酶基因及其修饰产物的完整基因簇。卤化酶是修饰很多抗生素的重要修饰酶，对很多抗生素的活性具有重要的作用。 由于FAD&依赖型的卤化酶是许多抗生素生物合成基因簇中的后修饰酶，因此编码这类卤化酶的基因序列与多种抗生素的生物合成基因簇偶联。在生物合成的过程中，催化合成反应的中间进行卤代反应，从而对最终产物的生物活性产生影响。利用卤化酶作为新型生物催化剂，可产生新的药物分子用于临床治疗。卤化酶可修饰多种抗生素，包括四环素类，安莎类，β内酰氨类、糖肽类等。其中complestatin (chloropeptin II)是含有卤化修饰结构的一种特殊的糖肽类化合物，与万古霉素、替考拉宁结构不同之处是其不含有糖基，它是由线性非核糖体多肽 (non-ribosomal peptide, NRPQ进一步通过NRPS合成酶进行酚氧化偶联形成的刚性交联结构。早在1980年人们就发现complestatin具有较强的抑制人补体旁路途径的活性。作为人体重要的免疫防御系统之一，补体系统过度激活与类风湿性关节炎等多种疾病相关， 而重症非典型性肺炎(SARS)也和补体系统的过度激活有关，因此开发高效低毒的抗补体药物对于相关疾病的治疗具有重要意义。研究者还发现complestatin具有较强的抑制艾滋病毒HIV-I整合酶的活性。此外，complestatin还可促进纤溶酶原自溶，也可作为阻止缺氧缺血等急性脑损伤造成的兴奋毒性细胞死亡的神经保护分子。由于complestatin的多种独特的生物活性，也吸引着人们进行化学合成研究，但直到2010年才报道了其化学全合成，但化学合成步骤多，难度较大。此外，complestatin溶解性不好，可能也是限制其药物开发的因素，因此其类似物的开发具有重要研究意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种海洋链霉菌卤化酶基因，另外还提供其产物；本发明还提供利用卤化酶基因修饰产物的生物合成基因簇，其基因序列与complestatin的生物合成基因序列具有较高的同源性，但又具有其自身独特的基因组成。本发明公开一种海洋链霉菌卤化酶基因核苷酸序列，其特征为
(a)、含有SEQID NO. 1所示核苷酸序列的核酸；和
(b)、与(a)所述核酸具有至少75%序列相同性、同时保留了卤化酶功能的核酸。本发明一种包括编码基因序列的海洋链霉菌卤化酶蛋白质
(a)、含有SEQID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白质；和
(b)、在(a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有卤化酶功能的由(a)衍生的蛋白质。本发明还公开所获得的海洋链霉菌卤代酶修饰产物基因簇序列，以已及分离获得该序列的方法，包括以下步骤
1)用R)Smid载体构建插入片段约为35-401Λ的海洋链霉菌基因组文库；
2)将所获得的文库转染细菌，平板涂布，经鉴定文库合格后挑取平板上的单克隆于培
养基中培养；
3)提取培养的单克隆的DNA，PCR扩增，并对PCR扩增产物进行检测，获得含有卤代酶基因的阳性克隆；和对该阳性克隆进行测序，获得该卤代酶基因全长以及修饰产物基因簇序列；
4)海洋链霉菌complestatin类似物基因簇功能预测，以及卤化酶修饰产物结构预测 包括非核糖体多肽合成酶蛋白功能域的分析，以及编码complestatin类似物的基因簇测序结果分析。所述分析海洋链霉菌修饰产物基因簇合成产物结构预测的方法，包括 ，1)海洋链霉菌卤化酶测序结果分析；
，2)海洋链霉菌R)Smid文库卤代酶阳性质粒的序列结果分析； ，3)海洋链霉菌非核糖体多肽合成酶进行蛋白功能域的分析； 4)海洋链霉菌中编码卤化酶修饰产物的基因簇测序结果分析。本发明采用建立R)Smid基因组文库的方法，利用卤化酶基因的保守探针进行文库的PCR筛选，获得了新的卤化酶基因。与传统的SuperCos载体相比，Fosmid文库构建时不采用限制性酶切，避免了酶切位点的偏好性，而且其拷贝数低，更具有稳定性。利用PCR 快速筛选R)smid文库，成功获得了卤化酶基因的全长及其所在的基因簇。该基因簇共包括 11个生物合成酶，分别为非核糖体多肽合成酶基因，调节基因和转运蛋白基因等基因具有较高同源性。
图1是显示海洋链霉菌与已知晶体结构的蛋白氨基酸序列的同源比对； 图2是显示海洋链霉菌卤代酶氨基酸序列系统发育树；
图3是海洋链霉菌中complestatin-like化合物基因簇与5 Iavendulae中 complestatin基因簇的对比；
图4是显示海洋链霉菌非核糖体多肽合成酶(NRPS)的结构模块与S. Iavendulae的比对；
图5是显示海洋链霉菌非核糖体多肽合成酶(NRPS) —级结构的预测。 图6是海洋链霉菌卤化酶修饰产物生物合成基因簇的功能注释表。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。本发明将海洋链霉菌的基因组用DNA破碎仪(Hydro-Siear 0703,美国 GeneMachine)将基因组DNA打断，获得主要条带在35 401Λ的片断，使用Klenow片段进行末端补平，并通过酚氯仿抽提乙醇沉淀精制DNA片断，精制后的DNA片段经过脉冲场电泳确认，连入 Copycontrol Fosmid Library Production Kit (Epicentre, USA)提供的 Fosmid 载体。用噬菌体包装蛋白(Copycontrol Fosmid Library Production Kit, Epicentre) 体外包装，转染大肠杆菌EPI300，使用碱裂解法提取DNA，Notl酶切鉴定，脉冲场电泳检测插入片断的长度。判断文库是否合格，从而构建并获得海洋链霉菌基因组文库。使用卤化酶特异性引物对海洋链霉菌基因组文库进行筛选，最终得到13个阳性单克隆，对这13个阳性单克隆的双向进行末端测序，并选择其中一个进行全测序。在对序列结果进行分析后，获得海洋链霉菌卤化酶基因及其修饰的Complestatin类似基因簇。实施例1 海洋链霉菌卤化酶基因的分离，以及其修饰产物基因簇的获得。提取海洋链霉菌基因组DNA
用TBS培养基(以g/L计，胰蛋白胨17，大豆蛋白胨3，氯化钠3，葡萄糖2. 5，磷酸氢二钾2.5，pH 7. 5)在观°〇，150印111中培养48小时。收集放线菌菌体细胞IOml以上，将菌体细胞重悬于5ml SET缓冲液，加入适量0. Imm的玻璃珠进行漩涡震荡。用Iml 20mg/ml 的溶菌酶，37°C消化2h以上，再加入500 μ 15mg/ml的蛋白酶K，37°C反应30min。之后加入1/10体积的20%SDS溶液，55°C反应lh。用1/3体积的5 M NaCl溶液，室温反应30 min，然后加入1 1体积比的饱和酚/氯仿，混勻后置于室温反应30min。以8000 r/min 4°C离心20min，弃蛋白沉淀，并向上清其中加入等体积的异丙醇，室温放置30min。用枪头或毛细管将析出的DNA绕出，并以70%乙醇洗涤DNA数次。最后将乙醇挥发干，将得到的 DNA溶于ddH20中。海洋链霉菌卤代酶基因序列的获得
由于海洋链霉菌基因组中的编码卤化酶的基因簇序列未知，所以尝试用兼并引物调取基因，在NCBI美国国家生物信息中心搜索已发布的放线菌卤化酶的氨基酸序列，利用 Clustal W软件进行同源比对。根据比对结果，在这一类卤代酶的两个保守区，即FAD结合位点(GGGXXG)和色氨酸残基结合位点(GWTWXIP)的位置上，利用在线C0DEH0P引物设计软件 http://bioinfo. weizmann. ac. il/blocks/codehop. html 上，设计简并弓|物。表1扩增海洋链霉菌卤代酶基因所用的CODEHOP简并引物
权利要求
1.一种海洋链霉菌卤化酶基因核苷酸序列，其特征是(a)、含有SEQID NO. 1所示核苷酸序列的核酸；和(b)、与(a)所述核酸具有至少75%序列相同性、同时保留了卤化酶功能的核酸。
2.一种包括编码基因序列的海洋链霉菌卤化酶蛋白质，其特征是(a)、含有SEQID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白质；和(b)、在(a)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有卤化酶功能的由(a)衍生的蛋白质。
3.获得海洋链霉菌卤代酶基因全长以及其修饰产物基因簇序列的方法，其特征是包括以下步骤用R)smid载体构建插入片段约为35-401Λ的海洋链霉菌基因组文库； 将所获得的文库转染细菌，平板涂布，经鉴定文库合格后挑取平板上的单克隆于培养基中培养；提取培养的单克隆的DNA，PCR扩增，并对PCR扩增产物进行检测，获得含有卤代酶基因的阳性克隆；和对该阳性克隆进行测序，获得该卤代酶基因全长以及修饰产物基因簇序列；海洋链霉菌complestatin类似物基因簇功能预测，以及卤化酶修饰产物结构预测包括非核糖体多肽合成酶蛋白功能域的分析，以及编码complestatin类似物的基因簇测序结果分析。
4.根据权利要求3所述的获得海洋链霉菌卤代酶基因全长以及其修饰产物基因簇序列方法，其特征是，包括海洋链霉菌卤化酶测序结果分析； 海洋链霉菌i^osmid文库卤代酶阳性质粒的序列结果分析； 海洋链霉菌非核糖体多肽合成酶进行蛋白功能域的分析； 海洋链霉菌中编码卤化酶修饰产物的基因簇测序结果分析。
5.海洋链霉菌中编码卤化酶修饰产物的基因簇，其特征为(a)、含有SEQID NO. 2所示核苷酸序列的核酸；和(b)、与(a)所述核酸具有至少75%序列相同性、同时保留了合成类似结构化合物的核酸。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域。本发明公开一种海洋链霉菌卤化酶基因核苷酸序列，其特征为(a)含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的核酸和SEQ ID NO.2所示氨基酸序列；和(b)与(a)所述核酸具有至少75％序列相同性、同时保留了卤化酶功能的核酸。本发明采用建立Fosmid基因组文库的方法，利用卤化酶基因的保守探针进行文库的PCR筛选，获得了新的卤化酶基因。与传统的SuperCos载体相比，Fosmid文库构建时不采用限制性酶切，避免了酶切位点的偏好性，而且其拷贝数低，更具有稳定性。利用PCR快速筛选Fosmid文库，成功获得了卤化酶基因的全长及其所在的基因簇。该基因簇共包括11个蛋白合成基因，其序列分别与非核糖体多肽合成酶基因，调节基因和转运蛋白基因等基因具有较高同源性。
文档编号C12N15/52GK102533800SQ20111033307
公开日2012年7月4日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者杨天虹, 王玉梅, 赵心清, 陈亮宇 申请人:大连理工大学